Summary
Kondrositler tarafından kıkırdak ekstraselüler matriks biyosentezi mekanik uyaranlara uygulama etkilenebilir. Bu yöntem, 3D yapıları ve kondrosit metabolizması bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi kapsüllü kondrositler dinamik basınç suşların uygulama tekniği anlatılmaktadır.
Abstract
Mekanik hakaret veya osteoartrit gibi hastalıklar, tarafından bozulmuş hasar olduğunda Eklem kıkırdağı sınırlı bir tamir kapasitesi muzdarip. Bu eksikliği gidermek için, çeşitli tıbbi müdahaleler geliştirilmiştir. Böyle bir yöntem doku mühendisliği kıkırdak hasarlı bölgeye yeniden su yüzüne olduğunu, ancak mühendislik dokusu genellikle uzun vadeli beka sorgulayan, yerli kıkırdak biyokimyasal özellikleri ve dayanıklılık yoksun. Bu implant materyali korumak için çevre doku dayanarak, küçük odak hasarlarının onarımı için kıkırdak doku mühendisliği uygulaması sınırlar. Gelişmiş doku özelliklerini geliştirmek için, mekanik uyarı kıkırdak ekstraselüler matriksin sentezini gibi mühendislik dokusunun çıkan mekanik özelliklerini arttırmak için kullanılan bir popüler bir yöntemdir. Mekanik stimülasyon dokuya güçleri geçerlidir in vivo bu deneyimli benzer oluşturur. Bumekanik ortamı, kısmen doğal doku 1,2 geliştirme ve bakım düzenler fikrine dayanmaktadır. Kıkırdak doku mühendisliği mekanik stimülasyon en sık uygulanan biçimi 1 Hz 1,3 bir frekansta yaklaşık% 5-20 fizyolojik suşları dinamik sıkıştırma. Çeşitli çalışmalarda, dinamik sıkıştırma etkilerini araştırmış ve sonuçta geliştirilen doku 4-8 fonksiyonel özelliklerini etkileyen, kondrosit metabolizması ve biyosentezi üzerinde olumlu bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Bu yazıda, mekanik dinamik basınç altında kondrosit-agaroz hidrojel yapıları canlandırmak ve biyokimyasal ve radyoizotop testleri aracılığıyla biyosentezi değişiklikleri analiz yöntemini göstermek. Bu yöntem aynı zamanda kolayca mekanik uyarılara bir sonucu olarak hücresel tepki olarak herhangi bir potansiyel olarak bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi için modifiye edilebilir.
Protocol
1. İlköğretim Artiküler Kondositler İzolasyonu
Hayvan eklemlerin eklem yüzeyleri Hasat 10-15 tam kalınlıkta kıkırdak dilimleri (yerel Elazığ elde iskelet yapısı olgun ineklerin metakarpal-falangeal eklem gibi).
- 37 °, 2 saat boyunca Ham F-12 (w / v)% 0.5 proteaz, 20 ml içinde bir 100 mm Petri kabı ile inkübe ° C. il kıkırdak dilimleri Ham F-12, kültür ortamı içinde üç kez çalkalayın,% 0.15 collagenase, 20 ml ile bir gece boyunca inkübe 37 Ham'ın F-12 ° C'de kültür ortamı içinde bir
- Temiz bir tabak içine 200 mesh elek filtre yoluyla hücre süspansiyonu filtre. Ham F-12, 5 ml ile yıkanır ve filtre çanak ekleyin. 50 ml'lik bir konik tüpe hücre süspansiyonu aktarın. Ham F-12 10 ml Petri kabı yıkayın ve konik boru ekleyin.
- Oda sıcaklığında 6-8 dakika için 600-800 RCF tüp santrifüjleyin.
- Inci rahatsız etmemek sağlanması, süpernatant aspireE hücre pelet ve Ham F-12 kültür ortamı 40 ml yeniden askıya.
- 6-8 dakika için 600-800 RCF tüp santrifüjleyin.
- 3 kez toplam adımları 1.4 ve 1.5 iki kez daha tekrarlayın. Önce üçüncü kez santrifüj için, ajitasyon yoluyla pelet tekrar süspansiyon ve hücre sayımı için 500 ul kısım edinin.
- Bir hemasitometre ve ters ışık mikroskobu ile Tripan mavi dışlama yöntemi kullanılarak 9 canlı hücreleri saymak.
- Süpernatan aspire ve arzu edilen tohumlama yoğunluk ikiye katlamak için Ham'ın F-12 ortamı bir hacim içinde pelet yeniden askıya (örneğin, 20 x 10 x 10 10 6 hücre / kapsülleme sonra, ml bir nihai konsantrasyon için 6 hücre / ml).
