Summary
Een eenvoudige protocol voor het bereiden van extracten van menselijke weefsels worden gebruikt als bron van antigenen in functionele T-cel-assays beschreven. Deze methode laat T-cel responsen op weefsel afgeleide antigenen te meten
Abstract
Veel antigen doelstellingen van adaptieve immuunrespons, die door B en T cellen, niet gedefinieerd 1. Dit geldt met name voor auto-immuunziekten en kanker 2. Ons doel is het onderzoeken van de antigenen herkend door menselijke T-cellen in de autoimmuunziekte type 1 diabetes 1,3,4,5. De menselijke T-cel responsen te analyseren tegen weefsel waar de antigenen herkend door T cellen worden geïdentificeerd we een methode ontwikkeld om eiwitantigenen onttrekken menselijk weefsel in een formaat dat compatibel is met functionele assays 6. Voorheen T-cel responsen op ongezuiverde weefselextracten kon niet gemeten worden omdat de extractiemethoden opleveren lysaat vervat detergentia die toxisch voor menselijke perifere mononucleaire bloedcellen. Hier beschrijven we een protocol voor het extraheren van eiwitten uit menselijk weefsel in een formaat dat niet toxisch is voor humane T-cellen. Het weefsel wordt gehomogeniseerd in een mengsel van butaan-1-ol, acetonitril en water (BAW). De eiwitconcentratie in het weefsel extract wordt gemeten en een bekende massa eiwit verdeeld in buizen. Na extractie wordt de organische oplosmiddelen verwijderd door lyofilisatie. Gevriesdroogd weefselextracten kan worden opgeslagen tot zij nodig zijn. Voor gebruik in assays van de immuunfunctie, een suspensie van immuuncellen, in geschikte kweekmedia, direct kan worden toegevoegd om het gevriesdroogde extract. Cytokineproductie en proliferatie van PBMC als reactie op extracten bereid met deze methode, werden gemakkelijk gemeten. Vandaar onze werkwijze maakt de snelle bereiding van menselijk weefsel lysaten die kunnen worden gebruikt als bron van antigenen in de analyse van T-cel responsen. We suggereren dat deze methode de analyse van adaptieve immuunrespons vergemakkelijken weefsel bij transplantatie, kanker en auto-immuniteit.
Protocol
1. Voorbereiden miltweefsel
- Opmerking-alle menselijke materiaal moet worden behandeld als mogelijk infectieus en alle procedures moeten worden uitgevoerd in een klasse II Laminar Flow kabinet. Met steriele schaar en forceps, verwijder vet en bindweefsel van miltsecties (~ 1-2 cm in grootte) en afsnijden zoveel van de buitenste capsule mogelijk materiaal.
- Snij een klein stukje (1-2 cm 3) van de milt weefsel en plaats elk stuk in een steriele 50 ml Falcon buis.
- De stukjes weefsel snap invriezen door onderdompeling in vloeibare N2.
- Bewaren bij -80 ° C. Een soortgelijk protocol geschikt voor andere weefsel (s).
2. Voorbereiding Human Islet voor opslag
- Cultuur eilandjes in CMRL media. Verzamel eilandjes in een 10 ml conische bodem buis en wassen in PBS tweemaal door centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Giet de PBS-en afvoer van de resterende buffer door het plaatsen van de omgekeerde buis kort op een papieren handdoek. Zorg dat er geende eilandjes verwijderen.
- Zodra afgevoerd, re-cap de buis en snap-vries in vloeibare stikstof en bij -80 ° C.
3. Voorbereiden Extract
- Bereid BAW mix (10:30:60% v / v) en bewaar bij 4 ° C.
- Haal de buis uit -80 ° C. Ontdooien bij kamertemperatuur.
- Voeg voldoende ijskoude BAW het stuk van weefsel te dekken. Voor gebruik eilandjes 3-5 ml. Voor miltweefsel gebruiken 10-20 ml afhankelijk van de grootte van het stuk weefsel.
- Monteer het weefsel homogenisator. Clean van 'homogeniseren' 10-20 ml 70% ethanol / water.
- Homogeniseer het weefsel in verschillende bursts, na plaatsing van de homogenisator probe in de buis met het weefsel en BAW oplossing. Houd de buis in een ijs-emmer daarna.
- Reinig de homogenisator tussen de monsters, door het homogeniseren van 10-20 ml 70% ethanol / water en dan BAW buffer. Dit voorkomt kruisbesmetting van weefsel tussen samples.Dismantleand schoon met 70% ethanol / water na onse.
- Als een extract dat alleen oplosbaar materiaal nodig, gehomogeniseerd weefsel extract centrifuge bij 4.000 rpm bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Als een ruwe extract nodig, draaien bij 1000 rpm bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. De meest geschikte techniek voor de extractie BAW onoplosbare eiwitten afhankelijk van de stroomafwaarts analyse van de eiwitten. Voor functionele immunologische assays we stel probeert de onoplosbare fractie te lossen in 8 M ureum zoals we eerder vonden dit goed verdragen 6.
