Summary
يمكن أن تتأثر الحيوي من المصفوفة خارج الخلية الغضروفية غضروفية من قبل تطبيق محفزات الميكانيكية. يصف هذا الأسلوب أسلوب تطبيق سلالات الضغط الديناميكي للغضروفية مغلفة في بنيات 3D وتقييم التغيرات في التمثيل الغذائي الناجمة عن خلية غضروفية.
Abstract
الغضروف المفصلي يعاني من قدرة محدودة إصلاح عندما تضررت من إهانة أو الميكانيكية التي تدهورت بفعل المرض، مثل هشاشة العظام. لمعالجة هذا النقص، وقد وضعت العديد من التدخلات الطبية. أسلوب واحد من هذا القبيل هو لتطفو على السطح المنطقة المتضررة مع الأنسجة المهندسة الغضروف، إلا أن الأنسجة المهندسة تفتقر عادة خصائص البيوكيميائية ومتانة الغضروف الأصلي، والتشكيك في البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. وهذا يحد من تطبيق هندسة الأنسجة الغضروف لإصلاح العيوب الصغيرة الاتصال، والاعتماد على الأنسجة المحيطة بها لحماية المواد مزروع. لتحسين خصائص الأنسجة المتقدمة، والتحفيز الميكانيكي هو وسيلة شعبية تستخدم لتعزيز توليف المصفوفة خارج الخلية الغضروفية وكذلك خصائص الميكانيكية الناتجة من الأنسجة المهندسة. التحفيز الميكانيكي ينطبق قوات إلى الأنسجة يبني مماثلة لتلك الخبرة في الجسم الحي. هذاويستند على أساس أن البيئة الميكانيكية، في جزء منه، ينظم تطوير وصيانة الأنسجة 1،2 الأصلية. الشكل الأكثر شيوعا من تطبيق التحفيز الميكانيكية في هندسة الأنسجة الحيوية ضغط الغضروف هو فيزيولوجي في سلالات من حوالي 5-20٪ على تردد 1 هرتز 1،3. العديد من الدراسات التي بحثت في الآثار المترتبة على دينامية وضغط أظهرت أن يكون لها تأثير إيجابي على التمثيل الغذائي والحيوي خلية غضروفية، مما يؤثر في نهاية المطاف على الخصائص الفنية لل4-8 الأنسجة المتقدمة. في هذه الورقة، ونحن توضيح طريقة لتحفيز ميكانيكيا يبني هيدروجيل خلية غضروفية-الاغاروز تحت ضغط دينامية وتحليل التغيرات في التركيب الحيوي من خلال فحوصات الكيمياء الحيوية والنظائر المشعة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الأسلوب بسهولة لتقييم أي تغييرات محتملة في الاستجابة الناجمة الخلوية نتيجة للمؤثرات الميكانيكية.
Protocol
1. عزل غضروفية مفصلي الابتدائية
الحصاد 10-15 الغضروف سمك شرائح كاملة من السطوح المفصلية للمفاصل الحيوان (مثل المشط المشتركة-السلامية من الأبقار الناضجين هيكليا تم الحصول عليها من abbatoir المحلية).
- شرائح الغضروف مكان في صحن بتري 100 ملم واحتضان في 20 مل من 0.5٪ في البروتيني للحم الخنزير F-12 (W / V) لمدة 2 ساعة في 37 ° C. شطف ثلاث مرات في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12، واحتضان مع 20 مل من كولاجيناز 0.15٪ A في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- تصفية التعليق الخلية من خلال مرشح شبكة الشاشة 200 في طبق نظيف. غسل تصفية مع 5 مل من لهام F-12 وإضافة إلى الطبق. نقل الخلايا إلى التعليق أنبوب 50 مل المخروطية. غسل طبق بتري مع 10 مل من لهام F-12 وإضافة إلى أنبوب مخروطي الشكل.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 600-800 لمدة 6-8 دقيقة إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة الغرفة.
- نضح طاف، وضمان عدم تعكير صفو اله الخلية بيليه في 40 مل وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 إعادة تعليق.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 600-800 إطار التعاون الإقليمي لمدة 6-8 دقيقة.
- كرر الخطوات من 1.4 و 1.5 ضعف ليصبح المجموع 3 مرات. قبل الطرد المركزي للمرة الثالثة، وإعادة تعليق بيليه عن طريق التحريض والحصول على 500 ميكرولتر قسامة لفرز الخلايا.
- عد خلايا قابلة للحياة باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق 9 مع عدادة الكريات ومجهر مقلوب ضوء.
- نضح طاف وإعادة تعليق بيليه في حجم وسائل الإعلام F-12 هام لمضاعفة كثافة البذر المطلوب (على سبيل المثال 20 × 10 6 خلية / مل لتركيز النهائي من 10 × 10 6 خلية / مل بعد التغليف).
2. خلية غضروفية-الاغاروز هيدروجيل تغليف
- الحرارة 0،8 نوع تعقيمها ز السابع الاغاروز في 20 مل من 1X PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) على طبق ساخن تعيين إلى 120 درجة مئوية حتى يذوب. حل مرة واحدة، وانخفاض الحرارة إلى 60 ° C وارتفاع درجات الحرارة فيلل تؤثر بقاء الخلية.
