Summary
De biosynthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix door chondrocyten kan worden beïnvloed door toepassing van mechanische stimuli. Deze methode beschrijft de technische uitvoering van dynamische druk-stammen chondrocyten ingekapseld in 3D constructen en de evaluatie van geïnduceerde veranderingen in chondrocyte metabolisme.
Abstract
Gewrichtskraakbeen lijdt aan een beperkte reparatie capaciteit wanneer deze door mechanische belediging of afgebroken door ziekte, zoals artrose. Om dit tekort te verhelpen zijn verschillende medische ingrepen ontwikkeld. Een dergelijke methode is om weer de kop opsteken de beschadigde plek met tissue-engineered kraakbeen, maar de gemanipuleerde weefsel meestal niet over de biochemische eigenschappen en duurzaamheid van inheemse kraakbeen, vragen stellen op de lange termijn overlevingskansen. Dit beperkt de toepassing van kraakbeen tissue engineering aan de reparatie van kleine focale defecten, met een beroep op het omliggende weefsel aan het geïmplanteerde materiaal te beschermen. Ter verbetering van de eigenschappen van de ontwikkelde weefsel mechanische stimulatie is een populaire methode gebruikt om de synthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix en de resulterende mechanische eigenschappen van de gemanipuleerde weefsel verbeteren. Mechanische stimulatie toepassing krachten op het weefsel constructen analoog aan die ervaren in vivo. Dezeis gebaseerd op de vooronderstelling dat de mechanische omgeving, gedeeltelijk de ontwikkeling en instandhouding van natuurlijke weefsel 1,2 regelt. De meest gangbare vorm van mechanische stimulatie in kraakbeenweefsel engineering dynamische compressie bij fysiologische stammen van ongeveer 5-20% bij een frequentie van 1 Hz 1,3. Verschillende studies hebben de effecten van dynamische compressie en hebben aangetoond dat het een positief effect op chondrocyte metabolisme en biosynthese hebben uiteindelijk die de functionele eigenschappen van de ontwikkelde weefsel 4-8. In dit artikel illustreren we de methode om mechanisch chondrocyten-agarose hydrogel constructies te stimuleren onder dynamische compressie en analyseren veranderingen in de biosynthese door middel van biochemische en radio-isotopen analyses. Deze methode kan ook gemakkelijk worden gemodificeerd om eventueel veroorzaakte veranderingen in cellulaire respons geven als gevolg van mechanische stimuli.
Protocol
1. Isolatie van Primaire articulaire chondrocyten
Oogst 10 tot 15 volledige dikte kraakbeen schijfjes van de articulaire oppervlakken van dieren gewrichten (bijvoorbeeld de metacarpale-gewricht van een volgroeid skelet koeien verkregen uit een lokale Abbatoir).
- Plaats kraakbeen segmenten in een 100 mm petrischaal en Incubate in 20 ml 0,5% protease in Ham's F-12 (w / v) gedurende 2 uur bij 37 ° C. Driemaal spoelen in Ham's F-12 kweekmedium en geïncubeerd met 20 ml 0,15% A Collagenase in Ham's F-12 kweekmedium nacht bij 37 ° C.
- Filter de celsuspensie door een 200 mesh zeef filter in een schone schaal. Was het filter met 5 ml Ham's F-12 en voeg aan het gerecht. Breng de celsuspensie in een 50 ml conische buis. Was de petrischaal met 10 ml Ham's F-12 en aan de conische buis.
- Centrifugeer de buis 600-800 RCF gedurende 6-8 min bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant, zodat niet om e storene celpellet en resuspendeer in 40 ml Ham's F-12 kweekmedium.
- Centrifugeer de buis bij 6-800 RCF gedurende 6-8 minuten.
- Herhaal stappen 1.4 en 1.5 tweemaal voor een totaal van 3 keer. Voorafgaand aan het centrifugeren voor de derde keer, resuspendeer de pellet via agitatie en het verkrijgen van een 500 pi aliquot voor cel tellen.
- Tellen levensvatbare cellen met behulp van de trypan blauw uitsluiting werkwijze 9 met een hemacytometer en een omgekeerde lichtmicroscoop.
- Zuig het supernatant en de pellet resuspendeer in een volume van Ham's F-12 media om de gewenste zaaidichtheid verdubbelen (bv. 20 x 10 6 cellen / ml voor een uiteindelijke concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml na inkapseling).
