Summary
Explantes neurais de dissecados
Abstract
O complexo processo de direccionamento axonal em grande medida pelo cone de crescimento, que é a estrutura dinâmica móveis na extremidade do axónio crescente. Durante o crescimento axonal, o cone de crescimento deve integrar múltiplas fontes de informação deixa de orientação para modular seu citoesqueleto, a fim de impulsionar o cone de crescimento para a frente e precisa navegar para encontrar seus alvos específicos 1. Como esta integração ocorre ao nível do citoesqueleto é ainda emergente, e exame da proteína do citoesqueleto e dinâmica efectoras dentro do cone de crescimento pode permitir a elucidação desses mecanismos. Cones de crescimento de Xenopus laevis são suficientemente grandes (10-30 microns de diâmetro), para realizar alta resolução de imagem ao vivo da dinâmica do citoesqueleto (por exemplo 2-4) e são fáceis de isolar e manipular em um ambiente de laboratório em comparação com outros vertebrados. A rã é um sistema modelo clássico para estudos de desenvolvimento da neurobiologia e importantes idéias iniciais em mic cone de crescimentodinâmica rotubule foram inicialmente encontrados usando este sistema 5-7. Neste método 8, os ovos são recolhidos e fertilizados in vitro, injectados com RNA que codifica as proteínas de fusão marcadas com fluorescência do citoesqueleto ou outras construções de manipular a expressão do gene, e depois deixou-se desenvolver até o estádio do tubo neural. Tubos neurais são isolados por dissecção e, em seguida, são cultivadas, e cones de crescimento de neurites superando são gravadas. Neste artigo, descreve-se como para executar este método, o objectivo da qual é a cultura de Xenopus laevis cones de crescimento para a análise de imagem subsequente de alta resolução. Enquanto nós fornecemos o exemplo da proteína de fusão + TIP EB1-GFP, este método pode ser aplicado a qualquer número de proteínas de elucidar o seu comportamento no interior do cone de crescimento.
Protocol
Nota: Nós descrevemos as etapas nas duas primeiras seções só em breve, como protocolos excelentes com informações detalhadas foram publicadas em outros lugares que o foco mais especificamente sobre essas etapas (por exemplo, 8-12). Além disso, o protocolo geral do trabalho com neurônios de Xenopus espinhal em cultura de células vivas foi publicado anteriormente em um artigo detalhado métodos 8. Recomendamos rever esse artigo como um complemento a este vídeo, apesar de que aqui nós não fornecer informações suficientes para executar com êxito e solucionar a dissecção tubo neural e protocolo de revestimento no passo 3.
1. Fertilização In Vitro de Xenopus Ovos
- Obter ovos de rãs do sexo feminino que foram injetados com gonadotrofina coriônica (400 unidades / sapo) 12-18 horas antes da coleta de ovos. Recolher ovos em solução 1X de Marc Ringer modificada (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM de MgSO4, 2,0 mM de CaCl 2, HEPES 5,0 mM, pH 7,4 9).
- Fertilizar os ovos in vitro com testículos picada, conforme descrito anteriormente 9.
- Após pelo menos 20 min, remover o revestimento de gelatina, por incubação de embriões embriões em cisteína a 2% em 1X MMR (ajustada a pH 7,8 com NaOH) durante 3-5 min. Lava-se com 0,1 X MMR (ou 0,1 x MBS (Modificado de Barth receita, Saline 1X: 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2,5 mM de NaHCO3, 5 mM de HEPES, pH 7,8)) 3 -5 vezes, e manter os embriões à temperatura ambiente até que as injecções, ou, se desejado, os embriões lugar em 14-18 ° C para retardar o desenvolvimento.
2. Micro-injecção de RNA
Nota: quando se utiliza a injecção de RNA aqui, estas técnicas não são limitados a RNA, e DNA, as proteínas ou os ácidos nucleicos modificados para a manipulação de genes também pode ser utilizado e tem sido descrito previamente 12.
