Summary
Biosyntesen av brusk ekstracellulær matriks ved kondrocytter kan påvirkes ved anvendelse av mekaniske stimuli. Denne metoden beskriver teknikken for å bruke dynamiske kompresjons stammer til chondrocytes innkapslet i 3D konstruksjoner og evaluering av induserte endringer i chondrocyttransplantasjon metabolisme.
Abstract
Leddbrusk lider fra en begrenset kapasitet når reparasjon skadet ved mekaniske fornærmelse eller degradert av sykdom, slik som osteoartritt. For å bøte på denne mangelen, har flere medisinske intervensjoner blitt utviklet. En slik metode er å gjenoppstår det skadede området med vev-konstruert brusk, men den utviklet vev vanligvis mangler de biokjemiske egenskaper og holdbarhet av innfødt brusk, spørrende sin langsiktige overlevelsesevne. Dette begrenser anvendelsen av bruskvev engineering til reparasjon av små kontaktpunkter defekter, avhengig av den omgivende vev for å beskytte det implanterte materiale. For å forbedre egenskapene til den utviklede vev, er mekanisk stimulering en populær metode benyttes til å forbedre syntesen av brusk ekstracellulær matriks, så vel som de resulterende mekaniske egenskaper konstruert vev. Mekanisk stimulering gjelder krefter til vevet konstruerer analogt til de erfarne in vivo. Detteer basert på premisset om at den mekaniske miljø, delvis regulerer utvikling og vedlikehold av innfødte vev 1,2. Den hyppigst anvendt form av mekanisk stimulering i bruskvev engineering er dynamisk kompresjon ved fysiologisk stammer av ca 5-20% ved en frekvens på 1 Hz 1,3. Flere studier har undersøkt effekten av dynamisk kompresjon og har vist at det å ha en positiv effekt på chondrocyttransplantasjon metabolisme og biosyntese, til slutt påvirker funksjonelle egenskaper utviklet vev 4-8. I denne artikkelen illustrerer vi metoden til mekanisk stimulere chondrocyttransplantasjon-agarose hydrogel konstruerer under dynamisk kompresjon og analysere endringer i biosyntesen gjennom biokjemiske og radioisotop analyser. Denne metoden kan også bli lett modifisert for å vurdere eventuelle potensielt induserte endringer i cellulær respons som et resultat av mekaniske stimuli.
Protocol
1. Isolering av Primary Artikulære chondrocytes
Høste 10-15 full tykkelse brusk skiver fra artikulære flater av dyr leddene (f.eks metacarpal-phalangeal felles av skjelettet kyr hentet fra en lokal abbatoir).
- Place brusk skiver i en 100 mm petriskål og Inkuber i 20 ml 0,5% protease i Hams F-12 (w / v) i 2 timer ved 37 ° C. Skyll tre ganger i Ham F-12 dyrkningsmedier og inkuber med 20 ml 0,15% kollagenase A i Ham F-12 dyrkningsmedier natten ved 37 ° C.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 200 mesh sikt filteret i en ren form. Vask filteret med 5 ml Ham F-12 og legge til parabolen. Overfør cellesuspensjonen til en 50 ml konisk rør. Vask petriskål med 10 ml Ham F-12 og legge til det koniske rør.
- Sentrifuger røret på 600-800 RCF i 6-8 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten, slik ikke å forstyrre the cellepellet og re-suspendere i 40 ml Ham F-12 dyrkningsmedier.
- Sentrifuger røret på 600-800 RCF for 6-8 min.
- Gjenta trinn 1,4 og 1,5 ganger mer for totalt 3 ganger. Før sentrifugering for tredje gang, resuspender pelleten via agitasjon og få en 500 pl alikvot for Celletellingen.
- Telle levedyktige celler ved hjelp av Trypan blå eksklusjon metode 9 med en hemacytometer og en invertert lysmikroskop.
- Aspirer supernatanten og resuspendere pelleten i et volum av Ham F-12 media til doble ønsket seeding tetthet (f.eks 20 x 10 6 celler / ml for en endelig konsentrasjon på 10 x 10 6 celler / ml etter innkapsling).