2. Kondrosit-agaroz Hidrojel Kapsülleme
- Isı 0.8 g otoklavlanmış Tip VII agaroz çözülmüş ° C 'ye kadar 120 için ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde steril 1x PBS (pH 7.4), 20 ml. Bir kez çözüldü ° C daha yüksek sıcaklıklar 60 ısı düşürmek will hücre canlılığını etkileyebilir.
- 50 ml'lik konik bir tüp içinde, iyice agaroz (bir son% 2 agaroz hidrojel için örneğin% 4 agaroz süspansiyon) bir çift istenen konsantrasyonuna sahip hücre süspansiyonu eşit hacimde ilave edilir. Onlar hücre canlılığı etkilemez ve yorulma ömrü inşa edebilirsiniz gibi büyük baloncuklar oluşturma kaçının.
- Dikkatlice kısım 10, 60 mm çaplı Petri kabı içine kondrosit-agaroz karışımı ml, büyük baloncuklar oluşturma kaçınarak.
- Jel kadar oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
- Birçok kondrosit-agaroz hidrojel örnekleri olarak 4 mm biyopsi yumruk kullanarak (genellikle 20-30) gerektiği gibi edinin.
- Bir mikrometre kullanarak temsili numuneler fiziksel boyutları (çap ve yükseklik) ölçün ve kaydedin. Oluşumlar örnek yükseklik farkı% 2 den daha büyük olan bir bölgede elde edilen herhangi bir numune atmak, boyuna yaklaşık 5 mm olmalıdır.
- Taze bir 60 mm Petri kabı ve takviyesi için örnekler aktarıntam kültür ortamı 10 mL (20 mM HEPES, 100 ug / ml askorbik asit, ve 2 x antibiyotik / antimikotik ile Ham'ın F-12 ortamı içinde kültür örneğin,% 20 fetal inek serumu) ile.
3. Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik uyarılması ve radyoaktif
- Sıkıştırma teçhizat metalik bileşenler otoklavlayınız. % 70 etanol (gece boyunca) ve UV ışığı (en az 15 dakika boyunca) ile plastik bileşenler sterilize edin.
- 24 kuyu kültür plaka kuyu içinde yer 12 steril plastik tutma halkaları (yapı çapından daha büyük iç çapa sahip) (n = 6, örnekleri ve kontroller), üzerine düşen forseps kullanarak yapıları tutmak için.
- Forseps kullanarak, dikkatli bir emniyet halkası her biri emniyet, Petri çanak 24-plaka için kondrosit-agaroz hidrojeller aktarın.
- Tam kültür ortamı 400 ul (örneğin% 20, 20 mM Hepes, 100 ug / ml askorbik asit ile Ham'ın F-12 ortamı içinde kültür FBS, ve aktarmaSıra her bir örnek için) antibiyotik / antimikotik 2x.
- Sterilize sıkıştırma kulesi (Şekil 1) takın ve vida seti merdaneler sabitleyin. 24 oyuklu kültür plakasına sıkıştırma teçhizat takın.
- Merdane-hidrojel kontakt (sıfır gerilme durumu) kurmak için ayar vidalarını gevşetin ve tekrar sabitleyin.
- Bir Mach-1 Mikromekanik Test Sistemi içine monte sıkıştırma kulesi yükleyin. Ayar vidası ile yer bulma pin ve kilidi ile dikey sahneye Güvenli kulesi. Aralık jig çıkarın.
- Frekansı (örneğin 1 Hz) ve süresi veya devir sayısı (60 dk örneğin zaman aralıklarında kadar), istenen genlik (örneklerin orijinal yüksekliği esas örneğin% 10 gerinim genliği) dinamik basınç yükleme uygulayın.
- Mekanik stimülasyon tamamlanmasıyla, aralık jig yerini bulma pin seti vidasını gevşetin ve Mach-1 Mikromekanik Test Sistemi sıkıştırma teçhizat ve kültür plakasını çıkarın. Radiolabel hücre-hidrojeli arzu edilen izotop (kondrosit-özgü kolajen sentezi ve [35S]-kükürt proteoglikan sentezi için örneğin, [3 H]-prolin protein etiket) 5 μCi ile ortam ile takviye yapıları.
- 37. az 24 saat süre ile radyo işaretlenmiş yapıların inkübe ° C,% 5 2 10 CO.
- Radyoaktif işaretli hidrojel yapıları hasat etmek ve herhangi bir adi izotop kaldırmak için 1 x PBS (pH 7.4) içinde 3 kez yıkayın. Papain (20 mM amonyum asetat içinde 40 mg / ml, 65 mM 1 ethyldiaminetetraacetic asit ve 2 mM ditiotreitol ° C'de 72 saat süre ile) kullanılarak Digest örnekleri.
- PicoGreen boya deneyi 11 ve anonim izotop aktivite, 12,13 hemen aşağıdaki papain sindirim sayma β-sıvı sintilasyon ile, DNA içeriği normalize kullanarak DNA içeriği Testi özet.
