Summary
A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.
Abstract
A cartilagem articular sofre de uma capacidade limitada de reparação quando danificadas por insulto mecânico ou degradada pela doença, tais como a osteoartrite. Para sanar esta deficiência, várias intervenções médicas têm sido desenvolvidos. Um tal método é a ressurgir a área danificada com o tecido de cartilagem artificial, no entanto, a engenharia de tecidos tipicamente não tem as propriedades bioquímicas e durabilidade da cartilagem nativa, questionar a sua sobrevivência a longo prazo. Isto limita a aplicação de engenharia de tecidos de cartilagem para a reparação de pequenos defeitos focais, baseando-se o tecido circundante para proteger o material implantado. Para melhorar as propriedades do tecido desenvolvido, estimulação mecânica é um método popular utilizado para aumentar a síntese de matriz extracelular cartilaginosa, assim como as propriedades mecânicas dos resultantes da engenharia de tecidos. Estimulação mecânica aplica forças ao tecido constrói análoga àquelas experimentadas in vivo. Estebaseia-se na premissa de que o ambiente mecânico, em parte, regula o desenvolvimento e manutenção de 1,2 tecido nativo. A forma mais vulgarmente aplicado de estimulação mecânica na engenharia de tecidos de cartilagem é de compressão dinâmica em estirpes fisiológicas de aproximadamente 5-20%, com uma frequência de 1 Hz 1,3. Vários estudos investigaram os efeitos de compressão dinâmica e têm mostrado que para ter um efeito positivo sobre o metabolismo dos condrócitos e a biossíntese, em última análise afectar as propriedades funcionais do tecido desenvolvido 4-8. Neste artigo, vamos ilustrar o método para estimular mecanicamente construções condrócitos-agarose hidrogel sob compressão dinâmica e analisar as alterações na biossíntese através de testes bioquímicos e radioisótopo. Este método também pode ser facilmente modificado para avaliar as alterações potencialmente induzidos em resposta celular, como resultado de estímulos mecânicos.
Protocol
1. Isolamento de condrócitos articulares primárias
Colheita 10-15 fatias de cartilagem de espessura completa das superfícies articulares das articulações de animais (por exemplo, a articulação metacarpo-falângica de vacas com esqueleto maduro obtido a partir de um matadouro local).
- Coloque fatias de cartilagem em uma placa de Petri de 100 mm e Incubar em 20 ml de 0,5% de protease em Ham F-12 (w / v) durante 2 horas a 37 ° C. Enxaguar três vezes em meio de Ham F-12 de cultura, e incuba-se com 20 ml de colagenase a 0,15% em meio A de Ham F-12 de cultura durante a noite a 37 ° C.
- Filtra-se a suspensão de células através de um filtro de tela de 200 mesh para uma placa limpa. Lavar o filtro com 5 ml de Ham F-12 e adicionar ao prato. Transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 50 ml. Lava-se a placa de Petri com 10 mL de Ham F-12 e adicionar ao tubo cónico.
- Centrifugar o tubo de 600-800 rcf durante 6-8 minutos à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante, garantindo a não perturbar the sedimento de células e re-suspensão em 40 ml de meio de Ham F-12 de cultura.
- Centrifugar o tubo de 600-800 rcf durante 6-8 min.
- Repita os passos 1.4 e 1.5 vezes mais para um total de 3 vezes. Antes da centrifugação, pela terceira vez, ressuspender o sedimento através da agitação e da obtenção de uma alíquota de 500 ul para a contagem de células.
- Contar as células viáveis utilizando o método de exclusão de azul de Tripan 9 com um hemacitómetro e um microscópio óptico invertido.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um volume de F-12 de Ham meios para dobrar a densidade de sementeira desejada (por exemplo, 20 x 10 6 células / ml, para uma concentração final de 10 x 10 6 células / ml, após o encapsulamento).
2. Condrócitos-agarose Encapsulation Hydrogel
- Aquecer 0,8 g Tipo VII autoclavado agarose em 20 ml de solução estéril 1x PBS (pH 7,4) numa placa quente a 120 ° C até à dissolução. Uma vez dissolvido, reduzir o calor a 60 ° C como temperaturas mais elevadas will afetar a viabilidade celular.
