Summary
פרוטוקול פשוט להכנת תמציות של רקמה אנושית שתשמש כמקור לאנטיגנים במבחנים תפקודיים תא T מתואר. שיטה זו מאפשרת תגובות תא T לאנטיגנים המופקים מרקמות כדי להימדד
Abstract
רבים מיעדי אנטיגן של תגובה חיסונית אדפטיבית, המוכרים על ידי תאי T, B ולא הוגדרו 1. זה נכון במיוחד במחל אוטואימוניות וסרטן 2. המטרה שלנו היא לחקור את האנטיגנים מוכרים על ידי תאי T אנושיים בסוג המחלה אוטואימונית 1 הסוכרת 1,3,4,5. כדי לנתח את התגובות אנושיות תא T נגד רקמות שבו אנטיגנים המוכרים על ידי תאי T אינם מזוהים פתחנו שיטה לחילוץ אנטיגנים חלבון מרקמה אנושית בתבנית תואמת עם מבחנים תפקודיים 6. תגובות בעבר, תאים-T לתמציות רקמות unpurified לא ניתן היו למדוד, משום ששיטות החילוץ להניב lysate שהכיל חומרי ניקוי שהיו רעילים לתאי דם היקפי אדם mononuclear. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ חלבונים מרקמות אדם בתבנית שאינה רעיל לתאי T אנושיים. רקמת homogenized בתערובת של, אצטוניטריל butan-1-ol וואטאה (Baw). ריכוז החלבון בתמצית הרקמה נמדד ומסה ידועה של חלבון aliquoted לתוך צינורות. לאחר חילוץ, הממסים האורגניים יוסרו על ידי lyophilization. תמציות רקמות Lyophilized ניתן לאחסן עד נדרשים. לשימוש במבחנים של תפקוד מערכת חיסוני, השעיה של תאי חיסון, בתקשורת התרבות המתאימה, ניתן להוסיף ישירות לתמצית lyophilized. ייצור ציטוקינים ושגשוג על ידי PBMC, בתגובה לתמציות שהוכנו באמצעות שיטה זו, נמדדו בקלות. לפיכך, השיטה שלנו מאפשרת הכנה המהירה של lysates רקמות האנושיים שיכול לשמש כמקור לאנטיגנים בניתוח של תגובות תא T. אנו ממליצים כי שיטה זו תאפשר הניתוח של תגובות חיסוניות מסתגלות לרקמות בהשתלה, סרטן והתפתחות מחלה.
Protocol
1. הכנת רקמת טחול
- ההערה, כל החומר האנושי יש להתייחס כאל פוטנציאל מדבק וכל ההליכים צריכים להתנהל בקבינט זרימה למינרית שנייה ייצוגי. בעזרת מספריים ומלקחיים סטריליים, הסרת רקמת שומן וסיבית מסעיפי טחול (~ 1-2 סנטימטר בגודל) וחתוך אותו במידה של חומר הכמוסה החיצוני ככל האפשר.
- לחתוך חתיכה קטנה (1-2 סנטימטר 3) של רקמת טחול ולמקם את כל חתיכה לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל פלקון.
- Snap-להקפיא את החתיכות של רקמות על ידי טבילה בנוזל N 2.
- חנות ב -80 ° C. פרוטוקול דומה מתאים לרקמות אחרות (הים).
2. הכנת איילט אנוש לאחסון
- איוני תרבות בתקשורת CMRL. איסוף איונים בצינור תחתון 10 מיליליטר חרוטים ולשטוף פעמים ב PBS על ידי צנטריפוגה בסל"ד 1500 למשך 5 דקות. יוצק את PBS ולנקז את החיץ שיורית על ידי נחת הצינור ההפוך בקצרה על מגבת נייר. היזהר שלאכדי לסלק את האיים.
- ברגע שמרוקן, מחדש כובע צינור ונצמד הקפאה בחנקן נוזלי ובחנות -80 ° C.
3. הכנת תמצית
- הכן Baw תמהיל (10:30:60% v / v) וחנות ב 4 ° C.
- הסר את הצינור מ-80 ° C. להפשיר בטמפרטורת חדר.
- הוסף Baw מספיק קרה כקרח כדי לכסות את פיסת הרקמה. לאיים להשתמש 3-5 מ"ל. לרקמת טחול להשתמש 10-20 מ"ל תלוי בגודל של פיסת הרקמה.
- להרכיב homogenizer הרקמות. נקה ידי 'מאחד' 10-20 מ"ל של אתנול 70% / מים.
- הומוגני הרקמה בצרורות מרובות, לאחר ביצוע בדיקת homogenizer לתוך הצינור עם פתרון Baw רקמות ו. לשמור על הצינור בדלי קרח לאחר מכן.
- לנקות ביסודיות homogenizer בין דגימות, על ידי מאחד 10-20 מ"ל של אתנול 70% / מים ולאחר מכן חיץ Baw. זה מונע זיהום צולב של רקמה בין samples.Dismantleand נקי עם אתנול 70% / מים אחרינודואר.
- אם תמצית מכילה חומר מסיס רק נדרשה, חובצה את תמצית רקמה הומוגני ב4000 סל"ד בRT למשך 10 דקות. אם תמצית גולמית יותר נדרשת, להסתובב בסל"ד 1000 בRT למשך 5 דקות. הטכניקה המתאימה ביותר לחילוץ החלבונים Baw המסיס תלויה בניתוח במורד הזרם של החלבונים. לשימוש במבחנים אימונולוגיים פונקציונליים אנחנו היינו מציעים שננסה לפרק את החלק המסיס באוריאת ז 8 כפי שמצאנו בעבר זה להיות נסבל היטב 6.