Not: radyoaktif maddelerin alım ve atıkları (atık izotoplar ve ürüntemas radyoaktif maddeler haline gelmiş olabilir) (ve / veya hükümet) politikalarını ve radyoaktif maddelerin güvenli kullanımı ve imhası için prosedürler ilgili kurumsal izlemeniz gerekir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Sığır artiküler kondrosit-agaroz hidrojellerin yapıları (10 x 10 6 hücre / ml kapsüllü hücreleri ile% 2 agaroz) mekanik 20 ila 60 dakika (veya 1,200 3,600 devir için 1 Hz frekansında% 10 basınç gerilme bir genlikte uyarıldı ) ve radyoizotop kuruluş tarafından DNA içeriği ve ekstrasellüler matriks sentezini için tahlil. DNA sentezinin ve hücre dışı matriks doza bağımlı bir şekilde etkilenmiştir. Uyarım 60 dakika (Şekil 2) hiçbir etki göstermiştir, oysa DNA içeriği, uyarım 20 ya da 30 dakika (p <0.01) bir sonucu olarak önemli bir% 35 azalma sergiledi. Kıkırdak-özgü kollajen ve proteoglikan sentezi ([3H]-prolin ve tarafından belirlenirSırasıyla, [35S]-kükürt birleşme), gözlenebilir bir etki sergileyen uyarım 60 dk (Şekil 3) ile birlikte uyarım 20 ya da 30 dakika (p <0.01) cevap olarak yaklaşık% 60 arasında önemli bir artış göstermiştir.
. Kondrosit-agaroz yapıları teşvik etmek için özel olarak oluşturulmuş bir dinamik kompresyon kulesi Şekil 1 şematik Sol:. Montajlı kulesi Sağ:. Bireysel bileşenleri gösteren görünüm patlamış.
Kondrosit-agaroz DNA içeriğinin Şekil 2. Değişiklikler mekanik olarak 20-60 dakika için 1 Hz,% 10 kompresif gerginlik genlik (ortalama ± SEM, n = 6/group ortalama) altında uyarılan hidrojellerin.
Kondrosit-agaroz ekstrasellüler matriks sentezi (kolajen ve proteoglikanlar) Şekil 3. Değişiklikler mekanik 20 ila 60 dakika (± SEM, n = 6/group demek) için 1 Hz'de% 10 basınç gerilme genliği altında uyarılmış hidrojellerin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre-seeded agaroz hidrojeller için kontrollü mekanik uyaranlara uygulamak için açıklanan yönteme kondrosit metabolizması üzerinde dinamik basınç kuvvetlerinin etkileri içine doğrudan soruşturma için izin verir. Istinat halkalar ile birlikte özel test teçhizat kullanımı örnek devrilme potansiyel sorunları önlemek için yapıları için yanal kısıtlaması sağlanır. Setleri ekipleri tarafından güvenli ölü ağırlıklı yükleme plakaları kullanımı örnek yüksekliği potansiyel farklılıklara rağmen yapıları ile doğrudan temas sağlar. Hücresel biyosentez dinamik mekanik uyaranlara çoklu uygulamalar için kullanılmak üzere tek bir test kulesi için izin, kirlenme olasılığını azaltır ölçmek için post-stimülasyon Radiolabeling. Bu yöntem kolaylıkla farklı mekanik yükleme modu (örn. makaslama 1,4, gerginlik 1,2) etkisini araştırmak için veya belirli mechanotransduction sorumlu yollarının aydınlatılması adapte edilebilir.
ove_content "> temsil eden sonuçlar, yaklaşık% 35 hücre ölümüne az miktarda bir yapı sellüler 15-17 etkilemeyen mekanik uyarı daha uzun uygulama ile dinamik uyarım uygulama nedeniyle oluşabilir olduğunu göstermiştir. ekstraselüler matriks Makromoleküllerin biyosentezi ile belirlenir, radyoizotop şirketleşme, dinamik kompresyon bir süre bağımlı yanıtı gösterilmektedir. 20 ila 30 dakika süreyle dinamik basınç yükleme Uygulamaları dayatılan mekanik uyarana bir duyarsızlaştırma etkisi ortaya çıkarmak için görünen daha uzun süreler ile maksimal anabolik yanıt sonuçlandı. Hücresel duyarsızlaştırma mekanik Yükleme önceden 1,2,5,13 belirtildiği gibi, ancak bu fenomenlerin zaman bağımlı ilgili özelliklerin içine küçük bir araştırma yapılmamıştır. Bu bilgiler ile birlikte hücre dışı matris birikimi en üst düzeye çıkarmak için optimum uyarım koşulları belirlemek için kullanılabilirler unde inşar tekrarlanan veya uzun süreli mekanik stimülasyon uygulamaları.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