- Num tubo cónico de 50 ml, misturar cuidadosamente volumes iguais da suspensão de células com o dobro da concentração desejada de agarose (por exemplo, 4% de suspensão de agarose para um final de hidrogel de agarose 2%). Evitar a criação de bolhas grandes, pois podem afectar a viabilidade celular e construir a resistência à fadiga.
- Cuidadosamente uma alíquota de 10 ml da mistura de condrócitos-agarose em um prato de 60 milímetros de diâmetro Petri, evitando a criação de bolhas grandes.
- Deixar repousar durante 30 min à temperatura ambiente até que gelificou.
- Obter o maior número de amostras de hidrogel de agarose-condrócito conforme necessário (tipicamente 20-30) utilizando um perfurador de biópsia 4 milímetros.
- Medir e registrar as dimensões físicas (diâmetro e altura) de amostras representativas, utilizando um micrômetro. Construtos deve ser aproximadamente de 5 mm de altura, descartar quaisquer amostras obtidas a partir de uma região na qual a variação de altura da amostra foi superior a 2%.
- Transferir as amostras para um prato 60 milímetros fresco Petri e suplementocom 10 ml de meio completo (por exemplo, 20% de soro fetal bovino em meio de Ham F-12 de cultura com 20 mM de HEPES, 100 mg de ácido ascórbico / ml, e antibióticos / antimicóticos 2x).
3. A estimulação mecânica e marcação radioactiva de condrócitos-agarose Hidrogéis
- Autoclavar os componentes metálicos do equipamento de compressão. Esterilizar os componentes de plástico com 70% de etanol (durante a noite) e luz ultravioleta (por, pelo menos, 15 min).
- Para manter as construções de cair, utilizando fórceps, o local 12 anéis de plástico estéreis de retenção (com um diâmetro interior maior do que o diâmetro do construto) (n = 6, as amostras e controlos), dentro dos poços de uma placa de cultura de 24 cavidades.
- Usando fórceps, transferir cuidadosamente os hidrogéis de condrócitos-agarose a partir de uma placa de Petri para a placa de 24 poços, assegurando cada uma em um anel de retenção.
- Transferir 400 uL de meio completo (por exemplo, 20% de FBS em meio de Ham F-12 de cultura com 20 mM de HEPES, 100 ug / ml de ácido ascórbico, e2x antibiótico / antimicótico) a cada poço de amostra.
- Monte o equipamento de compressão esterilizada (Figura 1) e fixe as placas com parafusos. Anexar o equipamento de compressão na placa de cultura de 24 cavidades.
- Solte e re-assegurar os parafusos de ajuste para estabelecer cilindro hidrogel contato (zero estado de tensão).
- Carregar o equipamento de compressão montados em um sistema de testes de Mach-1 micromecânico. Plataforma segura para a fase vertical via pino de localização e bloqueio no local com parafuso de fixação. Remova o gabarito de espaçamento.
- Aplicar carga de compressão dinâmica da amplitude desejada (por exemplo, amplitude de deformação de 10% com base na altura original das amostras), a frequência (por exemplo, 1 Hz) e duração ou quantidade de ciclos (por exemplo, intervalos de tempo de até 60 min.)
- Após a conclusão da estimulação mecânica, substituir o dispositivo de montagem de espaçamento, soltar o parafuso de fixação do pino de localização e remover o equipamento de compressão e a partir da placa de cultura de Teste do Sistema de Mach-1 micromecânico. Radiomarcador célula-hidrogel construções, completando os meios de comunicação com 5 uCi de isótopo desejado (por exemplo, [3 H]-prolina etiqueta proteína por condrócitos específicos de síntese de colagénio e [35S]-enxofre para a síntese de proteoglicanos).
- Incubar as construções marcadas radioactivamente, durante 24 horas a 37 ° C, 5% CO 2, 10.
- Colheita das construções de hidrogel radiomarcados e lavar 3 vezes em 1x PBS (pH 7,4) para remover qualquer isótopo não incorporado. Digest amostras utilizando papaína (40 ug / ml em acetato de amónio 20 mM, 1 mM de ácido ethyldiaminetetraacetic e 2 mM de ditiotreitol a 65 ° C durante 72 horas).