- Breng supernatant naar een schone buis en zet hem op ijs.
- De concentratie van proteïne in het extract met een BCA assay of dergelijke.
4. Freeze Drying Extracten
- Afhankelijk van de hoeveelheid benodigde eiwit (dat wil zeggen 100 ug per buis) dienovereenkomstig verdunnen homogenaat en breng aliquots in gelabelde 5,0 ml steriele Falcon (12x75 mm) buizen. We gebruiken vaak 100 ug / buis.
- Gebruik een 18 tot 20 gauge steriele naald van de spuit tot 3 gaten in de dop van elke buis.
- Hetzij bevriezen buizen door ze op droog ijs ~ 10 min of in een -80 ° C vriezer> 1 uur. Bewaren bij -80 ° C tot klaar te zetten op de vriesdroger.
- Schakel vriesdroger om de temperatuur (-100 ° C). Dit duurt ongeveer 30 minuten.
- Afhankelijk van het volume, kan vriesdrogen worden voltooid binnen 3 uur, maar we regelmatig 's nachts laten onze monsters.
- Na afloop van de droogcyclus, schakel vacuümpomp en langzaam de druk toe in de kamer. Verwijder rek.
- In een steriele kap, verwijder dan de geperforeerde doppen van de tubes en vervangen door nieuwe (Falcon 352.032).
- Store buizen bij -20 ° C. Monsters kunnen worden gereconstitueerd in kweekmedia of andere buffers, en gebruikt in functie of biochemische assays.
5. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont de kleuring van een eiwitgel geladen met extract van de milt en de eilandjes uitgeput alvleesklierweefsel (gelabeld acinaire) en gezuiverd humaan eilandjes (met het label eilandjes). De resultaten tonen een goede representatie van eiwitten van verschillende molecuulgewicht voor elk weefseltype.
De capaciteit van weefselextracten menselijke T-celproliferatie te stimuleren werd getest met een CFSE-gebaseerde proliferatie assay 7 (figuur 2). De PBMC die in deze assay werden geïsoleerd uit een individu met type 1 diabetes. De omvang van de respons wordt uitgedrukt als een verhouding van het aantal cellen per CFSE dim 5000 CD4 +, CFSE heldere cellen zonder antigen: of CFSE dim cellen per 5000 CD4 +, CFSE heldere cellen met antigeen uit drievoudige monsters 7. De resultaten laten een zwakke, maar detecteerbare, proliferatie in reactie op acinar (CD1 = 3.5) en een sterkere reactie op islet extract (6,8). Geïnactiveerd influenza virus (CDI = 142,6) is als eenpositieve controle.
Figuur 1. Protein gel.
Figuur 2. Resultaten van een CFSE-gebaseerde proliferatietest tegen acinaire en eilandje extract. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld, omdat we wilden een uittreksel uit menselijk weefsel dat was vrij van giftige chemicaliën zoals wasmiddelen te genereren. Specifiek hebben we gebruikt om extracten van humane weefsels die kunnen worden gebruikt in assays van menselijke immuunsysteem in vitro bereiden. Extracten bereid met dit protocol kan ook worden opgelost in een buffer en voor vele biochemische analyses, zoals Western blotting of vloeistofchromatografie. Dit maakt deze techniek voor vele verdere toepassingen.
Met behulp van ons protocol de reactie op weefsel extracten zijn niet sterk. Dit zal naar verwachting, omdat we zijn op zoek naar antwoorden op 'zelf' antigenen, in ons geval T-cel responsen tegen eilandje antigenen zijn vaak zwak 1. Eerder vonden we dat menselijke CD4 + T-cel respons op recombinant pro-insuline en glutaminezuur decarboxylase (GAD), autoantigenen bij type 1 diabetes, worden gedetecteerd met onze CFSE gebaseerdeproliferatietest 7,8. We hebben gekozen weefselextracten gebruiken wordt geconfronteerd met synthetische peptiden en recombinante eiwitten 9 10 voorkomen.
We hebben geen routinematig toe te voegen proteaseremmers aan onze extracties. De aanwezigheid van proteaseremmers kunnen remmen antigen verwerking en presentatie 11 en vervolgens remmen T-cel responsen. Plaats voeren we de extractie op ijs in een poging om protease-gemedieerde afbraak voorkomen. Voor andere toepassingen de toevoeging van protease remmers nuttig zijn als eiwitafbraak een probleem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) en de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) en de operationele infrastructuur Regeling van de Victoriaanse regering. Wij danken de leden van de Tom Mandel Islet Transplantation Programma Islet Isolatie Team voor het verstrekken van de menselijke weefsels. Menselijke weefsels werden verzameld en gebruikt met de lokale ethische goedkeuring (St. Vincent's Hospital HREC-A 011/04 en St. Vincent's Health HREC-A 135/08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
