Summary
一个简单的协议，用于制备的人体组织的提取物被用作功能性T细胞分析中的源的抗原进行说明。此方法允许要被测量的组织来源的抗原的T细胞的反应，以
Abstract
许多的适应性免疫反应的抗原的目标，已确认由B细胞和T细胞，还没有被定义1。这是特别真实的，在自身免疫性疾病和癌症的2。我们的目的是研究人类T细胞识别的抗原的自身免疫性疾病，1型糖尿病患者1,3,4,5。来分析人体T-细胞的反应，对其中没有确定T细胞所识别的抗原的组织中，我们开发了一种方法来提取蛋白质抗原从人类组织中的格式是兼容的功能分析6。无法测量，因为在此之前，T细胞的反应，未纯化的组织提取物的提取方法产生的裂解物，所含的清洁剂对人体外周血单个核细胞是有毒的。在这里，我们描述一个协议，用于人类T细胞没有毒性的格式是从人体组织中提取蛋白质。该组织均化的混合物中的丁-1 - 醇，乙腈和笏ER（BAW）。的组织提取物中的蛋白质浓度的测定，和公知的蛋白质的质量分装到管。提取后，将有机溶剂，通过冷冻干燥除去。冻干组织提取物被保存，直到需要。用于检测免疫功能，免疫细胞的悬浮液中，在适当的培养介质中，可以直接添加到冻干提取物。外周血单个核细胞的细胞因子的产生及细胞增殖，在响应于用此方法制备的提取物，很容易测定。因此，我们的方法可以作为一个源的抗原的T细胞应答的分析，可用于人体组织裂解物的迅速地制备。我们认为，这种方法将有助于分析适应性免疫反应的组织移植，癌症和自身免疫。
Protocol
1。准备脾组织
- 注意 - 所有的人力物力应被视为潜在的传染性，所有程序都必须在II级层流柜进行。用无菌剪刀和镊子，从的脾部分（约1-2厘米大小），并修剪掉尽可能多的外包膜材料尽可能消除脂肪和纤维组织。
- 切一小片（1-2厘米）的脾组织，并把每一块成为一个无菌的50毫升Falcon管。
- 捕捉冻结的组织浸泡在液体中N 2。
- 贮存于-80℃。一个类似的协议是适用于其他组织（S）。
2。人类胰岛存储准备
- 文化小岛CMRL媒体。收藏报错胰岛在10毫升的锥形底部管，并通过在1,500 rpm下离心5分钟，在PBS中洗两次。倒出PBS和简要纸巾上放置的倒管排出的剩余的缓冲区。请注意，不要打跑了小岛。
- 一旦倒掉，重新盖上管，液态氮和存储卡冻结在-80°C。
3。准备提取物
- 准备BAW（10:30:60％V / V）混合，储存于4°C。
- 取下管子从-80°C。在室温下解冻。
- 添加足够的冰冷的BAW覆盖片组织。小岛使用3-5毫升。对于脾组织片组织的大小取决于使用10-20毫升。
- 装配的组织匀浆。由'均质'10-20毫升的70％乙醇/水进行清洁。
- 均质化的组织在多个脉冲串，后到管放置在匀化器探针，与组织和BAW溶液。此后保持管在冰 - 铲斗。
- 彻底清洁样品之间的均化器，均质化10〜20毫升的70％乙醇/水，然后BAW缓冲区。这可以防止交叉污染的组织之间samples.Dismantleand干净后，用70％乙醇/水我们E。
- 是必需的，如果仅含有水溶性材料的提取物离心匀浆组织提取物在RT下在4,000 rpm，10分钟。如果更粗提物是必需的，在RT下以1,000 rpm旋转5分钟。用于提取的BAW不溶性蛋白质的最合适的方法取决于下游分析的蛋白质。对于使用的功能的免疫学测定方法中，我们建议尝试在8M脲溶解不溶性成分，因为我们先前已经发现这是很好的耐受性6。
- 上清转移到一个干净的试管，并把它放在冰。
- 确定使用的BCA测定法或类似的提取物中的蛋白质浓度。
4。冷冻干燥提取物
