Summary
chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.
Abstract
기계 모욕이나 관절염과 같은 질환에 의해 저하에 의해 손상되면 관절 연골은 제한된 복구 능력을 앓고. 이 결핍을 해결하려면 몇 가지 의료 개입이 개발되었습니다. 하나의 방법은 조직 - 엔지니어링 연골과 손상된 영역을 표면화하는 것입니다, 그러나, 엔지니어링 조직은 일반적으로 장기 survivability에 의문을 제기하고, 기본 연골의 생화학 특성과 내구성이 부족합니다. 이 주입 된 자료를 보호하기 위해 주변 조직에 의존, 작은 초점 결함의 수리에 연골 조직 공학의 응용 프로그램을 제한합니다. 개발 조직의 속성을 개선하기 위해 기계 자극은 연골 성의 세포 외 기질의 합성뿐만 아니라 엔지니어링 조직의 결과 기계적 성질을 향상시키기 위해 활용 인기있는 방법입니다. 기계 자극은 조직에 힘을 적용 생체에 이러한 경험과 유사한 구성합니다. 이기계 환경, 부분적으로, 기본 조직 1,2의 개발과 유지 보수를 조절하는 전제에 기반을두고 있습니다. 연골 조직 공학에서 기계 자극의 가장 일반적으로 적용되는 형태는 1 Hz에서 1,3의 주파수에서 약 5~20%의 physiologic 변종에 동적 압축합니다. 몇몇 연구는 동적 압축의 효과를 조사했고 최종적으로 개발 된 조직 4-8의 기능적 특성에 영향을 미치는, chondrocyte 신진 대사와 생합성에 긍정적 인 효과를 보여 주었다. 이 논문에서, 우리는 기계적으로 동적 압축에 따라 chondrocyte - 아가로 오스의 히드로 겔 구조를 자극하고 생화학 및 방사성 동위 원소 assays을 통해 생합성의 변화를 분석 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 쉽게 기계적 자극의 결과로 세포의 반응에 잠재적으로 유도 변경 사항을 평가하기 위해 수정할 수 있습니다.
Protocol
1. 기본 관절 Chondrocytes의 절연
동물 관절의 관절 표면에서 수확 10-15 전체 두께 연골의 조각 (로컬 abbatoir에서 얻은 skeletally 성숙 소의 손바닥 뼈 - phalangeal 공동을 지정할 수).
- 37 번 2 시간에 대한 햄의 F-12 (w / V)에서 0.5 % 프로테아제의 20 ML에 100mm 페트리 접시 및 배양 ° C.의 장소 연골 슬라이스 햄의 F-12 문화 미디어에 세 번 헹구고, 0.15 %의 Collagenase의 20 ML을 품다 37 번 밤새 햄의 F-12 문화 미디어 ° C.에
- 깨끗한 그릇에 200 메쉬 스크린 필터를 통해 세포 현탁액을 필터링 할 수 있습니다. 햄의 F-12의 5 ML과 필터를 깨끗이 씻어 요리에 추가 할 수 있습니다. 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 햄의 F-12의 10 ML과 페트리 접시를 씻어과 원뿔 튜브에 추가 할 수 있습니다.
- 실온에서 6-8 분 동안 600-800 rcf에있는 튜브를 원심 분리기.
- 일을 방해하지 보장 표면에 뜨는을 대기음전자 세포 펠렛과 햄의 F-12 문화 미디어 40 ML에 다시 - 일시 중지합니다.
- 6-8 분에 600-800 rcf에있는 튜브를 원심 분리기.
- 3 회 총에 대한 단계 1.4 1.5 두 번 더 반복합니다. 전에 세 번째 시간 centrifuging에, 교반을 통해 펠릿을 resuspend와 셀 계산을위한 500 μl 나누어지는을 구하십시오.
- hemacytometer와 역 가벼운 현미경으로 Trypan 파랑 제외 방법 9를 사용 가능한 셀을 계산합니다.
- 표면에 뜨는을 대기음하고 원하는 심는 밀도를 두 배로 햄의 F-12의 미디어 볼륨에서 펠렛을 다시 일시 중지 (예 : 20 × 10 10 × 10 6 세포 / 캡슐화 한 후 ML의 최종 농도 6 셀 / ML).