2. Chondrocyttransplantasjon-agarose Hydrogel Innkapsling
- Heat 0,8 g autoklavert type VII agarose i 20 ml sterilt 1x PBS (pH 7,4) på en varm plate innstilt på 120 ° C til det er oppløst. Når oppløst, senk varmen til 60 ° C som høyere temperaturer will påvirke celle levedyktighet.
- I en 50 ml konisk rør, grundig blande like volumer av cellesuspensjonen med dobbel den ønskede konsentrasjon av agarose (f.eks 4% agarose suspensjon for en endelig 2% agarose hydrogel). Unngå at det skapes store bobler som de kan påvirke cellenes levedyktighet og konstruere tretthet liv.
- Nøye alikvot 10 ml av kondrocytt-agarose blandingen i en 60 mm diameter Petriskål, og samtidig unngå dannelsen av store bobler.
- La stå i 30 minutter ved romtemperatur før gelled.
- Skåre så mange chondrocyttransplantasjon-agarose hydrogel prøvene som er nødvendig (vanligvis 20-30) med en 4 mm biopsi punch.
- Måle og registrere de fysiske dimensjonene (diameter og høyde) representative prøver ved hjelp av en mikrometer. Konstruerer bør være ca 5 mm i høyde, forkaste eventuelle prøver hentet fra en region hvor prøven høyden variansen var større enn 2%.
- Overføre prøvene til en frisk 60 mm petriskål og supplementmed 10 ml av komplette medier (f.eks 20% føtalt bovint serum i Ham F-12 dyrkningsmedium med 20 mM HEPES, 100 ug / ml askorbinsyre og 2x antibiotika / antimykotika).
3. Mekanisk stimulering og radiomerking av chondrocyttransplantasjon-agarose Hydrogeler
- Autoklavere de metalliske komponenter av komprimering riggen. Sterilisere plastkomponenter med 70% etanol (overnight) og UV-lys (minst 15 min).
- Å holde konstruerer bikker over, ved hjelp av tang, sted 12 sterile plast låseringene (med en indre diameter større enn den konstruktet diameter) (n = 6, prøver og kontroller) innenfor brønnene i en 24-brønns plate kultur.
- Bruke tang, nøye overføre kondrocytt-agarose hydrogeler fra petriskålen til 24-brønners plate, sikre hver en i en holdering.
- Overfør 400 ul av komplette medier (f.eks 20% FBS i Ham F-12 dyrkningsmedium med 20 mM HEPES, 100 pg / ml askorbinsyre, og2x antibiotika / antimykotika) til hver prøve godt.
- Monter sterilisert komprimering riggen (figur 1) og sikre platens med festeskruer. Fest komprimering riggen til 24-vel kultur plate.
- Slipp og re-sikre justeringsskruene å etablere platen-hydrogel kontakt (spenningsløse tilstand).
- Laste den monterte komprimering riggen til en Mach-1 mikromekanisk Testing System. Sikker rigg til den vertikale scenen via finne pin og lås på plass med settskrue. Fjern avstanden jiggen.
- Påfør dynamisk derfor belastningen på ønsket amplitude (f.eks 10% belastning amplitude basert på den opprinnelige høyde av prøvene), frekvens (f.eks 1 Hz) og varighet eller antall sykluser (f.eks tidsintervaller opptil 60 min).
- Ved ferdigstillelse av mekanisk stimulering, erstatte avstanden pilk, løsne finne pin set skruen og fjern komprimering riggen og kultur plate fra Mach-1 mikromekanisk Testing System. Radiomerkingen celle-hydrogel konstruerer ved supplering av mediet med 5 uCi av ønsket isotop (for eksempel [3H]-prolin protein etikett for kondrocytt-spesifikk kollagensyntesen og [35 S]-svovel for proteoglykan syntese).
- Inkuber radiomerkede konstruerer for 24 timer ved 37 ° C, CO 5% 2 10.
- Høste radiolabeled hydrogel konstruerer og skyll 3 ganger i 1x PBS (pH 7,4) for å fjerne eventuelle ikke-inkorporerte isotop. Digest prøver ved å bruke papain (40 ug / ml i 20 mM ammonium-acetat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic syre og 2 mM ditiotreitol ved 65 ° C i 72 timer).
- Analysen fordøye for DNA innhold med PicoGreen fargestoff analysen 11 og innarbeidet isotopen aktivitet, normalisert til DNA innhold etter β-væskescintillasjonstelling 12,13 umiddelbart etter papain fordøyelsen.
