Summary
软骨细胞的软骨细胞外基质的生物合成的，可以通过施加机械刺激的影响。该方法描述了技术应用动态压缩应变包埋软骨细胞的三维结构和诱导软骨细胞代谢的变化的评价。
Abstract
机械侮辱或退化性疾病，如骨关节炎关节软骨受到损坏时，从有限的修复能力。为了弥补这方面的不足，一些医疗干预措施已经制定出来。一种方法是复出与组织工程化软骨的受损区域，然而，组织工程通常缺乏本地软骨的生化特性和耐用性，质疑它的长期生存能力。这限制了小灶缺陷修复软骨组织工程的应用，依靠对周围组织的保护植入材料。为了改善性能的发达的组织，机械性刺激是一种流行的方法，利用增强软骨细胞外基质的合成，以及所得的机械性能的组织工程。机械性刺激，适用于力量的组织构造类似于那些有经验的体内 。这是基于的前提是机械的环境中，在某种程度上，调节的开发和维护的固有组织1,2。在软骨组织工程的机械性刺激中最常采用的形式是在生理菌株在1,3 1赫兹的频率的约5-20％的动态压缩。一些研究调查的影响，动态压缩，并已显示出它有一个积极的影响软骨细胞的代谢和生物合成，最终影响功能特性的开发组织4-8。在本文中，我们说明了该方法机械地刺激软骨细胞琼脂糖凝胶结构下的动态压缩和生物合成的变化进行分析，通过生化和放射性同位素检测。此方法也可以很容易地修改，作为一个结果，机械刺激，以评估任何可能引起的变化在细胞反应。
Protocol
1。主要关节软骨细胞的分离
收获10-15全层动物关节的关节面的软骨片，从（ 如掌趾关节，骨骼发育成熟的奶牛从本地屠宰场获得）。
- 将软骨片在100毫米的陪替氏培养皿和孵育在20毫升0.5％的蛋白酶的Ham F-12（w / v的）为2小时，在37℃下冲洗三次火腿的F-12培养基中，并用20毫升0.15％胶原酶孵育A的Ham氏F-12培养基中过夜，在37℃下
- 过滤细胞悬浮液通过200目筛网过滤器到一个干净的菜。清洗过滤器，用5毫升联队的F-12和添加的菜。细胞悬浮液转移到50ml的锥形管中。洗净用10ml的Ham F-12的陪替氏培养皿中，并加至锥形管。
- 离心管中于600-800相对离心力在室温下6-8分钟。
- 吸取上清液，确保不打扰次E细胞沉淀和重新悬浮在40毫升的Ham氏F-12培养基。
- 离心管在600-800区域合作框架6-8分钟。
- 重复步骤1.4和1.5的两次以上的总的3倍。在此之前的第三次离心分离，通过搅拌悬浮颗粒，并获得了500微升等分进行细胞计数。
- 计数活细胞，血球计数器和一个倒置相差显微镜使用台盼蓝排除方法9。
- 吸取上清，并重新悬浮沉淀增加一倍所需的接种密度在一定体积的Ham氏F-12介质（ 例如，20×10 6细胞/ ml的最终浓度为10×10 6细胞/ ml后，封装）。
2。软骨细胞琼脂糖凝胶封装
- 烧热0.8克蒸压VII型琼脂糖在20毫升无菌，1×PBS（pH 7.4）中，设定为120℃，直至溶解在热板上。一旦溶解，降低到60℃，因为较高的温度加热西港岛线升影响细胞活力。
- 在一个50毫升锥形管中，充分混合等体积的细胞悬浮液，用两倍的所需浓度的琼脂糖（ 如 4％的琼脂糖悬浮液，最后的2％琼脂糖水凝胶）。避免产生大的泡沫，因为他们可以影响细胞的活力和构建疲劳寿命。
- 小心地等分试样10毫升软骨细胞琼脂糖混合物到一个直径60毫米的培养皿中，同时避免大气泡的创建。
- 让在室温下静置30分钟，直至胶凝。
- 获取尽可能多软骨细胞琼脂糖根据需要的水凝胶样品（通常为20-30），使用一个4毫米活检打孔。
- 测量和记录的物理尺寸（直径和高度）的有代表性的样品，使用测微计。构建体应为约5毫米的高度，丢弃从样品高度方差是大于2％的区域获得的任何样品。
- 将样品转移到新鲜的60毫米陪替氏培养皿和补充用10ml的完整的媒体（ 如 20％胎牛血清的Ham氏F-12培养基中的20mM HEPES，100μg/ ml的抗坏血酸，和2x抗生素/抗 真菌剂）。
3。机械性刺激和放射性标记的软骨细胞琼脂糖凝胶
- 高压灭菌的金属组分的压缩钻机。用70％乙醇（过夜）和UV光（至少15分钟）灭菌的塑料部件。
- 为了保持结构，从翻倒，使用镊子，地点12的无菌塑料护环（具有内径大于该构建直径）组（n = 6，样品和对照组）内的24孔培养板的孔中。
- 使用镊子，小心转移软骨细胞 - 琼脂糖凝胶从陪替氏培养皿中的24孔板上，每一个固定在一个保持环。
- 转移400μl的完整的媒体（ 例如，20％FBS的Ham氏F-12培养基中，用20mM HEPES，100μg/ ml的抗坏血酸，和2倍抗生素/抗真菌剂），每个样品。