- Ensaio de digest para o conteúdo de ADN, utilizando o ensaio de PicoGreen corante 11 e incorporou actividade isótopo, normalizados para o conteúdo de ADN, por β-líquido de cintilação de contagem 12,13 digestão com papaína imediatamente a seguir.
Nota: A compra e descarte de materiais radioativos (isótopos de resíduos e itensque possam ter estado em contacto materiais radioativos) devem seguir o institucional relevante (e / ou governamentais) políticas e procedimentos para o manuseio e eliminação de substâncias radioactivas.
4. Resultados representativos
Bovina articulares construções condrócitos-agarose hidrogéis (2% de agarose com 10 x 10 6 células / ml, as células encapsuladas) foram estimulados mecanicamente a uma amplitude de 10% de deformação à compressão a uma frequência de 1 Hz por 20 a 60 minutos (ou 1200 a 3600 ciclos ) e ensaiadas para teor de ADN e síntese de matriz extracelular, por incorporação de radioisótopos. DNA e síntese de matriz extracelular foi afetado de maneira dose-dependente. O conteúdo de DNA apresentaram uma redução significativa de 35% como resultado de 20 ou 30 minutos de estimulação (p <0,01), enquanto 60 minutos de estimulação não exibiu qualquer efeito (Figura 2). Cartilagem específica a síntese do colagénio e proteoglicanos (determinado por [3H]-prolina e[35S]-incorporação de enxofre, respectivamente) exibiram aumentos significativos de cerca de 60% em resposta a 20 ou 30 minutos de estimulação (p <0,01), com 60 minutos de estimulação que não apresente efeito observável (Figura 3).
. Figura 1 Esquema do equipamento de compactação de custom-built dinâmica para estimular condrócitos-agarose construções esquerda:. Plataforma Montada direita:. Vista explodida mostrando componentes individuais.
Figura 2. Alterações no conteúdo de ADN de condrócitos-agarose hidrogéis estimulada mecanicamente sob uma amplitude de deformação de compressão a 10% a 1 Hz durante 20 a 60 min (média ± SEM, n = 6/grupo).
Figura 3. Alterações na síntese da matriz extracelular (colagénio e proteoglicanos) de condrócito-agarose hidrogéis mecanicamente estimulados sob amplitude de deformação à compressão a 10% a 1 Hz durante 20 a 60 min (média ± SEM, n = 6/grupo).
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Discussion
O método descrito para a aplicação de estímulos mecânicos controlados de hidrogéis de agarose de células-seeded permite a investigação directa sobre os efeitos de forças de compressão dinâmica sobre o metabolismo dos condrócitos. A utilização do equipamento de teste de costume em conjunto com os anéis de retenção fornecido restrição lateral para as construções, para evitar potenciais problemas de amostra de inflexão. O uso de placas mortos ponderados carregamento garantidos pelas tripulações conjuntos garante o contato direto com as construções, apesar de diferenças de potencial de altura amostra. A radiomarcação de pós-estimulação para medir a biossíntese celular reduz o potencial de contaminação, o que permite um equipamento de teste único para ser utilizado em várias aplicações dinâmicas de estímulos mecânicos. Este método pode ser facilmente adaptado para investigar o efeito de diferentes modos de carregamento mecânico (por exemplo 1,4 de cisalhamento, a tensão a 1,2) ou para elucidar vias mecanotransdução específico responsável.
ove_content "> Os resultados representativos ilustrados que uma pequena quantidade de morte celular de aproximadamente 35% pode ocorrer devido à aplicação de estimulação dinâmico, com aplicações mais longos de estimulação mecânica não afectando celularidade construto 15-17. Biossíntese de macromoléculas da matriz extracelular, determinada pela incorporação de radioisótopos, ilustrada uma resposta dependente da duração de compressão dinâmica. Aplicações da carga de compressão dinâmica por um período de 20 a 30 minutos resultou em uma resposta máxima anabólico com durações mais longas constantes para obter um efeito de dessensibilização aos estímulos mecânicos impostos. dessensibilização Cellular para mecânica carregamento tenha sido observado anteriormente 1,2,5,13, mas tem havido pouca investigação para caracterização da natureza dependente do tempo deste fenómeno. Esta informação pode ser utilizada para determinar as condições óptimas de estimulação para maximizar a acumulação de matriz extracelular com o construir under repetido, ou a longo prazo, as aplicações de estimulação mecânica.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
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