Summary
Биосинтез внеклеточного матрикса хрящевой хондроцитами могут быть затронуты применением механических раздражителей. Этот метод описывает технику применения динамической деформации сжатия в хондроциты заключены в 3D конструкций и оценки изменений, вызванных в метаболизм хондроцитов.
Abstract
Суставной хрящ страдает от ограниченной возможности ремонта при повреждении механических оскорбление или деградировали от болезней, таких как остеоартрит. Чтобы исправить этот недостаток, несколько медицинских вмешательств были разработаны. Одним из таких методов является выплывут поврежденную область с тканевой инженерии хряща, однако, инженерные ткани обычно не хватает биохимические свойства и долговечность родной хряща, ставят под сомнение его долгосрочной жизнеспособности. Это ограничивает применение хряща тканевой инженерии для ремонта небольших дефектов координационные, опираясь на окружающие ткани для защиты имплантированных материалов. Для улучшения свойств разработанных тканей, механическое раздражение это популярный метод используется для повышения синтеза хрящевой внеклеточного матрикса, а также результирующий механических свойств инженерии тканей. Механическое раздражение распространяется силы на ткани строит аналогичные тем, которые имели в естественных условиях. Этооснован на предпосылке, что механические окружающей среды, в частности, регулирует развитие и поддержание родной 1,2 ткань. Наиболее часто применяются формы механического раздражения в тканевой инженерии хряща динамического сжатия при физиологических штаммов примерно 5-20% на частоте 1 Гц 1,3. Несколько исследований изучали эффекты динамического сжатия и показали, что это оказывает положительное влияние на метаболизм хондроцитов и биосинтеза, в конечном счете, влияет на функциональные свойства разработанных тканей 4-8. В этой статье мы проиллюстрируем метод механической стимуляции хондроцитов-агарозы конструкций гидрогеля при динамическом сжатии и анализировать изменения в биосинтезе путем биохимического и радиоизотопного анализа. Этот метод также может быть легко модифицирован для оценки любых потенциально индуцированные изменения в клеточной реакции в результате механических раздражителей.
Protocol
1. Изоляция первичной суставные хондроциты
Урожай 10-15 полном кусочки хряща толщиной от суставных поверхностей суставов животных (например, пястных, фаланг стыке скелет взрослых коров получено от местных abbatoir).
- Место хряща ломтики в 100 мм чашки Петри и инкубируют в 20 мл 0,5% протеазы в Хэма F-12 (вес / объем) в течение 2 часов при температуре 37 ° C. Промойте три раза в F-12 средств массовой информации Хэма культуры и инкубировать 20 мл 0,15% коллагеназы в F-12 культура Хэма средств массовой информации в течение ночи при 37 ° C.
- Фильтр клеточной суспензии через сито 200 меш фильтр в чистом блюде. Промойте фильтр с 5 мл Хэма F-12 и добавить в блюдо. Передача клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку. Промойте чашки Петри с 10 мл Хэма F-12 и добавить в конической трубе.
- Центрифуги трубы на 600-800 RCF в течение 6-8 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатанта, обеспечивая, чтобы не нарушить йэлектронной осадок клеток и повторно приостанавливать в 40 мл F-12 средств массовой информации Хэма культуры.
- Центрифуги трубы на 600-800 RCF в течение 6-8 мин.
- Повторите шаги 1,4 и 1,5 раза больше в общей сложности 3 раза. До центрифугирования в третий раз, ресуспендируют осадок с помощью агитации и получить 500 мкл аликвоты для подсчета клеток.
- Граф жизнеспособных клеток с использованием трипанового синего методом исключения 9 с гемацитометре и инвертированного микроскопа свет.
- Аспирируйте супернатант и вновь приостановить гранул в объеме F-12 средств массовой информации Хэма в два раза желаемого плотность посева (например, 20 х 10 6 клеток / мл для конечной концентрации 10 х 10 6 клеток / мл, после инкапсуляции).
2. Хондроцитов-агарозы Гидрогель Encapsulation
- Тепло 0,8 г автоклавного типа VII агарозы в 20 мл стерильной 1x PBS (рН 7,4), на горячей плите установлена в 120 ° С до полного растворения. После растворения, уменьшите огонь до 60 ° С, как более высокие температуры Вильл влияют на жизнеспособность клеток.
