En oversikt over den protokoll er presentert i figur 1.. Molecular Biology En. Konstruer Design Bruk Gene Komponist programvare for å designe protein konstruere og kodon utviklet syntetiske gensekvenser. Bruken av Gene Komponist programvare har blitt tilbudt i detalj andre steder tre. Bruk Justering Viewer Module og Konstruer Design Module å sammenligne protein sekvens justeringer og definere protein konstruksjon. Juster målaminosyresekvensen for både den primære og 3D strukturelle elementer fra homologer i Protein Data-banken (PDB), hvis tilgjengelig (figur 2). Bruk justering informasjon for å ta struktur-guidede konstruere design ved å velge nye termini basert på bevaring av den primære struktur og 3D strukturer av homologene. Design insert PCR (IPCR) og vektor PCR (vPCR) amplimers (terminal primere). Ved hjelp av Gene Composer er protein-til-DNA-algoritmen, tilbake-oversette konstruktet aminosyresekvens inn i kodon konstruert nukleinsyresekvens. Bruk riktig kodon bruk tabellen (CUT) for å optimalisere sekvens for uttrykk i E. coli. Nesten klone setter inn pET28 vektor endret for å innlemme en N-terminal 6x Histidine tag og Smt3/SUMO fusion protein som gir enkel rensing. Plasser syntetisk gen orden med DNA 2,0 og bestille primere fra Integrated DNA Technologies. 2. Polymerase Ufullstendig Primer Extension (PIPE) Cloning Forbered Grunning og Genes Sentrifuger levert av leverandør plater som inneholder primere på 1000 rpm i 1 min. Bring primer konsentrasjonen til 100 mM og tilsett 50 pl TE-buffer. Fortynn primere til 10 uM med deionisert (DI) vann i en 96-brønn v-bunn-plate. Sentrifuger leverandørverktøy genet i en 1,5 ml tube på 1300 rpm i 1 min. <li> Ved hjelp av TE-buffer, bringe DNA-konsentrasjon av hvert rør til 50 ng / mL. I 1,5 ml rør, gjør fortynninger av hver primer til 10 ng / mL. Oppbevar primere og gener ved -20 ° C når den ikke er i bruk. Forbered Sett PCR (IPCR) Tine en ampulle med PFU Master Mix på is, hold gener og primere ved romtemperatur. Lag en plate map overdragende brønner til et sett med primere og konstruere. Legg 13 mL DI vann inn i hver brønn i en 96-brønners PCR-plate. Tilsett 5 ul av forover og 5 ul av revers primer for hver reaksjon i 96-brønns plate i henhold til platen kartet, og sikrer til å endre tips mellom hver brønn. Tilsett 2 mL av hver fulle lengde gen til dens passende vel i henhold til platen kartet. Tilsett 25 pl av PFU konsentrat-blanding til hver brønn, og sikrer til å endre tips mellom hver brønn. Syklus reaksjonene ved hjelp av følgende PCR-forhold: 95 ° C 2 min </li> 95 ° C 30 sek 50 ° C 45 sek 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Gjenta trinn bd i 25 sykluser. Overfør 10 ul av hver IPCR reaksjon på en ny 96-brønners PCR-plate. Tilsett 3 mL av 6X belastning fargestoff til hver prøve. Separer hver prøve på en 1% TAE EtBr agarose gel ved 110 V ved siden av en 100-500 bps DNA stigen for å bekrefte fragment forsterkning. Butikken IPCR produkt ved -20 ° C når den ikke er i bruk (unngå fryse tine så mye som mulig). 3. Forbered Vector PCR (vPCR) Begynn natten kultur av transformert E. coli med pET28 vektor plasmid. Vaksinere to 5 ml rør med to-YT kokes med 50 mikrogram / ml kanamycin. Grow kulturer over natten ved 37 ° C i shaker på 220 rpm. Spinn ned kulturer etter vekst over natten ved sentrifugering ved 3000 rpm i 15 min. Bruk en Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit for å trekke pET28 vektor fra bakterie pellets i henhold til produsentens instruksjoner. Oppsett restriksjonsenzymseter digestions av utvunnet pET28 plasmid. Legg 2,2 mL av 10X BamHI-buffer og 1 ul av BamHI og Hindlll for å 20fil pET28 vektor. Inkuber reaksjon i 1 time ved 