- Antes do experimento, RNAs para a rotulagem de estruturas do citoesqueleto ou outro are transcritos a partir de moldes de ADN linearizado usando a mMessage mMachine kit (Ambion). mRNAs requerem a 5 'e uma tampa 3' da cauda de poliadenilação para promover a translação e evitar a degradação em embriões. pCS2 + é um vector habitualmente utilizada para esse fim, e o kit de transcrição inclui um análogo de tampa durante a reacção de síntese. Nós re-suspender em ARNm transcrito sem nuclease DDH 2 0, a uma concentração de estoque entre 500 e 2.000 ng / uL, seguido de armazenagem rápida a -80 ° C. Antes da injecção, dilui-se o RNA em DDH 2 0 a uma concentração adequada para a injecção. Como apenas um pequeno volume será injectado em embriões, ressuspensão em tampão não é necessário. A concentração final de injecção é tipicamente de 50-200 pg / nl, dependendo da construção, e geralmente vai injectar-se a 4 nl por embrião, embora muitos laboratórios tradicionalmente injectar-se a 10 nl, que é aproximadamente de 1% do volume total de um embrião. RNA podem ser tóxicos em doses elevadas, e a dose por géneros embriãolly varia entre 10 pg e 1 ng, embora até 5 ng pode ser tolerada, dependendo do gene particular e da pureza. No entanto, para localização de proteínas de imagens, o nível mais baixo possível, deve ser injetada para evitar a sobre-expressão artefatos. RNA para EB1-GFP neste protocolo é usado no valor final de 250 pg por embrião.
- Preparar as agulhas de injecção puxando capilar com um extractor de agulha 9, para um diâmetro da ponta de ~ 0,2 um. Com um P-87 Sutter extrator, usamos as seguintes configurações: calor 644, 125 tração, velocidade de 70, o tempo de 250, mas esses parâmetros variam dependendo da máquina e deve ser reajustado depois de mudar o filamento (que usamos atualmente de 2,5 mm filamento caixa quadrada que é de 2,5 mm de largura). Sob um microscópio, quebrar a ponta da agulha com uma pinça em um ângulo para gerar uma forma de pena-like. Existem outros métodos para quebrar e enchendo as agulhas de injecção (por exemplo, 11,12), mas a agulha de encher com RNA, colocando uma pequena gota (0,5 - 1 ml) para a extremidade traseira doagulha. Para microinjecting em embriões, há uma série de sistemas de injecção comercialmente disponíveis, duas das mais comuns são o Pico-injector (Medical Systems), e a Nanoject (Drummond Scientific) (ver 11 para mais informação). Usamos o Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, que utiliza gás comprimido, por um período definido de tempo digital, a fim de fornecer volumes nanolitros consistentes. Volume de injecção deve ser calibrado para cada micropipeta novo usando um micrómetro fase, e tempo de injecção deve ser ajustada para se obter a quantidade desejada de RNA injetadas.
- Lugar embriões fertilizados no 1 - a fase de 4 células para uma placa de plástico que contém 5% de Ficoll em 0,1 X MMR. Segurando o embrião no lugar com fórceps, ou a colocação de uma plataforma de suporte (uma malha de plástico, com uma grelha de 1 mm ~, aderida ao fundo da placa com plasticina ou cera dental), injecta-se de volume desejado em blastómeros de origem animal (ver etapa 2.1 para obter detalhes sobre volumes de injecção). Distribuir em vários locções ao longo de embriões, pelo menos, uma injecção em cada um dos blastómeros de origem animal, para obter uma distribuição mais uniforme (por exemplo, para uma fase de embrião de 4 células, que normalmente injectar 1-2 vezes em cada blastômero, ao passo que numa fase de 2 células embrião, injetamos 2-4 vezes em cada blastômero). Um benefício de esperar até o estágio de célula 2-4 é que você garante o embrião começou a decompor normalmente. No entanto, se o tempo é da essência, você pode começar no estágio 1-célula, com pouca diferença no resultado final que não seja mais embriões que precisam ser injetado. Embriões mais velhos estágio pode ser utilizado também, e isso é particularmente útil, se os tipos de células específicos são dirigidos para a injecção, mas geralmente preferimos que a expressão mais amplo, é injectar nos embriões jovens para reduzir a necessidade de injecções mais numerosos.
- Transferência de embriões injetados a um prato de plástico contendo 0,1 X MMR e permitir-lhes desenvolver até o estágio 20-23 13. Incubar os embriões a 14 até 22 ° C, dependendo spe desejadoed de desenvolvimento. (Para dissecar tubos neurais no dia seguinte, utilizar ~ 22 ° C. Para um dia depois, utilizar ~ 14 ° C.)