- В 50 мл коническую трубку, тщательно смешать равные объемы суспензии клеток с двойным нужной концентрации агарозы (например, 4% агарозном подвески для окончательного 2% гидрогеля агарозы). Избегайте создания крупных пузырьков, как они могут повлиять на жизнеспособность клеток и построить усталости.
- Осторожно аликвоты 10 мл хондроцитов-агарозы смеси в 60 мм диаметром блюдо Петри, избегая при этом создания больших пузырей.
- Дайте постоять 30 минут при комнатной температуре, пока гель.
- Получить столько хондроцитов-агарозы образцов гидрогеля по мере необходимости (обычно 20-30) с использованием 4 мм биопсии удар.
- Измерьте и запишите физические размеры (диаметр и высота) представитель образцов с помощью микрометра. Конструкции должны быть примерно 5 мм в высоту, отказаться от любых образцов, полученных из региона, где дисперсия высоты образца было больше, чем на 2%.
- Передача образцов новой 60 мм чашку Петри и дополнения10 мл полной среды (например, 20% эмбриональной телячьей сыворотки в F-12 средств массовой информации Хэма культуры с 20 мМ HEPES, 100 мкг / мл аскорбиновой кислоты, антибиотики и 2x / антимикотиков).
3. Механическое раздражение и радиоактивной хондроцитов-агарозы Гидрогели
- Автоклав металлических компонентов сжатия буровой установки. Стерилизовать пластиковых компонентов с 70% этанола (в течение ночи) и УФ свете (по крайней мере, 15 мин).
- Чтобы сохранить конструкций от падения, используя щипцы, место 12 стерильные пластиковые стопорные кольца (с внутренним диаметром больше, чем диаметр конструкции) (п = 6, образцов и контролей) в лунки 24-луночных культуры пластины.
- Использование щипцов, тщательно передать хондроцитов-агарозы гидрогелей из чашки Петри в 24-луночный планшет, обеспечение каждого в стопорного кольца.
- Передача 400 мкл полной среды (например, 20% FBS в F-12 культура Хэма СМИ с 20 мМ HEPES, 100 мкг / мл аскорбиновой кислоты, а также2x антибиотиков / антимикотиков) в каждую лунку для проб.
- Соберите стерилизованные сжатия установка (рис. 1) и закрепить плиты с набором винтов. Прикрепить сжатия установки в 24-и культуру пластину.
- Отпустите и снова обеспечить набор винтов установить плиту-гидрогелевые контактные (ноль деформированного состояния).
- Загрузите собраны сжатия установки в Mach-1 Микромеханическая тестирования системы. Безопасная установка в вертикальное этапе через штифт и закрепите на месте с установочным винтом. Удалить расстояние джигу.
- Применение динамической нагрузки при сжатии желаемой амплитуды (например, 10% амплитуды деформации на основе оригинальной высоты образца), частота (например, 1 Гц) и длительности или количества циклов (например, временные интервалы до 60 минут).
- После завершения механической стимуляции, заменить интервал джиг, ослабьте фиксирующий штифт контактный Установка и удаление буровой установки сжатия и культуру пластину с Mach-1 Микромеханическая тестирования системы. Радиоактивной клетки-гидрогеля конструкции, дополняя СМИ с 5 мкКи целевого изотопа (например, [3 H]-пролина белка метки для хондроцитов конкретных синтез коллагена и [35 S]-серы для синтеза протеогликанов).
- Инкубируйте меченых конструкций в течение 24 ч при температуре 37 ° C, 5% CO 2 10.
- Урожай меченых конструкций гидрогеля и промыть 3 раза в 1x PBS (рН 7,4) для удаления неинкорпорированных изотопов. Дайджест образцов с использованием папаин (40 мкг / мл в 20 мМ ацетата аммония, 1 мМ ethyldiaminetetraacetic кислоты и 2 мМ ДТТ при 65 ° С в течение 72 ч).