- في أنبوب 50 مل المخروطية، مزيج دقيق أحجام متساوية لتعليق الخلية مع التركيز ضعف المطلوب من الاغاروز (على سبيل المثال التعليق الاغاروز 4٪ لهيدروجيل النهائي الاغاروز 2٪). تجنب خلق فقاعات كبيرة لأنها يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية وبناء الحياة التعب.
- بعناية قسامة 10 مل من الخليط خلية غضروفية-الاغاروز في طبق بتري قطرها 60 مم، مع تجنب خلق فقاعات كبيرة.
- اسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تبلور.
- الحصول على ما يصل عينات هيدروجيل خلية غضروفية-الاغاروز حسب الحاجة (20-30 عادة) باستخدام لكمة خزعة 4 مم.
- قياس وتسجيل الأبعاد المادية (قطر والارتفاع) من عينات تمثيلية باستخدام ميكرومتر. يجب أن تكون بنيات حوالي 5 ملم في الطول، وتجاهل أي عينات تم الحصول عليها من منطقة حيث التباين ارتفاع العينة كان أكبر من 2٪.
- نقل العينات إلى 60 مم الطازجة طبق بتري والملحقمع 10 مل من وسائل الاعلام متكامل (مثال: 20٪ مصل بقري جنيني في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 مع 20 HEPES مم، 100 ميكروغرام حامض الاسكوربيك / مل، والمضادات الحيوية 2X / antimycotics).
3. تحفيز الميكانيكية وRadiolabelling من خلية غضروفية-الاغاروز الهلاميات المائية
- الأوتوكلاف المكونات المعدنية للتلاعب الضغط. تعقيم المكونات البلاستيكية مع الايثانول 70٪ (بين عشية وضحاها) وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية (ما لا يقل عن 15 دقيقة).
- للحفاظ على ثوابت من السقوط، وذلك باستخدام ملقط، مكان 12 حلقات بلاستيكية معقمة الاحتفاظ (مع القطر الداخلي أكبر من قطر بناء) (ن = 6، والعينات والضوابط) داخل آبار لوحة الثقافة 24 أيضا.
- باستخدام ملقط، بعناية نقل الهلاميات المائية خلية غضروفية-الاغاروز من طبق بتري إلى لوحة 24 أيضا، وتأمين كل واحد في حلقة الاحتفاظ.
- نقل 400 ميكرولتر من وسائل الاعلام متكامل (مثال: 20٪ FBS في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 مع 20 HEPES مم، 100 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك، و2X المضادات الحيوية / antimycotics) لكل عينة أيضا.
- تجميع تلاعب ضغط تعقيم (الشكل 1) وتأمين محدلات مع مجموعة البراغي. إرفاق تلاعب ضغط على لوحة الثقافة 24 أيضا.
- إطلاق سراح وإعادة تأمين، مجموعة براغي لإنشاء الصوانى-هيدروجيل الاتصال (صفر دولة سلالة).
- تحميل تلاعب ضغط تجميعها في A-1 ماخ نظام اختبار الميكرو ميكانيكية. آمنة تلاعب لمرحلة الرأسي عن طريق دبوس تحديد مكان وقفل في مكان مع مجموعة المسمار. إزالة رقصة التباعد.
- تحميل تطبيق الضغط الديناميكي في السعة المطلوبة (على سبيل المثال 10٪ السعة سلالة استنادا إلى الارتفاع الأصلي للعينات)، التردد (على سبيل المثال 1 هرتز) ومدتها أو عدد من الدورات (على سبيل المثال فترات زمنية تصل إلى 60 دقيقة).
- عند الانتهاء من التحفيز الميكانيكي، يستعاض عن رقصة التباعد، وتخفيف مجموعة دبوس مكان المسمار وإزالة الضغط وتلاعب لوحة الثقافة من-1 ماخ نظام اختبار الميكرو ميكانيكية. Radiolabel الخلايا هيدروجيل من خلال استكمال البنى وسائل الإعلام مع 5 μCi من النظائر المطلوبة (على سبيل المثال [3 H] التسمية البروتين البرولين لتخليق الكولاجين خلية غضروفية محددة و[35 S] الكبريت لتخليق بروتيوغليكان).
- احتضان لمدة 24 يبني رديولبلد ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 10.
- حصاد يبني هيدروجيل رديولبلد وشطف 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X (درجة الحموضة 7.4) لإزالة أي النظائر غير مدمج. عينات باستخدام غراء دايجست (40 ميكروغرام / مل في 20 ملي خلات الأمونيوم، 1 ملم حمض ethyldiaminetetraacetic و 2 dithiothreitol ملم على 65 درجة مئوية لمدة 72 ساعة).
- فحص DNA خلاصة للمحتوى باستخدام مقايسة صبغ PicoGreen 11 و أدرجت النشاط النظائر، إلى المضمون تطبيع DNA، بواسطة β-التلألؤ السائل عد 12،13 الهضم غراء التالية مباشرة.
