Summary
وصفنا طريقة لتعديل خلايا T وراثيا الأساسي الإنسان مع التحوير باستخدام غير الفيروسية
Abstract
نظام ينقول piggyBac نشط بشكل طبيعي، والمستمدة أصلا من 1،2 الملفوف فراشة وبير. هذا النظام غير الفيروسية هو البلازميد القائم، والأكثر شيوعا استخدام البلازميدات 2 مع واحد يعبر عن انزيم transposase piggyBac وينقول البلازميد إيواء الجينات (ق) في المصالح بين عناصر تكرار مقلوب وهي مطلوبة من أجل نقل الجينات النشاط. PiggyBac نقل الجينات من خلال يتوسط و"قص ولصق" آلية يمكن من خلالها للtransposase يدمج الجزء ينقول في جينوم الخلية الهدف (ق) من الفائدة. أثبتت كفاءة النشاط PiggyBac توصيل الجينات في مجموعة متنوعة واسعة من 1،2 الحشرات، الثدييات 3-5، و الإنسان بما في ذلك cells6 الأولية خلايا T الإنسان 7،8. مؤخرا، تم إنشاء transposase piggyBac مفرط تحسين كفاءة نقل الجينات 9،10.
الإنسان الخلايا الليمفاوية T هي من intere السريريةسانت لعلاج مناعي لسرطان بالتبني 11. من المذكرة، تمت الموافقة على أول محاكمة سريرية شملت ينقول تعديل خلايا T الإنسان باستخدام نظام ينقول الجميلة النائمة 12. لدينا تقييم من قبل الأداة المساعدة من piggyBac كمنهجية غير الفيروسية للالتعديل الوراثي للخلايا T الإنسان. وجدنا piggyBac لتكون فعالة في التعديل الوراثي للخلايا T الإنسان مع الجينات مراسل والانتحار غير محرض مناعة الجين 7. كشف تحليل لمواقع التكامل الجينومية عدم وجود تفضيل للاندماج الجينات المسرطنة بروتو أو بالقرب منها معروفة 13. كنا piggyBac لتعديل الجينات السامة للخلايا الليمفاوية T للقيام مستقبلات مستضد خيالية موجهة ضد مستضد الورم HER2، ووجد أن الجين بوساطة استهدفت خلايا T-معدلة قتل HER2 إيجابية الخلايا السرطانية في التجارب المختبرية والحية في نموذج الفأر مثلي 14. وقد استخدمنا أيضا piggyBacعلى توليد خلايا T المقاومة للrapamycin الإنسان، التي ينبغي أن تكون مفيدة في علاج السرطان حيث يستخدم rapamycin 15.
هنا، نحن تصف طريقة لاستخدام piggyBac لتعديل وراثيا خلايا T الأساسي الإنسان. وهذا يشمل عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من دم الإنسان تليها الثقافة والتحوير الجيني، وتنشيط خلايا T. لغرض هذا التقرير، تم تعديل الخلايا T مع الجينات مراسل (EGFP) للتحليل الكمي والتعبير الجيني من قبل التدفق الخلوي.
ويمكن استخدام خلايا لتعديل PiggyBac T الإنسان مع مجموعة متنوعة من الجينات في المصالح. على الرغم من أننا قد استخدمت لتوجيه الخلايا piggyBac لمستضدات الأورام T 14، وقد استخدمنا أيضا piggyBac لإضافة مفتاح السلامة محرض من أجل القضاء على خلايا الجينات تعديل إذا لزم الأمر 7. وقد مكنت طاقة شحن كبيرة من piggyBac أيضا نقل الجينات منلمقاومة كبيرة rapamycin جزيء mTOR (15 KB) 15. ولذلك، فإننا نقدم منهجية غير مستقرة للفيروسات لتعديل الجينات من الخلايا الأولية T الإنسان لطائفة واسعة من الأغراض.
Protocol
اليوم 0
1. عزل PBMCs من دم الإنسان
- جمع 20 مل من الدم البشري الطازج باستخدام بزل الوريد إلى أنابيب vacutainer نا الهيبارين.
- مزيج الدم والمتقدم RPMI 1640 في 1:1 (V / V) النسبة.
- إضافة 20 مل المتوسطة lymphoprep إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل (25 ° C). ببطء طبقة 25-30 مل من الدم RPMI مزيج 1640 على رأس lymphoprep.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 40 دقيقة دون الفرامل.
- جمع كل من طبقات متميزة وغامض باستخدام ماصة المتاح في 10 مل من 1X PBS (25 ° C) وتبرزي حجم ما يصل الى 50 مل PBS 1X مع.
- أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة.
- نضح طاف تماما وإضافة 20 مل من RPMI 1640 متقدم.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف. prewarmed إضافة 10 مل من وسائل الإعلام خلية كاملة T تستكمل مع 5 نانوغرام / مل rhIL-15 ° 37 في C.