2. Chondrocyte-agarose Hydrogel Encapsulation
- Heat 0,8 g geautoclaveerd Type VII agarose in 20 ml steriel 1x PBS (pH 7,4) op een hete plaat op 120 ° C worden opgelost. Na oplossen te temperen tot 60 ° C hogere temperaturen Will van invloed zijn levensvatbaarheid van de cellen.
- In een 50 ml conische buis, meng gelijke hoeveelheden van de celsuspensie met dubbele gewenste concentratie van agarose (bijv. 4% agarose suspensie voor een laatste 2% agarose hydrogel). Vermijd het ontstaan van grote bellen als ze kunnen levensvatbaarheid van de cellen beïnvloeden en bouwen levensduur.
- Zorgvuldig aliquot van 10 ml van de chondrocyten-agarose mengsel in een diameter van 60 mm petrischaal, terwijl het vermijden van het ontstaan van grote bellen.
- Laat 30 min bij kamertemperatuur tot gegeleerd.
- Zorg voor zo veel chondrocyten-agarose hydrogel monsters als dat nodig is (meestal 20-30) met een 4 mm biopsie punch.
- Meet en noteer de afmetingen (diameter en hoogte) van representatieve monsters met een micrometer. Constructen moet ongeveer 5 mm groot, weggooien monsters verkregen uit een gebied waar het monster hoogte verschil groter was dan 2%.
- Doorvoermonsters een nieuwe 60 mm petrischaaltje supplementmet 10 ml volledige media (bijv. 20% foetaal bovien serum in Ham's F-12 kweekmedium met 20 mM HEPES, 100 ug / ml ascorbinezuur en 2x antibiotica / antimycotica).
3. Mechanische stimulatie en radioactief merken van Chondrocyten-agarose Hydrogelen
- Autoclaaf de metalen onderdelen van de compressie rig. Steriliseer de plastic onderdelen met 70% ethanol (overnacht) en UV licht (ten minste 15 min).
- Tot constructen omvalt, met forceps, plaats 12 steriele plastic borgringen (met een binnendiameter groter dan de diameter construct) (n = 6, monsters en controles) in de putjes van een 24-well kweekplaat.
- Behulp van een tang voorzichtig overdragen chondrocyte-agarose hydrogels van de petrischaal op de 24-well plaat, vastzetten elk in een borgring.
- Breng 400 pl volledig medium (bijv. 20% FBS in Ham's F-12 kweekmedium met 20 mM HEPES, 100 ug / ml ascorbinezuur en2x antibiotica / antimycotica) aan elk monster goed.
- Monteer de gesteriliseerde compressie rig (figuur 1) en zet de platen met stelschroeven. Bevestig de compressie rig naar de 24-well cultuur plaat.
- Los te laten en opnieuw te beveiligen van de stelschroeven met glasplaat-hydrogel contact (nul stam staat) vast te stellen.
- Laad de gemonteerde compressie rig in een Mach-1 Micromechanische Testing System. Secure rig om de verticale fase via fixeerpen en zet ze vast met de stelschroef. Verwijder de afstand jig.
- Toepassing dynamische drukbelasting op gewenste amplitude (bijv. 10% rek amplitude gebaseerd op de oorspronkelijke hoogte van de monsters), frequentie (bijv. 1 Hz) en duur of het aantal cycli (bijvoorbeeld intervallen tot 60 min).
- Na de voltooiing van mechanische stimulatie, vervang dan de afstand mal, maak de paspen schroeven los en verwijder de compressie rig en cultuur plaat uit de Mach-1 Micromechanische Testing System. Radiolabel cel hydrogel constructen door daaraan media met 5 uCi gewenste isotoop (bijv. [3H]-proline eiwit label voor chondrocyte specifieke collageensynthese en [35S]-zwavel proteoglycaan synthese).
- Incubeer de radioactief gemerkte constructen gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2 10.
- Oogst de radioactief gemerkte constructen hydrogel en spoel 3 keer in 1x PBS (pH 7,4) eventuele niet opgenomen isotoop verwijderen. Digest monsters met papaïne (40 ug / ml in 20 mM ammoniumacetaat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic zuur en 2 mM dithiothreitol bij 65 ° C gedurende 72 uur).
- Assay digest voor DNA-inhoud met de PicoGreen kleurstof assay 11 en ingebouwde isotoop activiteit, genormaliseerd naar DNA-gehalte, door β-vloeistofscintillatietelling 12,13 direct na papaïnedigestie.
