Summary
Biosyntesen af bruskagtig extracellulær matrix ved hjælp af chondrocytter kan påvirkes af anvendelse af mekaniske stimuli. Denne metode beskriver teknik for at anvende dynamiske trykstyrke stammer til chondrocytter indkapslet i 3D konstruktioner og evalueringen af inducerede ændringer i chondrocyt stofskifte.
Abstract
Ledbrusk lider af en begrænset reparationskapacitet beskadiget på grund af mekanisk defekt eller nedbrydes af sygdomme, såsom osteoarthritis. For at afhjælpe denne mangel, har flere medicinske indgreb blevet udviklet. En sådan metode er at dukke op igen det beskadigede område med væv-manipuleret brusk, men den konstruerede væv typisk mangler de biokemiske egenskaber og holdbarhed for indfødte brusk, spørgende sit langsigtede overlevelsesevne. Dette begrænser anvendelsen af bruskvæv engineering til reparation af små fokale defekter med henvisning til det omgivende væv for at beskytte den implanterede materiale. At forbedre egenskaberne af den udviklede væv, mekanisk stimulering er en populær metode anvendes til at forstærke syntesen af bruskagtig extracellulær matrix såvel som de resulterende mekaniske egenskaber af konstruerede væv. Mekanisk stimulering anvender kræfter til vævskonstruktioner analog med dem, der opleves in vivo. Detteer baseret på den forudsætning, at den mekaniske miljø, til dels regulerer udvikling og vedligeholdelse af nativt væv 1,2. De mest almindeligt anvendte form for mekanisk stimulation i bruskvæv engineering er dynamisk kompression ved fysiologiske stammer af ca 5-20% ved en frekvens på 1 Hz 1,3. Adskillige undersøgelser har undersøgt effekten af dynamisk kompression og har vist, at det har en positiv effekt på chondrocyt metabolisme og biosyntese, i sidste ende påvirker de funktionelle egenskaber af den udviklede væv 4-8. I dette dokument viser vi fremgangsmåden til mekanisk at stimulere chondrocyt-agarose hydrogel konstruktioner under dynamisk kompression og analysere ændringer i biosyntesen via biokemiske og radioisotop assays. Denne metode kan også let modificeres til at vurdere potentielt inducerede ændringer i cellulær reaktion som følge af mekaniske stimuli.
Protocol
1. Isolering af primære led-chondrocytter
Høst 10-15 fuld tykkelse brusk skiver fra de artikulære overflader af animalske leddene (f.eks metacarpal-falankse led af fuldvoksne køer opnået fra en lokal abbatoir).
- Sted brusk skiver i en 100 mm petriskål og inkuberes i 20 ml 0,5% protease i Hams F-12 (w / v) i 2 timer ved 37 ° C. Skylles tre gange i Hams F-12 kulturmedier og inkuberes med 20 ml 0,15% collagenase A i Hams F-12 kulturmedier natten over ved 37 ° C.
- Filtreres cellesuspensionen gennem en 200 mesh sigte filter over i en ren skål. Filteret vaskes med 5 ml Hams F-12 og føje til skålen. Overfør cellesuspension til en 50 ml konisk rør. Vask petriskål med 10 ml Hams F-12 og føje til den konisk rør.
- Centrifuger røret ved 600-800 rcf i 6-8 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten, sikrer ikke at forstyrre the cellepellet og resuspender i 40 ml Hams F-12 kulturmedier.
- Centrifuger røret ved 600-800 rcf for 6-8 min.
- Gentag trin 1.4 og 1.5 to gange mere for i alt 3 gange. Forud for centrifugering for tredje gang, pellet resuspenderes via agitation og få en 500 gl portion til celletælling.
- Tælle levedygtige celler ved hjælp af Trypan-blå eksklusion fremgangsmåde 9 med et hæmacytometer og et inverteret lysmikroskop.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i et volumen på Hams F-12 medier for at fordoble den ønskede podningstæthed (fx 20 x 10 6 celler / ml til en endelig koncentration på 10 x 10 6 celler / ml efter indkapsling).
2. Chondrocyt-agarose Hydrogel Indkapsling
- Heat 0,8 g autoklaveret Type VII agarose i 20 ml steril 1 x PBS (pH 7,4) på en varmeplade indstillet til 120 ° C indtil opløsning. Når opløst, sænkes opvarmes til 60 ° C som højere temperaturer will påvirke cellernes levedygtighed.