37 ° C. Separat fordøyelsen produktet på en gel. Se trinn 2.2.10. Skjær vektor band fra gel og rense den ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Ved hjelp av en NanoDrop, kvantifisere DNA konsentrasjon. Fortynne kutte vektor til 10 ng / mL. Oppbevares ved -20 ° C når den ikke er i bruk. Forbered vPCR primere. Sentrifuger IDT levert oligonucliotides i 1 min ved 1300 rpm. Bringe konsentrasjonen til 100 mM med DI vann. Forbered 10 mikrometer fortynning av både forover og bakover primere i en 1,5 ml tube. Oppbevar primere og primer fortynninger ved -20 ° C. Tine PFU Master Mix på is og tine mal og primere ved romtemperatur. Oppsett vPCR reaksjoner i en 96-brønners PCR plate: I den første raden i en 96-brønners plate kombinere 60 pl av både forover og bakover vPCR primere og 24 ul av fordøyd pET28 mal (10 ng / mL). Ved hjelp av en 12-tip flerkanalspipette, overføre 12 ul av tennsatsen og malen konsentrat-blanding, til de gjenværende brønn av platen. Dette skal resultere i 12 pl primer og mal konsentrat-blanding i hver brønn på platen. Legg 13 mL DI vann til hver brønn. Tilsett 25 mL av PFU Master Mix til hver brønn. Syklus reaksjonene gjennom PCR betingelser brukes i trinn 2.2.7. Pool alle de vPCR reaksjoner i en 15 ml Falcon rør. Bekreft fragment forsterkning ved å skille 10 ul samlet PCR produktet på en gel (forventet lengde på fordøyd pET28 vektorer ca 6 kb). Se trinn 2.2.10. Forbered fusjonere plater. Delmengde 3 mL av vPCR produkt i hver brønn av en 96-brønn v-bunn-plate. Oppbevar plater ved -20 ° C inntil fusjonerer med IPCR produktet. 4. Flett IPCR og vPCR Products Tine IPCR produkter og pre-alikvoteres vPCR 96-vel flette plate ved romtemperatur. Tilsett 3 mL av hver IPCR produkt til dets respektive brønn av flettingen plate. Transformere fusjonere plate i Top Ten kjemisk kompetente celler. Tilsett 2 mL av hver flette reaksjon i en enkelt 50 mL rør fra leverandøren kjemisk kompetente celler og fortsette med produsentens følger protokoll. Forbered overnattingsturer kulturer for hver konstruksjon fra transformasjon plate. Delmengde 5 ml TB-buljong (med 50 pg / ml kanamycin) fra et 25 ml sterilt reservoar inn i hver brønn i en dyp brønn-blokken. Ved hjelp av sterilele teknikk, plukke en isolert koloni fra hver transformasjon plate og inokuler passende brønnen av dyp brønn blokken. Dekk blokken med en Airpore dekselet. Rist blokk ved 220 rpm ved 37 ° C over natten. Pellet cellene ved sentrifugering av blokken i 30 min ved 4000 rpm. Hell av supernatanten og pat toppen av blokken tørt med et papirhåndkle. Mini-prep ved hjelp av en Qiagen 96-brønns vakuum anordningen i samsvar med produsentens instruksjoner. 5. Forbereder glyserol aksjer av klonet konstruerer Transform klonet sekvens validert DNA i BL21 (DE3) kjemisk kompetente celler i henhold til produsentens instruksjoner. For hvert konstrukt, velg en enkelt isolert koloni fra BL21 (DE3) transformasjon og inokulere inn i 1 ml av 2-YT-buljong (med 50 pg / ml kanamycin). Rist kulturer ved 220 rpm i 3-4 timer ved 37 ° C. Merke en 1,5 mlskruehette tube med den unike konstruksjonen identifikasjonsnummer, cellestamme, og dato. Tilsett 500 ul av 50% glycerol og 500 ul celle-kultur og invertere flere ganger. Umiddelbart glyserol lagre lager på tørris eller i en -80 ° C fryser. 6. Expression Testing Lysis Buffe r Vask Buffer Elueringsbuffer 50 mM NaH 2 4 PO, 8,0 pH 300 mM NaCl 10 mM Imidazole 1% Tween 20. 