- 组装消毒压缩钻机（ 图1），并用紧定螺钉固定的压板。将压缩钻机的24孔培养板中。
- 释放和重新设置的固定螺钉，以建立压板水凝胶接触（零应变状态）。
- 将组装的压缩钻机到了Mach-1微机械测试系统。安全钻机垂直阶段通过定位销和锁固定螺丝的地方。删除间距夹具。
- 应用动态压缩载荷在所希望的振幅（ 例如，10％的原始高度的样品的基础上）的应变振幅，频率（ 例如，1赫兹）和持续时间或数量的周期（ 例如到第60分钟的时间间隔）。
- 完成后的机械性刺激，更换间隔夹具，定位销固定螺丝松动和删除压缩钻机和培养板的Mach-1微机械测试系统。 放射性标记的细胞的水凝胶结构用5微居里所需的同位素（ 例如 ，[3 H] -脯氨酸的蛋白标签为软骨细胞的特定的胶原蛋白的合成和[35 S] -硫蛋白聚糖的合成）通过补充媒体。
- 放射性标记的构造孵育24小时，在37℃，5％CO 2 10。
- 收获的放射性标记的水凝胶的结构，并在1x PBS（pH值7.4）冲洗3次，以除去任何非法人的同位素。月刊样品用木瓜蛋白酶（40微克/毫升在20mM乙酸铵中，1 mM的ethyldiaminetetraacetic的酸和2mM的二硫苏糖醇在65℃下72小时）。
- 测定DNA含量Picogreen荧光染色实验检测11注册成立的同位素活性，规范化DNA含量，β-液体闪烁计数12,13紧随其后的木瓜蛋白酶消化消化。
注：购买和出售的放射性物质（垃圾同位素和项目接触放射性物质可能已经进入）必须遵循相关的制度（和/或政府）的政策和程序的安全处理和处置放射性物质。
4。代表性的成果
牛关节软骨-琼脂糖凝胶的构造（与10×10 6细胞/ ml包裹细胞2％琼脂糖），机械刺激的振幅的10％的压缩应变，在20至60分钟（或1,200至3,600个周期的频率为1赫），并测定DNA含量和细胞外基质合成的放射性同位素成立。 DNA和细胞外基质的合成，在以剂量依赖性的方式的影响。 DNA含量表现出显着减少35％，为20或30分钟的刺激（P <0.01）的结果，而没有显示出效果（ 图2）的60分钟的刺激。软骨特异性胶原蛋白和蛋白聚糖的合成（[3 H] -脯氨酸和确定[35 S] -硫掺入，分别）表现出显着增加了约60％，在响应于20分钟或30分钟的刺激（P <0.01），用60分钟的刺激没有表现出可观察的效果（ 图3）。
刺激软骨细胞琼脂糖结构示意图如图1所示。定制的动态压缩钻机。：组装钻机。 右 ：爆炸视图的各个组成部分。
水凝胶机械下10％的压缩应变振幅为20分钟到第60分钟以1 Hz（均值±扫描电镜（SEM）中，n = 6/group）刺激软骨细胞-琼脂糖的DNA含量的图2的变化。
水凝胶机械刺激软骨细胞-琼脂糖的合成细胞外基质（胶原和蛋白聚糖）的图3的变化下10％压缩应变振幅为20分钟到第60分钟（均值±扫描电镜（SEM）中，n = 6/group）在1 Hz。
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Discussion
所描述的方法应用控制的机械刺激细胞种子的琼脂糖凝胶可以对软骨细胞代谢的动态压力的影响，直接调查。护环配合使用的定制试验台结构的横向约束的样品给小费，以避免潜在的问题。尽管潜在的差异，样品高度与结构，由一组人员死加权加载压板固定使用，确保直接接触。放射性标记刺激后，测量细胞的生物合成，降低污染的可能性，允许一个单一的测试平台，以用于多个应用程序的动态力学刺激。这种方法可以很容易地适应不同的机械加载方式（ 如剪切1,4，张力1,2），探讨了影响，或阐明特定的的机械传导通路负责。
ove_content“>所示的有代表性的结果，约35％的细胞死亡的少量的可能会发生由于应用程序的动态刺激，具有更长的应用程序不影响构建细胞结构15-17的机械性刺激细胞外基质大分子的生物合成，所确定放射性同位素注册成立，说明了一个持续时间依赖性反应的动态压缩。应用动态压缩载荷的20至30分钟内造成的最大的合成代谢反应持续时间较长，出现所施加的机械性刺激引起的脱敏效果。细胞脱敏机械加载已先前指出1,2,5,13，但很少有调查表征依赖于时间的性质，这种现象，此信息可用于确定最佳刺激条件下，以最大限度地提高与细胞外基质的积累建设未定义ŕ重复或长期应用机械性刺激。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
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