- I et 50 ml konisk rør, blandes grundigt lige volumener af cellesuspensionen med dobbelt den ønskede koncentration af agarose (fx 4% agarose suspension til en endelig 2% agarose hydrogel). Undgå at skabe store bobler da de kan påvirke cellernes levedygtighed og konstruere træthed liv.
- Omhyggeligt alikvot 10 ml af chondrocyt-agarose blandingen i en 60 mm diameter petriskål, og samtidig undgå at skabe store bobler.
- Lad henstå i 30 minutter ved stuetemperatur, indtil geleret.
- Få så mange chondrocyt-agarose hydrogel prøver efter behov (typisk 20-30) med en 4 mm biopsi punch.
- Måle og registrere de fysiske dimensioner (diameter og højde) repræsentative prøver ved hjælp af en mikrometer. Konstrukter skal være ca 5 mm i højde, kassere prøver opnået fra en region prøven højde variansen var større end 2%.
- Overføre prøver til et frisk 60 mm petriskål og supplementmed 10 ml komplette medier (fx 20% kalvefosterserum i Hams F-12 kulturmedier med 20 mM HEPES, 100 ug / ml ascorbinsyre og 2x antibiotika / antimykotika).
3. Mekanisk stimulering og Radiomærkning af chondrocyt-agarose Hydrogeler
- Autoklavere metalliske komponenter i kompression riggen. Sterilisere plastkomponenter med 70% ethanol (natten over) og UV-lys (i mindst 15 min).
- For at holde konstruktioner vælter, med pincet, place 12 sterile plast låseringe (med en indre diameter større end konstruktionen diameter) (n = 6, prøver og kontroller) i brøndene i en 24-brønds kulturplade.
- Ved hjælp af en pincet, overføres omhyggeligt chondrocyt-agarose-hydrogeler fra petriskålen til 24-brønds plade, fastholder hver en i en holdering.
- Overfør 400 ul fuldstændigt medium (fx 20% FBS i Hams F-12 kulturmedier med 20 mM HEPES, 100 ug / ml ascorbinsyre, og2x antibiotika / antimykotika) til hver prøvebrønd.
- Saml steriliserede kompression rig (figur 1) og fastgør pladerne med stilleskruer. Fastgør kompression riggen til 24-brønds kulturplade.
- Slip og re-sikre stilleskruerne at etablere plade-hydrogel kontakt (nuldeformations tilstand).
- Læg den samlede komprimering rig i en Mach-1 mikromekanisk Testing System. Sikker rig til den lodrette stadium via positioneringsstift og lås på plads med stilleskrue. Fjern afstanden jig.
- Anvende dynamisk trykbelastning på ønsket amplitude (fx 10% belastning amplitude på grundlag af den oprindelige højde af prøverne), frekvens (fx 1 Hz) og varighed eller antal cyklusser (fx tidsintervaller op til 60 min).
- Efter færdiggørelsen af mekanisk stimulation, erstatter afstandsstykket jig, løsnes positioneringsstift stilleskrue og fjern kompression rig og dyrkningsplade fra Mach-1 mikromekanisk Testing System. Radiomærke cell-hydrogel-konstruktioner ved at supplere mediet med 5 uCi ønskede isotop (fx [3H]-prolin protein label for chondrocyt-specifikke collagensyntese og [35S]-svovl for proteoglycan-syntese).
- Inkuber de radioaktivt mærkede konstruktioner til 24 timer ved 37 ° C, 5% CO 2 10.
- Høste de radioaktivt mærkede hydrogel konstruktioner og skylles 3 gange i 1 x PBS (pH 7,4) for at fjerne ikke-inkorporeret isotop. Fordøje prøver under anvendelse papain (40 ug / ml i 20 mM ammoniumacetat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic syre og 2 mM dithiothreitol ved 65 ° C i 72 timer).
- Assay digest for DNA-indhold ved hjælp af PicoGreen dye assay 11 og inkorporeret isotop aktivitet normaliseret til DNA-indhold af β-væskescintillationstælling 12,13 umiddelbart efter papainfordøjelse.