2 mM MgCl2 0,1 mL / ml Benzonase 1 mg / ml Lysozym 50 mM NaH 2 4 PO, 8,0 pH 300 mM NaCl 20 mM Imidazole 0,05% Tween 20 25 mM Tris, 8,0 pH 300 mM NaCl 250 mM Imidazole 0,05% Tween 20 * Legg Benzonase, lysozym,og proteasehemmer umiddelbart før lysis. Streak en prøve fra glyserol lager på kanamycin selektiv agar og inkuberes over natten ved 37 ° C. Start en ikke-induserende pre-kultur i en 96-brønns rundbunnet blokk; inokulere 1,2 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) supplementert med 0,5% glukose med en fersk vokst E. coli isolere. Vokse over natten rysting ved 220 rpm ved 37 ° C. Etter overnatter vekst, starte induksjon kulturer ved inoculating 1,2 ml TB kjøttkraft (med 50 mg / ml kanamycin) supplert med Novagen Overnight Express System 1 (i henhold til produsentens protokoll) med 40 pl av den pre-kulturen. Vokse småskala induksjon kulturer ved 20 ° C i 48 timer, rist ved 220 rpm. Høst celler ved sentrifugering ved 4000 rpm i 15 minutter, hell av supernatanten og lagres ved -20 ° C i minst 1 time før behandling. I den 96-brønns blokk, resuspender cellen pellets i 300 pl lysebuffer. </li> Inkuber cellene i lysis buffer ved romtemperatur i 30 min etterfulgt av mekanisk lysis ved kraftig risting i 30 min ved romtemperatur. Tydeliggjøre det rå lysatet ved sentrifugering i 30 min ved 4000 rpm ved 4 ° C. Bruke en flerkanals pipette for å overføre 200 ul av det klarede lysat (løselig fraksjon) til en 96-brønns flatbunnet skuff (Qiagen). For hver brønn inneholder en prøve, legger 40 mL Ni-NTA magnetiske kuler (Qiagen). Beveg lett platen på en vippe i 1 time ved 16 ° C. Sett platen på en magnetisk innlegg plate (Qiagen) og fjern ubundet fraksjon. Vær nøye med å ikke pipetteres ut noen av Ni-NTA perler. Fjern platen fra stillingen plate og forsiktig resuspendert perlene i 200 ul vaskebuffer. Pipette opp og ned i 30 sek og deretter plassere platen tilbake på innlegget plate. Fjern vaskebufferen og gjentar trinn 6.12. Fjern plate fra post plate og Eluer Ni-NTA bundet target protein ved å vaske med 50 ul elueringsbuffer i 5 min. Returner flat bunnplate for å magnetiske stolpe plate og overføre elueringen til en frisk 96-brønners V-bunn-plate. Overfør 20 ul av eluering til en frisk 96-brønners V-bunn-plate og reagere med 1 ul ULP1 protease. Ifølge produsentens protokoll, analysere eluerte og eluerte + Ulp1 brøkdel av kapillær elektroforese med en LabChip 90. Alternativt kan alle fraksjoner fra uttrykket testing bli analysert via SDS-PAGE. 7. Large Scale gjæring Bruk av en steril pipette til å skaffe en skrape fra et lager glyserol, inokulere 100 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) og vokse over natten. Rist ved 220 rpm og 37 ° C. Etter overnatter vekst, utvide pre-kultur ved inoculating en L av TB kjøttkraft med EMD autoinduksjonen løsninger (se produsentens protokoll) (med 50 mg / ml kanamycin) i en 2 L forbløffet kolbe med 10 ml avpre-kultur (1:100 fortynning). Rist de utvidede en L kulturer ved 37 ° C, forandre temperaturen på rysteinkubator til 20 ° C ved en optisk densitet på 0,6 (OD 600) er nådd. Etter overnatter vekst, ta en representant 10 ml mengde fra hver konstruksjon for uttrykk testing. Innhøsting celle lim ved sentrifugering ved 5000 rpm i 15 min og kast supernatanten. Freeze celle lim ved -80 ° C. Proteinrensing Buffere: Lysebuffer Buffer A (Ekvilibrering) Buffer B (Elueringen) Dimensjonering kolonne Buffer 25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 0,5% Glycerol 0,02% CHAPS 10 mM Imidazole 1 mM TCEP 50 mM Arginin 5 ul Benzonase 100 mg Lysozyme 3 proteaseinhibitor tabletter (EDTA-free) 25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 10 mM Imidazole 1 mM TCEP 50 mM Arginin 0,25% Glyserol 25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 200 mM Imidazole 1 mM TCEP 25 mM Tris, 8,0 pH 200 mM NaCl 1% glycerol 1 mM TCEP * Legg Benzonase, lysozym, og proteasehemmer tabletter til hver 150 ml prøve umiddelbart før lysis. 