- Анализ дайджест для содержания ДНК с помощью анализа PicoGreen красителя 11 и объединенной изотопа деятельности, нормированная на содержание ДНК, по β-жидкостного сцинтилляционного подсчета 12,13 сразу после папаин пищеварения.
Примечание: покупка и захоронения радиоактивных материалов (отходов изотопов и элементов, которые могут вступать в контакт радиоактивных материалов) должны следовать соответствующие институциональные (и / или государственные) политику и процедуры по безопасному обращению и захоронению радиоактивных веществ.
4. Представитель Результаты
Бычий суставных хондроцитов-агарозы гидрогелей конструкций (2% агарозном с 10 х 10 6 клеток / мл инкапсулированные клетки) были механически стимулированных при амплитуде 10% деформации сжатия при частоте 1 Гц от 20 до 60 мин (или 1200 до 3600 циклов ) и анализировали на содержание ДНК и синтеза внеклеточной матрицы радиоизотопных регистрации. ДНК и синтеза внеклеточной матрицы была затронута в зависимости от дозы. Содержание ДНК наблюдалось значительное снижение на 35% в результате 20 или 30 минут стимуляции (р <0,01), в то время как 60 мин стимуляции проявили никакого эффекта (рис. 2). Хрящ конкретных синтез коллагена и протеогликанов (определяется [3 H]-пролина и[35 S]-серой регистрации, соответственно) выставлены значительный рост примерно на 60% в связи с 20 или 30 минут стимуляции (р <0,01), при этом 60 мин стимуляции выставке не наблюдается эффекта (рис. 3).
На рис. 1 Схема заказ динамической установки сжатия для стимуляции хондроцитов-агарозы конструкций. Слева: установка собрана. Справа: в разобранном виде показывать отдельные компоненты.
Рисунок 2. Изменения в содержании ДНК хондроцитов-агарозы гидрогелей механически стимулированных при 10% сжатии амплитуды деформации на 1 Гц от 20 до 60 мин (среднее значение ± SEM, n = 6/group).
Рисунок 3. Изменения в синтезе внеклеточной матрицы (коллагена и протеогликанов) хондроцитов-агарозы гидрогелей механически стимулированных при 10% сжатии амплитуды деформации на 1 Гц от 20 до 60 мин (среднее значение ± SEM, n = 6/group).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный способ применения управляемых механических раздражителей на мобильный семенами агарозном гидрогелей позволяет прямое расследование эффекты динамического сжимающих сил на метаболизм хондроцитов. Использование пользовательского тестирования установки в сочетании с сохранением кольца при условии бокового ограничения для конструкций, чтобы избежать потенциальных проблем образца чаевые. Использование мертвых взвешенной загрузки плит обеспеченных множества экипажей обеспечивает прямой контакт с конструкциями, несмотря на возможные различия в образце высоте. Радиоактивной метки после стимуляции для измерения сотовой биосинтеза снижает возможность загрязнения, что позволяет одной буровой тестирования, которые будут использоваться для многократного применения динамических механических раздражителей. Этот метод может быть легко адаптирована для изучения влияния различных режимов механической нагрузки (например, 1,4 сдвига, напряжение 1,2) или выяснения конкретных путей, механотрансдукции ответственность.
ove_content "> Представитель результатов показал, что небольшое количество клеточной гибели примерно на 35% может произойти за счет применения динамической стимуляции, с более длинными применения механического раздражения не влияет на конструкцию клеточности 15-17. биосинтез внеклеточных макромолекул матрицы, определяемые радиоизотопных регистрации, показана зависимость длительности ответа на динамическое сжатие. Применение динамического сжатия загрузки на срок от 20 до 30 мин в результате максимальный анаболический отклик с более длительные появляются, чтобы вызвать эффект десенсибилизации к навязанной механические раздражители. Сотовый десенсибилизации к механическим Загрузка было отмечено ранее 1,2,5,13, но было мало расследование характеристика зависит от времени природа этого явления. Эта информация может быть использована для определения оптимальных условий стимуляции, чтобы максимизировать накопление внеклеточного матрикса с Построим недеформированнойГ повторяются, или долгосрочные, применение механической стимуляции.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
