Summary
Ein einfaches Protokoll zur Herstellung von menschlichem Gewebe-Extrakten, die als Quelle von Antigenen in funktioneller T-Zell-Assays verwendet werden beschrieben. Diese Methode ermöglicht es T-Zellen-Reaktionen auf Gewebe stammenden Antigenen zu messenden
Abstract
Viele der Antigen-Targets der adaptiven Immunantwort, durch B-und T-Zellen erkannt wird, wurden nicht 1 definiert. Dies gilt insbesondere bei Autoimmunerkrankungen und Krebs 2. Unser Ziel ist es, die Antigene von menschlichen T-Zellen in der Autoimmunerkrankung Typ-1-Diabetes 1,3,4,5 erkannt zu untersuchen. Die menschliche T-Zell-Antworten gegen Gewebe, wo die Antigene durch T-Zellen erkannt werden nicht identifiziert analysieren wir ein Verfahren entwickelt, um Protein-Antigenen aus humanem Gewebe in einem Format, das kompatibel mit funktionellen Assays 6 ist extrahieren. Zuvor T-Zell-Antworten auf ungereinigten Gewebeextrakten konnte nicht gemessen werden, da die Extraktions-Verfahren liefern ein Lysat, daß Waschmittel, die toxisch für humane periphere mononukleare Zellen enthalten sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus humanen Geweben in einem Format, das nicht toxisch für humane T-Zellen. Das Gewebe wird in einem Gemisch aus Butan-1-ol, Acetonitril und homogenisiert water (BAW). Die Proteinkonzentration in der Gewebeextrakt gemessen wird und ein bekannter Masse von Protein wird in Röhrchen aliquotiert. Nach der Extraktion werden die organischen Lösungsmittel durch Lyophilisierung entfernt. Lyophilisierte Gewebeextrakten gespeichert, bis sie benötigt werden. Zur Verwendung in Tests der Immunfunktion eine Suspension von Immunzellen in geeigneten Kulturmedien, kann direkt an die lyophilisierte Extrakt zugesetzt werden. Proliferation und Zytokin-Produktion durch PBMC in Reaktion auf Extrakte hergestellt unter Verwendung dieses Verfahrens wurden leicht gemessen. Daher ermöglicht unser Verfahren die rasche Herstellung von menschlichem Gewebe-Lysaten, die als Quelle von Antigenen bei der Analyse der T-Zell-Reaktionen verwendet werden kann. Wir schlagen vor, dass diese Methode die Analyse der adaptiven Immunantwort auf Gewebe in der Transplantationsmedizin, Krebs und Autoimmunität erleichtern.
Protocol
Ein. Vorbereiten Milzgewebe
- Hinweis-all menschlichem Material sollten als potenziell infektiös und alle Verfahren sollten in einer Klasse II Laminar Flow Cabinet durchgeführt werden behandelt werden. Verwendung steriler Schere und Pinzette Fett und Bindegewebe aus Milz Abschnitte (~ 1-2 cm groß) und schneiden Sie so viel von der äußeren Kapsel Material wie möglich.
- Schneiden Sie ein kleines Stück (1-2 cm 3) von Milzgewebe und platzieren Sie jedes Stück in einem sterilen 50 ml-Falcon-Röhrchen.
- Snap-frieren die Gewebestücke durch Eintauchen in flüssigen N 2.
- Lagerung bei -80 ° C. Ein ähnliches Protokoll ist für andere Gewebe (n).
2. Herstellung von Human Islet für Storage
- Kultur Inseln in CMRL Medien. Sammle Inselchen in einem 10 ml konischen Boden Rohr und waschen zweimal in PBS durch Zentrifugation bei 1.500 rpm für 5 min. Abgießen, PBS und lassen Sie das restliche Puffer, indem das invertierte Rohr kurz auf einem Papiertuch. Achten Sie darauf,um die Inseln zu vertreiben.
- Nach dem Abtropfen, re-cap die Röhre und Snap-freeze in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C.
3. Vorbereiten Extract
- Bereiten BAW-Mix (10:30:60% v / v) und bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Schlauch von -80 ° C. Bei Raumtemperatur auftauen.
- Ausreichend eiskalten BAW, um das Stück von Gewebe zu decken. Für Inselchen verwenden 3-5 ml. Für Milzgewebe verwenden 10-20 ml je nach Größe des Stückes von Gewebe.
- Montieren Sie den Gewebehomogenisator. Reinigen durch "Homogenisieren" 10-20 ml 70% Ethanol / Wasser.
- Homogenisieren des Gewebes in mehrere Bursts, nach dem Aufsetzen des Homogenisators Sonde in das Rohr mit dem Gewebe und BAW Lösung. Halten Sie das Rohr in einem Eis-Eimer danach.
- Reinigen Sie den Homogenisator zwischen den Proben, durch Homogenisieren 10-20 ml 70% Ethanol / Wasser und dann BAW-Puffer. Dies verhindert Kreuzkontamination von Gewebe zwischen samples.Dismantleand sauber mit 70% Ethanol / Wasser nach unsE.
- Wenn ein Extrakt, der nur lösliche Material benötigt, zentrifugieren homogenisierte Gewebeextrakt bei 4.000 Upm bei RT für 10 min. Wenn ein Rohextrakt mehr erforderlich ist, bei 1000 Upm bei RT für 5 min drehen. Die am besten geeignete Methode zur Extraktion der BAW-unlösliche Proteine hängt vom nachgeschaltete Analyse der Proteine. Für den Einsatz in der funktionellen immunologischen Assays würden wir vorschlagen, versuchen, die unlösliche Fraktion in 8 M Harnstoff aufzulösen, wie wir zuvor gefunden haben dies gut verträglich zu sein 6.