Bemærk: køb og bortskaffelse af radioaktive materialer (affald isotoper og elementerder måtte være kommet i kontakt radioaktive materialer) skal følge den relevante institutionelle (og / eller statslige) politikker og procedurer for sikker håndtering og bortskaffelse af radioaktive stoffer.
4. Repræsentative resultater
Bovine artikulære chondrocyt-agarose hydrogeler konstruktioner (2% agarose med 10 x 10 6 celler / ml indkapslede celler) blev mekanisk stimuleret med en amplitude på 10% kompressionskraft stamme ved en frekvens på 1 Hz i 20 til 60 min (eller 1200 til 3600 cyklusser ) og analyseret for DNA-indhold og ekstracellulær matrix-syntese ved radioisotop inkorporering. DNA og ekstracellulær matrix-syntese blev påvirket i en dosisafhængig måde. DNA-indholdet udviste en signifikant 35% reduktion som følge på 20 eller 30 minutter for stimulation (p <0,01), mens 60 minutters stimulering udviste ingen virkning (figur 2). Bruskspecifikke collagen og proteoglycan-syntese (bestemt ved [3H]-prolin og[35S]-svovl inkorporering, henholdsvis) udviste signifikante stigninger i omkring 60% som respons på 20 eller 30 minutter for stimulation (p <0,01), med 60 minutters stimulering udviser ingen observerbar virkning (figur 3).
. Figur 1 Skematisk af specialfremstillet dynamisk kompression rig til at stimulere chondrocyt-agarose konstruktioner Venstre:. Assembled rig Højre:. Eksplosionstegning viser de enkelte komponenter.
Figur 2. Ændringer i DNA-indholdet i chondrocyt-agarose-hydrogeler mekanisk fremmet under en 10% trykstyrke stamme amplitude ved 1 Hz i 20 til 60 minutter (middel ± SEM, n = 6/group).
Figur 3. Ændringer i ekstracellulær matrix-syntese (collagen og proteoglycaner) af chondrocyt-agarose-hydrogeler mekanisk stimuleret under 10% kompressionskraft stamme amplitude ved 1 Hz i 20 til 60 minutter (middel ± SEM, n = 6/group).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metode til påføring af kontrollerede mekaniske stimuli til celle-seedede agarose hydrogeler giver mulighed for direkte undersøgelse af virkningerne af dynamiske trykkræfter på chondrocyt stofskifte. Brugen af custom-prøvningsapparaturet i forbindelse med de låseringe forudsat lateral begrænsning for konstruktionerne for at undgå potentielle problemer med prøve deponering. Brugen af døde-vægtede loading plader sikret ved sæt besætninger sikrer direkte kontakt med konstruktioner trods potentielle forskelle i prøve højde. Radiomærkning post-stimulation for at måle cellulær biosyntese reducerer risikoen for kontaminering, hvilket muliggør en enkelt prøvningsapparaturet skal anvendes til flere applikationer af dynamiske mekaniske stimuli. Denne metode kan let tilpasses til at undersøge effekten af forskellige mekaniske belastningstilstande tilstande (f.eks shear 1,4, spænding 1,2) eller at belyse specifikke mechanotransduction veje der er ansvarlig.
ove_content "> De repræsentative resultater viste, at en lille mængde af celledød på omkring 35% kan forekomme på grund af anvendelsen af dynamisk stimulation med længere anvendelser af mekanisk stimulering ikke påvirker konstrukt cellularitet 15-17. Biosyntese af ekstracellulære matrix-makromolekyler, bestemt ved radioisotop inkorporering, illustreret en varighed afhængig reaktion på dynamisk kompression. Anvendelser af dynamisk trykbelastning i en periode på 20 til 30 minutter resulterede i en maksimal anabolske respons med længere varighed ser ud til at fremkalde en desensibilisering effekt til de pålagte mekaniske stimuli. Cellular desensibilisering til mekanisk lastningen er bemærket tidligere 1,2,5,13, men uden store undersøgelse karakterisering af den tidsafhængige karakter dette fænomen. Denne information kan anvendes til at bestemme de optimale stimulering betingelser for at maksimere akkumulering af ekstracellulær matrix med den konstruere under gentaget eller lang sigt, anvendelse af mekanisk stimulation.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