- העברת supernatant לצינור נקי ולשים אותו על קרח.
- לקבוע את הריכוז של חלבון בתמצית באמצעות assay BCA או דומה.
4. הקפא תמציות ייבוש
- בהתאם המסה של חלבון הנדרש (כלומר, 100 מיקרוגרם לצינור), לדלל את homogenate בהתאם ולוותר aliquots ל5.0 כותרת המ"ל סטרילי, פלקון (12x75 מ"מ) צינורות. לעתים קרובות אנו משתמשים ב100 מיקרוגרם / צינור.
- השתמש 1מחט סטרילית 8-20 מד מזרק לעשות 3 חורים בכובע של כל צינור.
- הקפא צינורות או על ידי הצבתן בקרח יבש ל~ 10 דקות או במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך> 1 שעה. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשים על lyophilizer.
- לעבור על הקפאה יבשה יותר ומאפשר לאזן (-100 ° C). זה לוקח בערך 30 דקות.
- בהתאם לנפח, ייבוש בהקפאה יכול להסתיים בתוך 3 שעות אבל באופן שגרתי להשאיר הדגימות שלנו בן לילה.
- לאחר סיומו של מחזור הייבוש, לכבות משאבת ואקום ולאפשר לחץ לאט לאט אל תוך החדר. הסר מדף.
- במכסת מנוע סטרילי, להסיר את המכסים המחוררים מהצינורות ולהחליף בחדשים (פלקון 352032).
- צינורות חנות ב -20 ° C. דוגמאות ניתן לשחזר בתרבית, או חוצצים אחרים, ולהשתמש בפונקציה או מבחנים ביוכימיים.
5. נציג תוצאות
איור 1 מציג את ההכתמה של חלבוןנטען ג'ל עם תמצית מרקמת לבלב מדולדל איון (שכותרת acinar) טחול ומטוהרים ואיי איוני אדם (שכותרת). התוצאות מראות ייצוג טוב של חלבונים בעלי משקל מולקולרי שונה לכל רקמות.
הקיבולת של תמציות רקמה כדי לעורר שגשוג תאי T אנושי נבדקה באמצעות assay CFSE מבוסס התפשטות 7 (איור 2). PBMC משמש assay זה בודד מאדם עם סוכרת מסוג 1. עוצמת התגובה מתבטאת כיחס בין מספר תאים עמומים CFSE ל5000 CD4 +, תאי CFSE בהירים ללא אנטיגן: תאים עמומים CFSE ל5000 CD4 +, תאים בהירים CFSE עם האנטיגן מדגימות שלושה עותקים 7. התוצאות מראות חלשה, אבל, ריבוי זיהוי בתגובה לacinar (CD1 = 3.5) ותגובה חזקה לתמצית איון (6.8). נגיף שפעת מומת (CDI = 142.6) כלול כביקורת חיובית.
איור 1. ג'ל חלבון.
איור 2. תוצאות מבדיקת תפוצה CFSE מבוססת נגד acinar ותמצית איון. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה פותח בגלל שרצינו להפיק תמצית מרקמה האנושית שהייתה חופשי מכימיקלים רעילים כגון חומרי ניקוי. באופן ספציפי יש לנו השתמשנו בו כדי להכין תמצית של רקמה האנושית שניתן להשתמש במבחנים של תפקוד מערכת חיסון של אדם במבחנה. תמציות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה באותה מידה יכולה להיות מחדש בכל מאגר ומשמשות לניתוחים ביוכימיים רבים, כגון כרומטוגרפיה סופגת מערבית או בנוזל. זה עושה את הטכניקה המתאימה ליישומים רבים במורד זרם הזה.
שימוש בפרוטוקול שלנו התגובה לתמציות רקמה אינה חזקה. זה צפוי כי אנחנו מחפשים תשובות לאנטיגנים "עצמיים", ובמקרה שלנו תגובות תאי T כנגד אנטיגנים איון הן לעתים קרובות חלשות 1. בעבר נמצאנו כי סוג CD4 + אדם T תגובות תא לרקומביננטי proinsulin וdecarboxylase חומצה גלוטמית (GAD), אנטיגנים עצמי בסוכרת מהסוג 1, ניתן היה לזהות באמצעות מבוסס CFSEassay התפשטות 7,8. אנו בחרנו להשתמש בתמציות רקמה כדי להימנע מבעיות הקשורות לשימוש בפפטידים סינטטיים 9 וחלבונים רקומביננטיים 10.
אנחנו לא גרים, מוסיפים מעכבי פרוטאז לעקירות שלנו. נוכחותם של מעכבי פרוטאז עלולה לעכב עיבוד אנטיגן ומצגת 11 וכתוצאה מכך לעכב תגובות תא T. במקום זאת, אנו מבצעים חילוץ על קרח בניסיון למנוע הידרדרות פרוטאז בתיווך. עבור יישומים אחרים של הכללת מעכבי פרוטאז עשויה להיות מועילה אם פירוק חלבונים הוא בעיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהבריאות האוסטרלית הלאומיות והמועצה למחקר רפואי (NHMRC # 559007) וסוכרת נעורי Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) ותכנית התשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. אנו מודים לחברי צוות טום מנדל איילט להשתלות תכנית איילט הבידוד למתן רקמות האדם. רקמות אדם נאספו ושימוש באישור אתי מקומי (בית חולי סנט וינסנט HREC-הבריאות של סנט וינסנט 011/04 וHREC-135/08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