2. Chondrocyte - 아가로 오스의 히드로 겔 캡슐화
- 열 0.8 g autoclaved 유형 VII 아가로 오스 용해 ° C까지 120 세트 핫 플레이트에 살균 1X PBS (산도 7.4)의 20 ML 인치 일단 용해, ° C보다 높은 온도로 60 열을 낮출 wil난 세포 생존에 영향을 미칩니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에서 철저하게 아가로 오스 (최종 2퍼센트 아가로 오스의 히드로 겔에 대한 예 4퍼센트 아가로 오스 정지)의 두 원하는 농도로 세포 현탁액의 동등한 볼륨을 섞는다. 그들은 세포 생존에 영향을 미치는 피로 수명을 만들 수 있으므로 큰 거품의 생성을 피하십시오.
- 조심스럽게 나누어지는 10 60mm 직경 페트리 접시에 chondrocyte - 아가로 오스 혼합물의 ML, 큰 거품의 생성을 피하면서.
- gelled 때까지 실온에서 30 분에 서 보자.
- 많은 chondrocyte - 아가로 오스의 히드로 겔 샘플로 4mm 생검 펀치를 사용하여 (일반적으로 20-30) 필요에 따라 얻습니다.
- 마이크로 미터를 사용하여 대표 시료의 물리적 인 크기를 (직경 높이) 측정하고 기록합니다. 구조는 샘플 높이 차이가 큰 2 %였다 지역에서 얻은 샘플을 폐기, 높이 약 5mm해야합니다.
- 새로운 60mm 페트리 접시와 보충에 샘플을 전송전체 미디어의 10 ML (20 MM HEPES, 100 μg / ML 아스코르브 산, 그리고 배 항생제 / antimycotics와 햄의 F-12 문화 미디어 등 20% 태아 소 혈청)과.
3. Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계 자극 및 Radiolabelling
- 압축 장비의 금속 구성 요소를 압력솥. 70 % 에탄올 (야간) 및 UV 빛 (적어도 15 분 용)과 플라스틱 구성 요소를 살균.
- 24 잘 문화 판의 우물에서 장소 12 멸균 플라스틱 유지 링 (구조 직경보다 큰 내부 직경) (N = 6, 샘플 및 컨트롤을), 이상 떨어지는 집게를 사용 구조를 유지합니다.
- 집게를 사용 조심스럽게 유지 링에 각각 확보, 페트리 접시에서 24 잘 판에 chondrocyte - 아가로 오스의 hydrogels를 전송할 수 있습니다.
- 전체 미디어 400 μl (예를 들면 20% 20 MM HEPES, 100 μg / ML의 아스코르브 산으로 햄의 F-12 문화 미디어 FBS 및 전송잘 각 샘플에) 항생제 / antimycotics 2 배.
- 살균 압축 장비 (그림 1) 조립 및 세트 나사와 platens을 확보. 24 잘 문화 판에 압축 장비를 연결합니다.
- 플래 튼 - 히드로 겔 연락처 (제로 변형 상태)를 구축하기 위해 세트 나사를 해제하고 다시 고정하십시오.
- 마하-1 Micromechanical 테스트 시스템으로 조립 압축 장비를로드합니다. 세트 나사와 장소에서 위치 핀과 잠금을 통해 수직 단계에 보안 장비. 간격 지그를 제거합니다.
- 주파수 (예 : 1 Hz에서) 및 기간 또는 사이클의 수 (60 분에 예를 들어 시간 간격까지), 원하는 진폭 (샘플의 원래 높이를 기준으로 예를 들어 10 %의 변형 진폭)에서 동적 압축 하중을 적용합니다.
- 기계 자극 완료되면, 간격 지그를 대체 위치 핀 세트 나사를 풀어 마하-1 Micromechanical 테스트 시스템에서 압축 장비 및 문화 판을 제거합니다. Radiolabel 셀 - 히드로 겔 원하는 동위 원소 (chondrocyte 특정 콜라겐 합성과 [35 S] - 유황 proteoglycan 합성을위한에 대한 예 [3 H]-프롤린 단백질 라벨) 5 μCi으로 미디어를 보완하여 구조.
- 37에서 24 시간에 대한 방사성 동위 원소 표지 된 구조를 길러 ° C, 5 % 2 10 CO.
- 방사성 동위 원소 표지 된 히드로 겔 구조를 수확하고 비법 인 동위 원소를 제거 할 1X PBS (산도 7.4)에서 3 번 씻어. papain (20 MM의 암모늄 아세테이트 40 μg / ML, 65에서 1 ㎜ ethyldiaminetetraacetic 산 2 밀리미터 dithiothreitol ° C 72 시간 용)를 사용하여 다이제스트 샘플.
- PicoGreen 염료 분석 11, 법인의 동위 원소 활동, 12,13 즉시 다음 papain을 소화을 계산 β-액체 섬광에 의해 DNA의 콘텐츠에 대한 표준화를 사용하여 DNA 콘텐츠에 대한 분석 요약.