- Überstand in ein sauberes Röhrchen und legte es auf Eis.
- Bestimmung der Konzentration von Protein in der Extrakt unter Verwendung eines BCA-Assay oder ähnliches.
4. Gefriertrocknung Auszüge
- Je nach der Masse des Proteins erforderlich (dh, 100 ug pro Röhrchen), verdünnt das Homogenat und abzugeben entsprechend Aliquots in 5,0 ml steriler markierten, Falcon (12x75 mm) Tuben. Wir verwenden häufig 100 ug / Rohr.
- Verwenden Sie eine 18-20 Gauge sterilen Injektionsnadel bis 3 Löcher in der Kappe jeder Röhre zu machen.
- Frieren Rohre entweder, indem sie auf Trockeneis für ~ 10 min oder in einem -80 ° C Gefrierschrank für> 1 Stunde. Lagerung bei -80 ° C bis zum auf dem Lyophilisator setzen.
- Schalten Sie Gefriertrockner und ermöglichen äquilibrieren (-100 ° C). Dieser Vorgang dauert ca. 30 min.
- Je nach Volumen kann Gefriertrocknung innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen sein, aber wir routinemäßig verlassen unsere Proben über Nacht.
- Nach Beendigung des Trocknungszyklus, Abschaltung Vakuumpumpe und langsam ermöglichen Druck in der Kammer. Entfernen Rack.
- In einer sterilen Haube, entfernen Sie die Lochkappen aus den Rohren und durch neue ersetzen (Falcon 352.032).
- Röhrchen bei -20 ° C. Proben können in Kulturmedien oder andere Puffer rekonstituiert werden, und verwendet in Funktion oder biochemischen Assays.
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die Färbung eines ProteinsGel mit Extrakt aus der Milz und Inselchen erschöpft Pankreasgewebe (beschriftet acinar) und gereinigten menschlichen Inseln (mit Inseln) geladen. Die Ergebnisse zeigen eine gute Darstellung der Proteine verschiedener Molekulargewicht für jedes Gewebe.
Die Kapazität Gewebeextrakten die menschliche T-Zell-Proliferation zu stimulieren, wurde getestet unter Verwendung eines CFSE basierenden Proliferationsassay 7 (Abbildung 2). Die PBMC in diesem Test verwendet wurden von einem Individuum mit Diabetes Typ 1 isoliert. Das Ausmaß der Reaktion wird als Verhältnis der Anzahl der Zellen pro CFSE dim 5000 CD4 +, CFSE hellen Zellen ohne Antigen exprimiert: der CFSE dim Zellen pro 5000 CD4 +, CFSE hellen Zellen mit Antigen aus Dreifachproben 7. Die Ergebnisse zeigen eine schwache, aber nachweisbare, Proliferation als Reaktion auf Azinuszellen (CD1 = 3,5) und eine stärkere Reaktion auf islet Extrakt (6,8). Inaktivierten Influenza-Virus (CDI = 142,6) als enthaltenpositive Kontrolle.
Abbildung 1. Protein-Gel.
Abbildung 2. Ergebnisse einer CFSE-basierte Proliferationsassay gegen acinar und Inselchen Extrakt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, weil wir einen Auszug aus menschlichem Gewebe, die frei von giftigen Chemikalien wie Wasch war erzeugen wollte. Insbesondere haben wir es verwendet, um Auszüge aus menschlichem Gewebe, die in Tests des menschlichen Immunsystems in vitro verwendet werden vorzubereiten. Extrakte hergestellt unter Verwendung dieses Protokolls können gleichermaßen in einem Puffer rekonstituiert werden und für viele biochemische Analysen, wie Western-Blot oder Flüssigkeitschromatographie. Dies macht diese Technik für viele nachgelagerte Anwendungen.
Mit unserem Protokoll die Antwort auf Gewebeextrakten sind nicht stark. Es wird erwartet, weil wir für responses to 'self' Antigene suchen, in unserem Fall T-Zell-Reaktionen gegen Inselzellen Antigene sind häufig schwach 1. Bisher haben wir festgestellt, dass menschliche CD4 + T-Zell-Reaktionen zu rekombinantem Proinsulin und Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD), Autoantigene bei Typ-1-Diabetes, nachgewiesen werden konnten mit unseren CFSE-based werdenProliferationsassay 7,8. Wir haben uns entschieden, Gewebeextrakten verwenden, um Probleme mit der Verwendung von synthetischen Peptiden 9 und 10 zugeordnet rekombinante Proteine zu vermeiden.
Wir wissen nicht routinemäßig hinzuzufügen Protease-Inhibitoren zu unserem Extraktionen. Die Gegenwart von Protease-Inhibitoren hemmen Antigenprozessierung und Präsentation 11 und folglich inhibieren T-Zell-Reaktionen. Stattdessen führen wir die Extraktion auf Eis in einem Versuch, Protease-vermittelten Abbau zu verhindern. Für andere Anwendungen der Einschluss von Proteaseinhibitoren kann vorteilhaft sein, wenn Proteinabbau ein Problem ist.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) und der Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) und der betrieblichen Infrastruktur Schema des viktorianischen Regierung unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Tom Mandel Inseltransplantation Programm Inselisolierung Team für die Bereitstellung der menschlichen Geweben. Menschliche Gewebe wurden gesammelt und mit lokalen ethischen Zulassung verwendet (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 und St. Vincent Gesundheit HREC-A 135/08).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
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