Opmerking: De aankoop en verkoop van radioactieve stoffen (afval isotopen en artikelendat kan hebben in contact komen radioactieve stoffen) moet voldoen aan de relevante institutionele (en / of overheids) beleid en procedures voor de veilige behandeling en verwijdering van radioactieve stoffen.
4. Representatieve resultaten
Bovine articulaire chondrocyten-agarose hydrogels constructen (2% agarose met 10 x 10 6 cellen / ml ingekapselde cellen) werden mechanisch gestimuleerd bij een amplitude van 10% drukspanning bij een frequentie van 1 Hz gedurende 20 tot 60 min (of 1.200 tot 3.600 cycli ) en geanalyseerd op DNA-gehalte en extracellulaire matrix synthese door opname van radio-isotopen. DNA en extracellulaire matrix synthese werd beïnvloed op een dosisafhankelijke wijze. DNA inhoud vertoonden een significante afname 35% als gevolg van 20 of 30 min stimulatie (p <0,01), terwijl 60 min stimulatie vertoonde geen effect (Figuur 2). Kraakbeen-specifieke collageen en proteoglycanen synthese (bepaald door [3H]-proline en[35S]-opname zwavel, respectievelijk) significante toename van ongeveer 60% vertoonden in reactie op 20 of 30 min stimulatie (p <0,01), met 60 min stimulatie vertonen geen waarneembaar effect (Figuur 3).
. Figuur 1 Schematische weergave van de custom-built dynamische compressie rig voor het stimuleren van chondrocyten-agarose constructies Links:. Assembled rig Rechts:. Exploded view weergeven van afzonderlijke componenten.
Figuur 2. Veranderingen in DNA gehalte van chondrocyte-agarose hydrogelen mechanisch gestimuleerd minder dan 10% drukbelasting amplitude bij 1 Hz gedurende 20 tot 60 minuten (gemiddelde ± SEM, n = 6/group).
Figuur 3. Veranderingen in extracellulaire matrixsynthese (collageen en proteoglycanen) van chondrocyte-agarose hydrogelen mechanisch gestimuleerd tot 10% drukbelasting amplitude bij 1 Hz gedurende 20 tot 60 minuten (gemiddelde ± SEM, n = 6/group).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven werkwijze voor het aanbrengen gecontroleerde mechanische stimuli tot cel geplaatste agarose hydrogels maakt rechtstreekse onderzoek naar de effecten van dynamische drukkracht over chondrocyte metabolisme. Het gebruik van de maat testopstelling in samenhang met de borgringen ontvangen laterale beperking voor de constructen mogelijke problemen monster kantelen te voorkomen. Het gebruik van dode-gewogen laden platen beveiligd door sets bemanningen zorgt voor direct contact met constructen, ondanks mogelijke verschillen in de steekproef hoogte. Radiolabeling na stimulatie te meten cellulaire biosynthese vermindert de kans op vervuiling waardoor een testopstelling worden gebruikt voor vele toepassingen van dynamische mechanische stimuli. Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan het effect van verschillende mechanische belasting modi (bijv. shear 1,4, spanning 1,2) onderzoeken of te verhelderen specifieke mechanotransductie verantwoordelijk trajecten.
ove_content "> De representatieve resultaten blijkt dat een kleine hoeveelheid celdood van ongeveer 35% kan optreden door toepassing van dynamische stimulatie, met meer toepassingen van mechanische stimulatie niet beïnvloeden construct cellulariteit 15-17. Biosynthese van extracellulaire matrix macromoleculen bepaald door radioisotoop integratie, blijkt een duur afhankelijke respons op dynamische compressie. Toepassingen van dynamische drukbelasting gedurende 20 tot 30 min tot een maximale anabole respons met langere lengtes die er als een desensibilisatie effect wordt veroorzaakt aan de opgelegde mechanische stimuli. Cellular desensitisatie mechanische loading al eerder 1,2,5,13 vermeld, maar er is weinig onderzoek naar de karakterisering van het tijdsafhankelijke aard van deze verschijnselen. Deze informatie kan worden gebruikt om de optimale stimulatie voorwaarden bepalen van de accumulatie van extracellulaire matrix met maximaliseren construeren under herhaalde of langdurige, toepassingen van mechanische stimulatie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