참고 : 방사성 물질의 구입 및 처분 (폐기물 동위 원소 및 항목연락처 방사성 물질에 와서 도움이 될 수 있도록 () 및 / 또는 정부) 정책과 방사성 물질의 안전한 취급 및 폐기 절차 관련 기관을 준수해야합니다.
4. 대표 결과
소 관절 chondrocyte - 아가로 오스 hydrogels 구조 (10 × 10 6 세포 / ML 캡슐화 된 셀과 2퍼센트 아가로 오스)는 기계적으로 20-60 분 (또는 1200에 3600 사이클 1 Hz의 주파수 10 % 압축 응력의 진폭에 자극했다 ) 및 방사성 동위 원소의 설립에 의한 DNA 콘텐츠 및 세포 외 기질 합성에 assayed. DNA와 세포 외 기질 합성은 복용에 의존 방식으로 영향을했습니다. 자극의 60 분 (그림 2) 아무런 영향을 전시하지 반면, DNA 내용은, 자극의 20 ~ 30 분 (P <0.01)의 결과로 상당한 35 % 감소 전시. 연골 특정 콜라겐과 proteoglycan 합성 ([3 H]-프롤린 및 결정각각 [35 S] - 유황 설립은) 전혀 관찰 할 수있는 효과를 전시하지 자극 60 분 (그림 3)과 자극을 20 ~ 30 분 (P <0.01)에 대한 응답으로 약 60 %의 상당한 증가를 전시.
. chondrocyte - 아가로 오스 구조를 촉진을위한 맞춤식 동적 압축 장비의 그림 1 도식 왼쪽 :. 조립 장비 마우스 오른쪽 :. 개별 구성 요소를 보여주는 뷰를 폭발했다.
chondrocyte - 아가로 오스의 DNA 콘텐츠에 그림 2. 변경은 기계적으로 20-60 분 1 Hz에서 10 % 압축 변형 진폭 (± SEM, N = 6/group을 의미)에서 자극 hydrogels.
chondrocyte - 아가로 오스의 세포 외 기질 합성 (콜라겐과 proteoglycans)의 그림 3. 변경은 기계적으로 20-60 분 (± SEM, N = 6/group을 의미) 1 Hz에서 10 % 압축 변형 진폭에 따라 자극 hydrogels.
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Discussion
셀 - 시드 아가로 오스 hydrogels로 제어 기계 자극을 적용하기위한 설명 방법은 chondrocyte 신진 대사에 동적 압축 힘의 효과에 직접 조사 할 수 있습니다. 유지 링과 함께 맞춤형 테스트 장비의 사용은 샘플 팁의 잠재적 인 문제를 방지하기 위해 구조에 대한 측면 제약 조건을 제공했습니다. 세트 요원 확보 사망 가중 로딩 platens의 사용은 샘플의 높이에 잠재적 인 차이에도 불구하고 구조와 직접적인 접촉을 보장합니다. 세포 생합성는 동적 기계적 자극의 여러 응용 프로그램에 활용 될 수있는 하나의 테스트 장비에 대한 허용, 오염의 가능성을 감소 측정 후 자극을 Radiolabeling. 이 방법은 쉽게 다른 기계 로딩 모드 (예 : 전단 1,4, 긴장 1,2)의 효과를 조사하기 위해 또는 특정 mechanotransduction 책임이 경로 명료하게하다하도록 구성 할 수 있습니다.
ove_content "> 대표 결과 약 35 %의 세포 사망의 작은 양 구조 cellularity 15-17에 영향을 미치지 않을 기계적 자극 더 이상 응용 프로그램과 동적 인 자극의 응용 프로그램으로 인해 발생할 수있는 그림. 세포 외 기질 고분자의 생합성에 의해 결정 방사성 동위 원소의 설립은 동적 압축에 대한 시간 종속 반응을 설명. 20-30 분 동안 동적 압축 하중의 응용이 부과 기계 자극에 desensitization 효과를 이끌어내는 것처럼 위장 이상 기간과 최대 근육 응답하게되었습니다. 셀룰러 desensitization을 기계에 로드는 이전에 1,2,5,13 널리 알려져 있으며,이 현상의 시간 의존 자연의 특성에 약간의 조사가 발생했습니다.이 정보는과 세포 외 기질의 축적을 최대화하기 위해 최적의 자극 조건을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 unde를 구축R은 반복 또는 장기, 기계적 자극의 응용 프로그램입니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
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