- 根据蛋白质所需的质量（ 即 100微克每管），相应的稀释匀浆，并免除取到标有“5.0毫升无菌，猎鹰（12x75毫米）管。我们经常使用的100微克/管。
- 使用一个18-20号无菌注射器针头，使每个管帽的3个孔。
- 或者通过将它们放置〜10分钟，或> 1小时，在-80℃的冰箱中，在干冰上冷冻管。储存在-80°C至准备把冻干机。
- 切换冷冻干燥器上，并允许平衡（-100℃）。这需要大约30分钟。
- 视音量而定，冷冻干燥，可以在3小时内完成，但我们经常离开我们的样本中过夜。
- 在干燥循环完成后，关闭真空泵和慢慢允许进入腔室的压力。卸下机架上。
- 在无菌罩，取出穿孔的上限从管，并更换新的（猎鹰352032）。
- 于-20℃下存储管样品可重新溶解在培养基中，或其他缓冲液，用于在功能上或生化分析。
5。代表性的成果
图1示出的一种蛋白质的染色凝胶装载，与脾脏提取物和胰岛耗尽胰腺组织（腺泡）和纯化的人胰岛（标记小岛）。结果显示，不同分子量的蛋白质为每一个组织良好的代表性。
的组织提取物刺激人类T-细胞增殖的能力，使用的CFSE基于增殖试验7（ 图2）进行了测试。在该测定中使用的PBMC中分离出从个人与1型糖尿病。 CFSE 昏暗每5,000 CD4 +，CFSE明亮的细胞没有细胞抗原的数量的比例的幅度响应表示为：CFSE 昏暗的细胞每5000 CD4 +，CFSE明亮的细胞与抗原一式三份样品7。结果表明弱，但检测，增殖腺泡（CD1 = 3.5）和更强的反应胰岛提取物（6.8）。作为流感病毒灭活（CDI = 142.6）阳性对照。
图1。蛋白质凝胶。
图2。从CFSE增殖实验对腺泡细胞和胰岛提取物的结果。 点击此处查看大图 。
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Discussion
此协议是因为我们想生成人体组织是免费的，如清洁剂有毒化学品的提取物。具体来说，我们已经用它来 制备人体组织的提取物，可用于检测在体外人体免疫功能。使用该协议制备的提取物可以同样在任何缓冲器重新配制，并用于许多生化分析，如蛋白质印迹法或液相色谱法。这使得该技术适用于许多下游应用。
使用我们的协议中，组织提取物的反应并不强烈。这是意料之中的，因为我们正在寻找“自我”抗原的反应，在我们的例子中，T-细胞对胰岛抗原常常是弱1。在此之前，我们发现，人类CD4 + T细胞对重组胰岛素和谷氨酸脱羧酶（GAD），1型糖尿病的自身抗原，可以使用我们的CFSE检测增殖实验7,8。我们选择使用组织提取物，以避免出现问题，与用合成肽和重组蛋白10。
我们不经常添加蛋白酶抑制剂的提取。蛋白酶抑制剂的存在下，可能会抑制抗原加工和呈递11，因此抑制的T细胞应答。相反，我们在冰上进行提取，企图阻止蛋白酶介导的降解。对于其它应用，包含蛋白酶抑制剂蛋白质的降解可能是有益的，如果是一个问题。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是从澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC＃559007）和青少年糖尿病研究基金会（JDRF 4-2006-1025）和经营性基础设施计划，维多利亚州政府的拨款支持。我们感谢汤姆·曼德尔胰岛移植计划胰岛分离团队成员提供人体组织。收集和使用人体组织与当地的伦理批准（圣文森特医院HREC-A 011/04和圣文森的健康HREC-A 135/08）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