ملاحظة: شراء والتخلص من المواد المشعة (النظائر النفايات والمواديجب أن ربما يكون قد حان في المواد المشعة الاتصال) اتباع المؤسسية ذات الصلة (و / أو الحكومية) السياسات والإجراءات لأمان المناولة والتخلص من المواد المشعة.
4. ممثل النتائج
وحفز ميكانيكيا البقري المفصلية الغضروفية-الاغاروز يبني الهلاميات المائية (2٪ الاغاروز مع 10 × 6 خلايا 10 / خلايا مغلفة مل) على اتساع سلالة الضغط 10٪ على تردد 1 هرتز لمدة 20 إلى 60 دقيقة (أو دورات 1200 إلى 3،600 ) ويعاير لمحتوى DNA خارج الخلية وتخليق مصفوفة من التأسيس النظائر المشعة. وتأثر الحمض النووي خارج الخلية وتخليق مصفوفة بطريقة تعتمد على الجرعة. عرض محتوى DNA انخفاض ملحوظ بنسبة 35٪ نتيجة ل20 أو 30 دقيقة من التحفيز (P <0.01)، في حين 60 دقيقة من التحفيز عرض أي تأثير (الشكل 2). الغضروف محددة توليف الكولاجين وبروتيوغليكان (التي يحددها [H 3]-البرولين و عرضت [35 S] الكبريت التأسيس، على التوالي) زيادات كبيرة ما يقرب من 60٪ ردا على 20 أو 30 دقيقة من الاستثارة (P <0.01)، مع 60 دقيقة من التحفيز واظهار أي تأثير ملحوظ (الشكل 3).
انفجرت رأي يظهر المكونات الفردية: الشكل 1 تخطيطي للتلاعب مبنية خصيصا ضغط دينامية لحفز خلية غضروفية-الاغاروز يبني من الزمن:. تلاعب تجميعها الحق.
الهلاميات المائية حفز ميكانيكيا الشكل 2. التغييرات في محتوى DNA من خلية غضروفية-الاغاروز تحت الضغط سلالة السعة 10٪ في 1 هرتز لمدة 20 إلى 60 دقيقة (يعني ± SEM، ن = 6/group).
her.within صفحة = "دائما"> 
الهلاميات المائية حفز ميكانيكيا الشكل 3. التغييرات في تركيب المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين وبروتيوغليكان) من الاغاروز-خلية غضروفية أقل من 10٪ في السعة سلالة الضغط 1 هرتز لمدة 20 إلى 60 دقيقة (يعني ± SEM، ن = 6/group).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموضحة لتطبيق محفزات الميكانيكية للرقابة إلى الهلاميات المائية الاغاروز الخلية المصنف يسمح للتحقيق مباشرة في تأثيرات القوى الديناميكية الضغط على عملية التمثيل الغذائي خلية غضروفية. شريطة أن يكون استخدام للتلاعب مخصص لاختبار بالتزامن مع الاحتفاظ الخواتم القيد الوحشي للبنيات لتجنب المشاكل المحتملة من تحول العينة. استخدام محدلات التحميل القتلى مرجح مضمونة أطقم مجموعات يضمن اتصال مباشر مع يبني على الرغم من الاختلافات المحتملة في ارتفاع العينة. Radiolabeling بعد التحفيز لقياس الحيوي الخلوي يقلل من احتمالات التلوث، والسماح لاختبار واحد تلاعب لاستخدامها لتطبيقات متعددة من المحفزات الميكانيكية الحيوية. ويمكن هذا الأسلوب تكيف بسهولة مع دراسة تأثير مختلف وسائط التحميل الميكانيكية (1،4 القص على سبيل المثال، التوتر 1،2) أو لتوضيح مسارات محددة mechanotransduction المسؤولة.
ove_content "> النتائج يتضح أن ممثل كمية صغيرة من موت الخلايا ما يقرب من 35٪ يمكن أن تحدث نتيجة لتطبيق التحفيز الحيوي، مع أطول تطبيقات التحفيز الميكانيكي لا تؤثر الخلوية بناء 15-17. البناء الحيوي من الجزيئات المصفوفة خارج الخلية، التي تحددها إدراج النظائر المشعة، ويتضح استجابة لضغط تعتمد مدة الحيوية. تطبيقات التحميل الضغط الديناميكي لفترة من 20 إلى 30 دقيقة أسفرت عن استجابة المنشطة القصوى مع فترات أطول للحصول تظهر تأثير الحساسية للمؤثرات الميكانيكية المفروضة. الحساسية الخلوية للالميكانيكية وقد لوحظ سابقا التحميل 1،2،5،13، ولكن كان هناك القليل التحقيق في توصيف طبيعة الوقت تعتمد على هذه الظاهرة، ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد الظروف المثلى لتحقيق أقصى قدر من التحفيز تراكم مصفوفة خارج الخلية مع بناء undeص المتكررة، أو طويلة الأجل، وتطبيقات التحفيز الميكانيكي.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