8. Cellelysis Gjør 2 l lysis buffer, ikke tilsett lysozym, proteasehemmer tabletter eller benzonase (hver prøve vil bli lysert separat i 150 ml lysis buffer). Tine og resuspender celle lim i lysis buffer på en 1:05 masse: volum ratio med kraftig omrøring i 30 min ved 4 ° C. Bryt biter løs fra sidene av beger med en ren spatel. I løpet av denne tidsperioden forberede Ni og dialysis buffere På is, lysere cellene ved hjelp av en Misonix sonicator (70% effekt, 2 sek på / 1 sekund av pulser for 3 min) og forsiktig virvel container for å hindre overoppheting. Lagre en liten (200 ul) aliquot av rått lysat for fremtidig analyse. Tydeliggjøre det rå lysatet ved sentrifugering ved 18.000 xg i 35 min ved 4 ° C, samle supernatanten og lagre et lite (200 ul) alikvot for fremtidig analyse. Lagres pellet ved 4 ° C inntil det er bekreftet at proteinet har blitt lysert i den oppløselige fraksjonen. 9. Pre-run Protein Maker Setup Med protein maker slått på og programvaren åpne, initialisere instrumentet. Når initialisert, og fest én 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nikkel-chelate kolonne (Ni kolonne) på en egen linje i gantry for hver av prøvene. Løpe 3-4 kolonnevolumer (CV) av likevektsbufferen gjennom hver kolonne. Prime likevekt og elueringsbuffer linjer. Equilibrspiste kolonnene ved å aspirere buffer A gjennom kolonnen gang. 10. Nikkel 1 (Ni1) Column Vask hver kolonne med 20 ml Milli-Q vann for å fjerne lagring buffer. Løpe 5 ml buffer B og 25 ml buffer A for ekvilibrering. Laste det klarede lysat inneholdende solubilisert protein i kolonnene med en hastighet på 2 ml / min og deretter følge av en 15 ml vask med buffer A. Eluere det bundne protein i en trinn-gradient med buffere A og B ved følgende forholdstall med respekt: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Samle hver eluering brøkdel separat. Analyser: eluerte fraksjoner, råolje lysate, avklart lysate og gjennomstrømning av SDS-PAGE. Pool fraksjonene inneholdende proteinet og bruke en NanoDrop å måle en 280 til omtrent bestemme mengden av protein til stede. 11. ULP1 Kløv Hold en liten porsjon (250 ul) av Ni1 kolonne bassenget for påfølgende gel analyse. Ta med restenav Ni1 basseng til 10 ml og tilsett ubiquitin-lignende protease 1 (ULP1) på en ul / 5 mg total protein for å fjerne Hans-SMT affinitet tag. Dialyser den Ni1 basseng + ULP1 mot 2 l buffer A i 4 timer ved 4 ° C i 10 kDa molekylvekt cutoff (MWCO) på en røre plate ved 4 ° C. Etter dialyse, kjøre SDS-PAGE av Ni1 basseng og Ni1 pool + ULP1 å avgjøre om ULP1 cleavage var vellykket. 12. Nikkel 2 (Ni2) Column Load kløyvde proteinet over samme Ni-kolonnen og gjenta trinn 9.3 ved en redusert strømningshastighet på 1 ml / min. Den kløyvde off tag vil binde seg til kolonnen og tagless målprotein vil nå strømme gjennom. Samle gjennomstrømning i en fersk container. Vask Ni kolonne med 3 ml buffer A, etterfulgt av 5 ml buffer B for å eluere alt His-merkede og ikke-spesifikt bundet protein. Samle hver fraksjon for seg. Kjør SDS-PAGE av Ni2 gjennomstrømning, vaske og Ni2 eluering fraksjoner å verifisere ULP1 cleavage og at protein er til stede i gjennomstrømning. Bruk en NanoDrop å måle A 280 til omtrent bestemme tilstedeværelsen av protein. 13. Konsentrerer Konsentrer den Ni2 gjennomstrømning (og Ni2 eluering hvis proteinet er til stede) til 5 ml med en Amicon ultra 10 kDa MWCO sentrifugerør. Spinn i 10 min intervaller på 4000 rpm ved 4 ° C. Bland med en pipette mellom hvert spinn for å hindre protein fra over-konsentrere seg langs membranen. 