3. Dissecção do tubo neural e chapeamento
- Antes de realizar as dissecações, preparar os pratos da cultura 14. Em primeiro lugar, com uma solução de revestimento de lamelas suficiente de 200 ug / ml de poli-lisina em PBS a piscina sobre a superfície da lamela, de qualquer Mattek ou pratos de cultura Lab-Tek, e incuba-se durante uma hora (alternativamente, pode-se utilizar lamínulas sentados solta numa placa de Petri, para colocação posterior sobre lâminas de vidro para a imagiologia e imunocitoquímica). Aspirar e lavar com um excesso de PBS 3 vezes, e deixar secar. Em seguida, os pratos revestimento com 10 | ig / ml em PBS a laminina (geralmente usamos 500 ul por lamela, o suficiente para cima da superfície da piscina) durante uma hora a 37 graus. Aspirar solução laminina e lava-se 3 vezes com um excesso de PBS, tendo o cuidado de não deixar a laminina superfícies revestidas são expostas para a interface de ar. Substituindoe PBS com meios de cultura (50% de Ringer, 49% L-15 media, 1% de soro fetal de bovino, além de 50 ug / ml de penicilina / estreptomicina e gentamicina, pH 7,4 e esterilizado por filtração). (Media Ringer, 115 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 10 mM de Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Enquanto o nosso protocolo utiliza essa mídia, deve-se notar que este é um meio enriquecido comum para idosos Xenopus culturas ganglionares da retina, onde os neurônios têm reduzido energia reservados. Jovens culturas da medula espinhal irá sobreviver e crescer durante mais de 24 horas no Media Ringers puros, sem fatores adicionais de crescimento, e esta é certamente uma das vantagens da utilização deste sistema. Opcional: adicionar NT3 e BDNF (para concentrações finais de 25 ng / ul cada) ao meio de cultura para aumentar o crescimento axonal.
- Devido à variabilidade na expressão de mRNA injectado, os embriões podem apresentar um mosaico de fluorescência. Antes de realizar dissecações, embriões de tela para a presença de fluorescência, para identificar os embriões que express da proteína de fusão fluorescente do tubo neural. Coloque embriões fluorescentes na fase 20-23 em um prato de agarose revestidas de plástico cheio com meio de Steinberg (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM de Ca (NO 3) 2, 1,3 mM de MgSO4, 4,6 mM de Tris, pH de 7,8, em seguida, autoclavado) 5. Para fazer o prato de agarose-revestido, revestimento de fundo de prato de plástico derretido com agarose 1% em 0,1 X MMR e endurecer let. Isto proporciona uma superfície macia, de modo que não ocorram danos às pinça fina e agulhas de tungsténio utilizados durante as etapas subsequentes de dissecação. Dissecação de embriões de fase para além de 23 é possível, mas é mais difícil quando os tecidos aderir mais perto uns dos outros e, portanto, necessitam de um tratamento mais prolongado com colagenase.
- Sob um escopo de dissecação, remover a membrana vitelina, com uma pinça fina e, em seguida, isolar a totalidade da porção dorsal do embrião, fazendo uma série de incisões. Enquanto uma pinça de segurar o embrião no lugar, use o segundo para fazer uma incisão nalado do embrião para expor o interior oco. Em seguida, utilizar as duas pinças de beliscar ao longo do tecido entre as metades dorsal e ventral do embrião, cortando desse modo o embrião ao meio para isolar a porção dorsal que contém o tubo neural.
- Colocar o explante dorsal em um tubo Eppendorf com 2 mg / ml de colagenase em meio Steinberg por 15-20 minutos num rotor, para soltar os tecidos, e, em seguida, explante dorsal pipeta numa cápsula de agarose revestidas de plástico com uma solução fresca de Steinberg. Alternativamente, o explante pode ser colocado numa placa de Petri contendo a solução de colagenase durante 15 minutos, em que a dissecção inteiro podia então ser realizada.
- Utilizando um par de pinças, dissecar suavemente o tubo neural da epiderme dorsal e ventral da notocorda. Deslizar a ponta da pinça entre a epiderme e o tecido subjacente e, lentamente, puxar para trás a epiderme, revelando o tubo neural abaixo. Em seguida, utilizar uma pinça para segurar o tecido e outra para fazer deslizar a ponta entre otubo neural e notocorda. Finalmente, utilize uma pinça para remover os somitos de cada lado do tubo.