Merk: Kjøp og deponering av radioaktivt materiale (avfall isotoper og elementersom kan ha kommet i kontakt radioaktivt materiale) må følge relevante institusjonelle (og / eller statlig) retningslinjer og prosedyrer for sikker håndtering og disponering av radioaktive stoffer.
4. Representant Resultater
Bovine artikulære chondrocyttransplantasjon-agarose hydrogeler konstruerer (2% agarose med 10 x 10 6 celler / ml innkapslede celler) ble mekanisk stimulert med en amplitude på 10% compressive belastning ved en frekvens på 1 Hz i 20 til 60 min (eller 1.200 til 3.600 sykluser ) og analysert for DNA innhold og ekstracellulær matriks syntese etter radioisotop inkorporering. DNA og ekstracellulær matriks syntese ble påvirket i en dose-avhengig måte. DNA-innhold viste en betydelig 35% reduksjon som følge av 20 eller 30 minutter for stimulering (p <0,01), mens 60 min av stimulering viste ingen effekt (figur 2). Brusk-spesifikk kollagen og proteoglykan syntese (bestemt ved [3H]-prolin og[35 S]-svovel inkorporasjon, henholdsvis) oppviste betydelige økninger på ca 60% som respons på 20 eller 30 minutter for stimulering (p <0,01), med 60 min av stimulering oppviser noen observerbar effekt (figur 3).
. Figur 1 Skjematisk av spesialbygde dynamisk kompresjon rigg for å stimulere chondrocyttransplantasjon-agarose konstruerer Venstre:. Samlet riggen Høyre:. Sprengskisse viser enkeltkomponenter.
Figur 2. Endringer i DNA innhold av kondrocytt-agarose hydrogeler mekanisk stimulert under en 10% sammentrykkende belastning amplitude ved 1 Hz i 20 til 60 min (gjennomsnitt ± SEM, n = 6/group).
Figur 3. Endringer i ekstracellulær matriks syntese (kollagen og proteoglykaner) av kondrocytt-agarose hydrogeler mekanisk stimulert under 10% sammentrykkende belastning amplitude ved 1 Hz i 20 til 60 min (gjennomsnitt ± SEM, n = 6/group).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne fremgangsmåte for å anvende kontrollerte mekaniske stimuli til celle foret agarose hydrogeler tillater direkte undersøkelse på effekten av dynamiske trykkrefter på kondrocytt metabolisme. Bruken av den tilpassede-testing rigg i forbindelse med låseringene tilgjengelig sideveis begrensning for constructs å unngå potensielle problemer for utvalg tipping. Bruken av dødvekt-lasting platens sikret ved sett mannskaper sikrer direkte kontakt med konstruksjoner tross potensielle forskjeller i utvalget høyde. Radiomerking etter stimulering å måle cellulær biosyntesen reduserer potensialet for forurensning, slik at for en enkelt test rigg som skal benyttes for flere anvendelser av dynamiske mekaniske stimuli. Denne metoden kan enkelt tilpasses for å undersøke effekten av ulike mekanisk belastning moduser (f.eks skjær 1,4, spenning 1,2) eller å belyse konkrete mechanotransduction trasé ansvarlig.
ove_content "> De representative resultater illustrert at en liten mengde av celledød på ca 35% kan forekomme på grunn av anvendelsen av dynamiske stimulering, med lengre anvendelser av mekanisk stimulering ikke påvirker konstruere cellularitet 15-17. Biosyntese av ekstracellulære matrix makromolekyler, bestemmes av radioisotop innlemmelse, illustrert en varighet avhengig respons til dynamisk kompresjon. Anvendelser av dynamisk derfor belastningen for en periode på 20 til 30 min ga en maksimal respons med anabole lengre varigheter vises til å utløse en desensibilisering effekten til utskutte mekaniske stimuli. Cellular desensibilisering til mekanisk lasting har vært nevnt tidligere 1,2,5,13, men det har vært liten undersøkelse karakterisering av tidsavhengig natur dette fenomenet. Denne informasjonen kan brukes til å bestemme de optimale betingelser for å maksimere stimulering opphopning av ekstracellulær matrise med konstruere under gjentas, eller lang sikt, anvendelser av mekanisk stimulering.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
