A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cartilagem articular sofre de uma capacidade limitada de reparação quando danificadas por insulto mecânico ou degradada pela doença, tais como a osteoartrite. Para sanar esta deficiência, várias intervenções médicas têm sido desenvolvidos. Um tal método é a ressurgir a área danificada com o tecido de cartilagem artificial, no entanto, a engenharia de tecidos tipicamente não tem as propriedades bioquímicas e durabilidade da cartilagem nativa, questionar a sua sobrevivência a longo prazo. Isto limita a aplicação de engenharia de tecidos de cartilagem para a reparação de pequenos defeitos focais, baseando-se o tecido circundante para proteger o material implantado. Para melhorar as propriedades do tecido desenvolvido, estimulação mecânica é um método popular utilizado para aumentar a síntese de matriz extracelular cartilaginosa, assim como as propriedades mecânicas dos resultantes da engenharia de tecidos. Estimulação mecânica aplica forças ao tecido constrói análoga àquelas experimentadas in vivo. Estebaseia-se na premissa de que o ambiente mecânico, em parte, regula o desenvolvimento e manutenção de 1,2 tecido nativo. A forma mais vulgarmente aplicado de estimulação mecânica na engenharia de tecidos de cartilagem é de compressão dinâmica em estirpes fisiológicas de aproximadamente 5-20%, com uma frequência de 1 Hz 1,3. Vários estudos investigaram os efeitos de compressão dinâmica e têm mostrado que para ter um efeito positivo sobre o metabolismo dos condrócitos e a biossíntese, em última análise afectar as propriedades funcionais do tecido desenvolvido 4-8. Neste artigo, vamos ilustrar o método para estimular mecanicamente construções condrócitos-agarose hidrogel sob compressão dinâmica e analisar as alterações na biossíntese através de testes bioquímicos e radioisótopo. Este método também pode ser facilmente modificado para avaliar as alterações potencialmente induzidos em resposta celular, como resultado de estímulos mecânicos.
Protocolo
1. Isolamento de condrócitos articulares primárias
Colheita 10-15 fatias de cartilagem de espessura completa das superfícies articulares das articulações de animais (por exemplo, a articulação metacarpo-falângica de vacas com esqueleto maduro obtido a partir de um matadouro local).
- Coloque fatias de cartilagem em uma placa de Petri de 100 mm e Incubar em 20 ml de 0,5% de protease em Ham F-12 (w / v) durante 2 horas a 37 ° C. Enxaguar três vezes em meio de Ham F-12 de cultura, e incuba-se com 20 ml de colagenase a 0,15% em meio A de Ham F-12 de cultura durante a noite a 37 ° C.
- Filtra-se a suspensão de células....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O método descrito para a aplicação de estímulos mecânicos controlados de hidrogéis de agarose de células-seeded permite a investigação directa sobre os efeitos de forças de compressão dinâmica sobre o metabolismo dos condrócitos. A utilização do equipamento de teste de costume em conjunto com os anéis de retenção fornecido restrição lateral para as construções, para evitar potenciais problemas de amostra de inflexão. O uso de placas mortos ponderados carregamento garantidos pelas tripulações conjuntos garante o co.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente ou do equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Ham F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| A colagenase | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Soro Fetal Bovino | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbato | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibióticos / antimicóticos | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan azul | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Brilhante-Line Hemocitômetro | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papaína a partir do látex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Acetato de amónio | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ácido Ethyldiaminetetraacetic | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Ditiotreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Baixo ponto de fusão de agarose, Tipo VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Tela de malha (200) Filtrar | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Tester micromecânico | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Carregando compressão Jig | Custom-built | Produto similar pode ser fornecida por Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Placa Cultura Bem | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] prolina | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Enxofre | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
Referências
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