- Transferir o tubo neural a um prato de agarose revestidas preenchido com meio de cultura, tal como descrito no passo 3.1.
- Depois da recolha de vários tubos neurais, corte em pedaços numerosas (cerca de 20, se o tubo inteiro é isolado) utilizando agulhas de tungsténio aguçadas ou pinças, e depois as peças de chapa em placas de cultura com meio de cheias (preparada no passo 3.1), espalhando-se explantes uniformemente em linhas.
- Após o plaqueamento, não mova os pratos, porque esta iria perturbar as células de fixação. Incubar os banhados explantes do tubo neural em torno de 20-22 ° C. Nós normalmente deixam o prato de células no banco à temperatura ambiente durante a noite. Uma das vantagens de Xenopus laevis neurónios é a de que uma incubadora especial para a cultura celular, que regula os níveis de CO 2 ou a temperatura não é necessário. Neurites e cones de crescimento pode ser observado e trabalhada à temperatura ambiente 12-24 Horas após o plaqueamento, embora desdobramento pode ser acelerada com a adição de factores de crescimento. Em geral, a expressão de um RNA ou produto plasmídeo irá resultar em expressão variável entre as células e, assim, pode haver um intervalo de níveis de expressão de fluorescência entre os cones de crescimento. Temos observado RNA expressão de proteínas fluorescentes para persistirem além de 48 horas após o plaqueamento, embora isto dependa da construção particular.
4. Resultados representativos
Depois, seguindo o protocolo, o qual é resumido na Figura 1A, saudáveis, correctamente, dissecados e cultivados explantes neuronais irá enviar axônios numerosos ou neurites em todas as direcções sobre laminina / poli-lisina substrato, mostrado na Figura 1B. Os cones de crescimento nas pontas dos axônios podem ser visualizados por qualquer ótica DIC, como visto na Figura 1C, a dinâmica global da imagem de motilidade, ou de alta resolução de microscopia de fluorescência para examinar o localization de fluorescentemente marcadas com proteínas do citoesqueleto, por exemplo, EB1-GFP é mostrado na Figura 1D.
Figura 1. Síntese de protocolo experimental e os resultados esperados. A) Protocolo de fluxograma. Veja o filme para obter detalhes sobre a dissecção no dia 3. O tubo neural inteira deve ser cortado em cerca de 20 pedaços de tamanho igual, e espalhar-se uniformemente em linhas na lamela. Neste desenho animado, tesouras são retratados para representar o corte do tecido com uma pinça fina. CG gonadotrofina coriônica B) imagem DIC de axônios ou neuritos crescem fora do explante (explante no canto superior esquerdo). C) a imagem maior aumento de cone de crescimento na ponta de um axônio em crescimento. D) a imagem de microscopia de fluorescência da GFP EB1 em cone de crescimento. Barra de escala 10 m. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Explantes de Xenopus laevis neurais enviar neurites de uma maneira muito robusta por 24 horas após o plaqueamento na laminina / poli-lisina substrato, se as condições são apropriadas. Com este substrato, cones de crescimento são altamente móveis e podem atingir comprimentos de axónios de até 1 mm, estendendo-se em todas as direcções para fora a partir do explante, embora comprimentos típicos são de 100 um ou mais. Se neurites não crescem para fora, há um número limitado de razões para que este seja o caso. Uma possibilidade é que os explantes neuronais não aderem adequadamente ao prato. Certifique-se de não perturbar anexos acidentalmente mover o prato após o plaqueamento. Além disso, garantir que os pratos da laminina-e poli-lisina-revestidas foram correctamente efectuadas com todos os reagentes recém-preparados. Uma outra possibilidade para a falta de crescimento é que as condições de cultura de células media pode não ser óptima. Verifique protocolo e cálculos para garantir que todas as soluções de mídia foram corretamente formuladas. Finalmente, é possível queembriões a partir dos quais os explantes foram obtidos pode ser prejudicial, embora se possa desenvolver embriões para a fase do tubo neural, este é menos provável de ser o problema. No entanto, o melhor é manter alguns embriões inteiros intactos cultivadas em MMR 0,1 X, juntamente com dissecções para garantir que o desenvolvimento contínuo ocorre.