- حساب عدد الخلايا وعلى مدار 24 لوحة في نسيج معطف جيدا ثقافةإد لوحة في الخلايا 2 × 6 10 / وسائل الإعلام بشكل جيد في كامل الخلية T تستكمل مع 5 نانوغرام / مل rhIL-15 إضافة إلى آبار الماء المعقم المحيطة بها. احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
يوم 1
2. لوحات طلاء جسم مع مكافحة CD28 ومكافحة CD3-T لتحفيز الخلايا
- تخفيف الأجسام المضادة المقاومة للCD28 ومكافحة CD3 في الماء المعقم عند تركيز من 1 ميكروغرام / مل لكل منهما.
- إضافة 500 ميكرولتر حل كل الأجسام المضادة إلى 5 آبار ملحوظ من زراعة الأنسجة غير المغلفة لوحة 24 أيضا.
- إضافة الماء المعقم للراحة من الآبار. التفاف لوحة التفاف يتقلص في وضعها في الثلاجة 4 C °.
3. Nucleofection من خلايا T Unstimulated
- Prewarm سائل الإعلام خلية T في 37 ° C والملحق مع 5 نانوغرام / مل من rhIL-15. إعداد الحل الكامل nucleofector عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الملحق Nucleofector 1 حتي 2،25 مل من محلول Nucleofector.
- Aliquot 5 ميكروغرام لكل من ينقول (زيو-PT-CMV-EGFP) وtransposase (pCMV-piggyBac) في أنبوب 1.5 مل microfuge ملاحظة: قد يكون من الضروري لتحسين transposase وينقول كمية DNA لتوصيل الجينات الأمثل وتقليل ل سمية الخلوية. يمكن الحصول على البلازميدات من الكتاب حسب الطلب.
- PBMCs الحصاد من ال 24 جيدا الأنسجة لوحة الثقافة في أنبوب 50 مل. حساب عدد الخلايا. حفظ 2 × 10 6 خلايا لاستخدامها خلال مراقبة التدفق الخلوي.
- إضافة 7-10 × 10 6 خلايا لأنبوب الطرد المركزي 15 مل وبسعر 400 XG، 5 دقائق، نضح طاف وتوجيه أصابع بيليه ونفض الغبار.
- إضافة 100 ميكرولتر من حل خلية T nucleofection كاملة لبيليه الخلية خففت.
- إضافة الخليط إلى حل خلايا الأنبوب الذي يحتوي على البلازميدات.
- إضافة الخليط حل خلايا-البلازميد إلى الجزء السفلي من كوفيت nucleofection. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات.
- Nucleofect باستخدام الخلايا المواليةغرام U-014 (Unstimulated خلايا T، الإنسان، http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- إضافة 500 ميكرولتر فورا من وسائل الإعلام prewarmed مع rhIL-15 إلى كوفيت. نقل الخلايا إلى جانب لوحة بئر 24 مع 1.5 مل من وسائل الإعلام prewarmed مع rhIL15.
- احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
يوم 2
4. غير محدد تحفيز خلايا T
- خلايا الحصاد وتحديد أرقام الخلية. تخصيص 0.5 × 10 6 خلايا لالتدفق الخلوي لتحديد وتيرة GFP إيجابية الخلايا. استخدام غير PBMCs بالنقل والضوابط.
- نضح الحل الأجسام المضادة CD3/28 من لوحة زراعة الأنسجة غير المغلفة وشطف جيدا مع وسائل الاعلام كل خلية T.
- إعادة تعليق الخلايا خلايا nucleofected عند 0.5 × 6 10 في مل في وسائل الإعلام CTL كاملةتستكمل مع 5 نانوغرام / مل rhIL-15. إضافة 2.0 مل كل من الخلايا nucleofected في 4 آبار لوحة زراعة الأنسجة غير. إضافة 0.5 × 10 6 خلايا غير nucleofected إلى ال 5 أيضا.
- احتضان لمدة 3 أيام في حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
اليوم 5
- حصاد الخلايا T حفز من لوحة زراعة الأنسجة غير المغلفة.
- وتعول replate الخلايا في المغلفة جيدا لمدة 24 لوحة الأنسجة الثقافة بنسبة 0.7 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام خلية T مع 5 نانوغرام / مل IL-15.
يوم 7
7. تحليل التعبير الجيني
- خلايا الحصاد وصمة عار مع الأجسام المضادة لمكافحة CD8 الإنسان (يمكن أيضا استخدام المضادة للCD3 CD4 والمضادة لل) وتحليل التدفق الخلوي مع للتعبير GFP٪.