14. Størrelse-utelukkelse kromatografi (SEC) Sett opp en Sephacryl ® S-100 10/30 GL-kolonne (GE Healthcare) ved ekvilibrering med 200 ml SEC-buffer ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min på en AKTApurifier system (GE Healthcare). Forbered 10 ml superloops for bruk på SEC kolonne i henhold til produsentens instruksjoner. Ved hjelp av en 5 ml sprøyte, legger prøvene på superloops og begynne SEC løp. Overvåke UV-absorbans spor på 280 nm mens samle lite volum frhandlinger. Kjør SEC fraksjoner via SDS-PAGE. Pool SEC fraksjoner som viser de høyeste intensitet band. Konsentrer sammenslåtte SEC fraksjoner. Se trinn 13.1. Delmengde protein i 100 ul prøver, flash fryse i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C. KRYSTALLISASJON 15. Protein Krystalliseringstetting Pre-fylle hver reservoar av en 96-brønn Compact Jr krystallisering plate (Emerald Bio) med 80 pl av krystallisering skjermen (Emerald Bio) av valget. Fortynn protein med dimensjonering buffer til 2-20 mg / ml og oppbevares på is. Tilsett 0,4 mL av protein og 0,4 mL av krystallisering skjermen i hver av 96-brønner og dekk med krystallklar forsegling tape (Manco). Oppbevar platen ved 16 ° C mens du sjekker for protein krystallisering jevne mellomrom i løpet av de neste ukene under en dissekere mikroskop. 16. Crystal Harvesting </ P> Opprett en kryobeskytter fra moderluten og etylenglykol. Skjær klar tape som dekker brønnen med målproteinet krystall. Til en tom brønn, tilsett 1,6 pl av den tilsvarende krystallinske tilstand og kombinere med 0,4 pl av etylenglykol som gir en endelig konsentrasjon på 20% etylenglykol og 80% krystalliserende tilstand. Merk: For å optimalisere krystall diffraksjon prøve forskjellige cryoprotectants som: glyserol, oljer, lav MW polyetylenglykoler, og / eller med varierende prosentandeler av kryobeskyttende. Før høsting kjøle ned en ALS-stil pucken i en dewar fylt med flytende nitrogen og dekk med lokk. Høste krystall ved å plassere en CryoLoop med indre diameter som passer til størrelsen på krystall på en Magnetic Crystal Wand (Hampton Research) og kaprer den direkte fra brønnen løsning. Umiddelbart dyppe CryoLoop med høstes krystall i den cryoprotectant deretter senk i ALS-stil puck å blinke fryse crystal. Gjenta for et ønsket antall krystaller. 17. Crystal Screening / datainnsamling Når høsting er ferdig bruke en puck tryllestaven for å plassere den magnetiske cryo pucken lokket på ALS pucken. Med bøyde tang, vipper pucken opp ned. Overfør pucken til en Rigaku ACTOR dewar, skru en Puck Pusher på pucken, og punch av lokket forlate det i dewar med pinner med forsiden opp. Ved hjelp JDirector programvare, skjermen hver krystall under følgende parametere: bjelke slit satt til 0,5 grader, detektor avstand satt til 50 mm, bilde steg til 70 grader, og eksponering lengde satt til 30 sek. Kjør Mosflm på test bildene du har tatt med JDirector å finne ut hva den beste krystall og strategi er for datainnsamling. Samle en komplett datasett basert på resultatene fra Mosflm. 18. Data Processing / Struktur Fastsettelse Kjør XDS / XScale 4 å behandle datasettet. Åpne CCP4 suite programvare. Kjør Phaser 5 for å beregne en molekylær erstatning løsning ved hjelp av en høy homologi søk modell, når det er tilgjengelig. I dette tilfellet brukte vi PDBID 3CW4 som et søk modell seks. Kjør Refmac 7 for å avgrense molekylær modell mot den observerte refleksjon samles i datasettet. Endelig vedtak bør være basert off av den høyeste skall og bestemmes ut fra følgende parametere: R faktor> 50%, I / sigma> 2, og fullstendighet> 90%. Bygge en 3-dimensjonal elektrontetthet modellen med molekylær grafikk programvare Kvakk åtte. Før deponering strukturen i PDB validere den med MolProbity 9 programvare for å kontrollere at kvaliteten på struktur er egnet for deponering.