O passo mais importante deste protocolo é a dissecação do tubo neural. Comparado ao embrião muitos modelos de sistema de micro-dissecção, esta é uma técnica relativamente simples, e os embriões de Xenopus laevis são um dos organismos maiores e mais complacente com a dissecação. No entanto, se o experimentador é completamente novo para realização das dissecções embrionárias, este passo pode levar várias horas para aperfeiçoar (o melhor espalhados por 2-3 sessões). Após o tratamento com colagenase, alguns preferem próximo remover da mesoderme, notocorda e sómitos, seguido da epiderme, resultando assim no tubo neural isolado, enquanto outros preferem a começar com a remoção da epiderme e, em seguida,separando os outros tecidos a partir do tubo neural. Recomenda-se a tentar ambos os métodos para determinar o que funciona melhor para cada pesquisador. Além disso, tenha cuidado para não colocar muita pressão sobre o tubo neural durante o seu isolamento. É preferível remover os outros tecidos do tubo neural, em vez de remover o tubo neural dos outros tecidos, a fim de reduzir a tensão sobre o tubo e evitar a sua fragmentação prematuramente. Finalmente, se os tecidos circundantes são muito aderente ao tubo neural, em seguida, colocar o explante de volta para a solução de colagenase por mais alguns minutos. Isto vai fazer a separação do tubo neural dos tecidos circundantes, especialmente na epiderme, muito mais fácil. A duração do tratamento de colagenase depende da fase do embrião, como embriões mais velhos requerem tratamentos mais prolongados, de até 45 min ou mais, para a fase 28 embriões.
Além de explantes do tubo neural, os tubos neurais também pode ser dissociado antes do plaqueamento em order de células de imagem simples. Protocolos para este método são descritos em 8, 15. Uma vantagem deste método é que a morfologia neuronal e extensão de neurites pode ser examinado, assim como o corpo de célula não se encontra obstruído dentro do explante. Além disso, os explantes neurais podem também ser cultivadas em vários substratos padronizados. Por exemplo, a orientação cue "ensaio listra" tem sido utilizado para avaliar as alterações na dinâmica do cone de crescimento, em resposta ao encontro com as fronteiras do substrato de cultura 16, 17. Um protocolo detalhado para a preparação de padrões de riscas de pistas tem sido descrita 18. Isto pode permitir a análise da dinâmica do citoesqueleto, enquanto o cone de crescimento sofre decisões de orientação da direcção de sinalização.
Há uma série de benefícios para o uso de Xenopus laevis para experimentos de cultura neurais explante. Em comparação com outros sistemas, a cultura de neurónios primários estas são relativamente fáceis de obter e requerem um baixo custo. Uma vez que podem ser cultivadas e trabalhada à temperatura ambiente,incubadoras caras não são necessários. embriões de Xenopus são facilmente acessíveis e podem ser obtidos em grandes quantidades, desenvolvem-se rapidamente, e que são suficientemente grandes para dissecar com uma formação mínima. Assim, este sistema é especialmente adequado para laboratórios de ensino.
Outra vantagem da utilização de embriões de rã é que eles são passíveis de manipulação dos níveis de expressão do gene, o ARNm, ou proteína, dependendo das necessidades de uma experiência em particular. Por exemplo, uma vantagem de usar mRNA é que a concentração e volume de injecção pode ser titulada com cuidado para controlar o nível de expressão resultante, durante a injecção de DNA, por outro lado, permite a criação de embriões transgénicos nos quais a expressão do gene pode ser controlada pela espacial ou temporal promotor específico (por exemplo, 19). Assim, este método de explante neural pode ser aplicado a várias situações para a compreensão do comportamento e função de proteínas de interesse durante o crescimento axonale cone dinâmica de crescimento.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Bob Freeman para treinamento e laboratório de Kirschner para a utilização do mecanismo sapo, e membros do laboratório Vactor Van de apoio. Agradecemos a Nikon Imaging Center da Harvard Medical School de assistência à microscopia de luz para as imagens na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo seguinte: NRSA NIH companheirismo e comunhão NIH K99 a LAL, Ciência Básica Parceria financiamento ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) a AEF, e NIH RO1 NS035909 para DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
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