اليوم 8 (اختياري)
8. التوسع في الخلايا T
- في يوم 8 بعد ترنسفكأيشن، يمكن خلايا T في replated Tخلية الإعلام مع IL-15 في كثافة الخلايا بنسبة 0.7 X 6 10 لكل بئر لمزيد من التوسع 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد التخطيطي تبين الخطوات في تعديل وراثيا الخلايا الليمفاوية T الإنسان مع الجينات مراسل (EGFP) في الشكل رقم 1. هذه البلازميدات متوفرة عند الطلب من المؤلفين. A schemtic مما يدل على الخطوات في الخلايا الليمفاوية T المعدلة وراثيا الإنسان مع الجينات مراسل (EGFP) هو شووين في الشكل 2. من الضروري تنشيط خلايا T من أجل الحصول عليها لتقسيم والتوسع، ونشر في الثقافة. تم زراعة خلايا ثم تعديل T وتحليلها باستخدام التدفق الخلوي للتعبير الجينات في يوم 1 و يوم واحد 7. أظهرت النتائج هي من إحدى الجهات المانحة في الشكل 3. خلايا كانت ملطخة مع allophycocyanin (APC)-مترافق المضادة للCD8 وتحليل لEGFP (والتحوير) ومضان APC من قبل FACSCalibur مجهزة مع مجموعة الفلتر لمدة 4 إشارات مضان باستخدام البرمجيات خلية كويست (بيكتون ديكنسون). لاحظنا سابقا التحوير الجيني لكلا CD4 CD8 خلايا T والإيجابية وشيطان هناإستراتيجيات CD8 خلايا إيجابية كمثال 7. على الرغم من أننا لتحليل واحد التحوير هنا التعبير، كما تم استخدامها لpiggyBac نقل الجينات متعددة الجينات (أو المضاعفة) في الخلايا البشرية 17. الانخفاض في التعبير EGFP بين يوم 1 ويوم 7 من المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أنه ليس كل الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل الخضوع التكامل مستقرة من DNA ينقول.
الشكل 1. التخطيطي من البلازميدات المستخدمة لتعديل الجينات بوساطة piggyBac من الخلايا T الإنسان. CMV، الفيروس المضخم للخلايا المروج؛ إنترون، SV40 إنترون مرنا لتحقيق الاستقرار؛ piggyBac، transposase [كدنا]: مجلس الشعب SV40، موقع تذييل بعديد الأدينيلات؛ PUC، أصل النسخ المتماثل؛ ب اكتاماز، الأمبيسلين الجينات المقاومة؛ PB3'IR، piggyBac 3 'تكرار مقلوب؛ PB5' IR، piggyBac. تكرار 5 'مقلوب؛ ZeoR، zeocin الجينات المقاومة؛ R6K أوري، أصل النسخ المتماثل؛ IVS، تسلسل التدخل؛ EGFP، الفلوريه الجينات مراسل ملاحظة: تم استخدام المضادات الحيوية لاختيار البكتيرية والنمو ولكن لم تستخدم في مزارع الخلايا T اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. تخطيطي يصف تعديل الأولية خلايا T الإنسان باستخدام نظام ينقول piggyBac.
الشكل 3. المستقر التعبير في الخلايا T التحوير مع تعديل التنفسي ينقول piggyBacم. لوحات من الزمن: EGFP التعبير في يوم 1. لوحات الحق: EGFP التعبير على يوم واحد 7 انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموضحة هنا يمكن تعديل مستقرة التحوير الأولية الخلايا الليمفاوية T الإنسان. لقد اختبرنا سابقا استخدام نظام ينقول piggyBac لتعديل خلايا T للتعبير عن الجينات مراسل (لأكثر من 4 أسابيع)، جين الانتحار غير مناعة، ومستقبلات مستضد خيالية لعلاج مناعي بالتبني (لأكثر من 100 يوم)، ومهندس المقاومة للأدوية المثبطة للمناعة 7،13-15. يجب عدم تعديل للفيروسات خلايا T لعلاج مناعي بالتبني وغيرها من التطبيقات يكون أقل تكلفة بكثير وتستخدم على نطاق واسع بالتالي أكثر من تنبيغ فيروسات. يجب استخدام عناصر جديدة piggyBac مفرط زيادة جدوى تصنيع التحوير مستقرة خلايا T تعديل 9. وإن لم يكن الموصوفة هنا، يمكن للمرء تحقيق الأرقام الضرورية للخلايا T ثابت بالنقل عن التطبيق السريري المحتملة. باستخدام مزيج من نقل الجينات بوساطة piggyBac والعدالة والتنميةويمكن توسيع نطاق الخلايا المغذية 562 (مستضد تقديم الاصطناعي)، والعائد الأولي من حوالي 2 × 10 6 خلايا T ثابت تقاس بواسطة 4-5 سجلات لأكثر من 10 10 transduced الخلايا T في 4 إلى 5 أسابيع و10 12 في 6 إلى 7 7 أسابيع. تحليل المواقع التكامل في الخلايا T piggyBac الإنسان لم تظهر أي تحيز نحو الجينات المسرطنة بروتو، غير أنها تظهر ميل للاندماج الجينات أعرب للغاية في تنشيط خلايا تي عند استخدام التكنولوجيا nucleofection المذكورة أعلاه 13. PiggyBac تمثل منهجية واعدة للاستقرار التعديل الوراثي للخلايا T الإنسان لطائفة واسعة من التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم SS في جزء من البحر المتوسط إلى HHMI غراد التدريب من خلال برنامج المنح TBMM. ويدعم MHW في جزء من مهنة جائزة التنمية من وزارة شؤون المحاربين القدامى، وبدعم سخي من الدكتور هارولد والسيدة Selzman M.. وأيد أيضا هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة سرطان الغدد الليمفاوية P50CA126752 منحة المعاهد الوطنية للصحة وSPORE R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
