Summary
We beschrijven een werkwijze voor genetisch primaire humane T cellen te veranderen met een transgen via de non-virale
Abstract
Het piggyBac transposon systeem is van nature actief, oorspronkelijk afkomstig van de kool grijper mot 1,2. Deze niet-virale systeem plasmide gebaseerd meest gebruikmakend van twee plasmiden met een expressie de piggyBac transposase enzym en een transposon plasmide het gen (s) plaats tussen inverted repeat elementen die nodig zijn voor genoverdracht activiteit. PiggyBac bemiddeld door genoverdracht een "knip en plak" mechanisme waardoor de transposase het transposon segment geïntegreerd in het genoom van de doelcel (s) plaats. PiggyBac aangetoond efficiënte genafgifte activiteit in diverse insecten 1,2, zoogdieren 3-5, en menselijke cells6 met inbegrip van primaire humane T-cellen 7,8. Onlangs werd een hyperactieve piggyBac transposase gegenereerd verbeteren van genoverdracht efficiëntie 9,10.
Menselijke T lymfocyten van klinische interest voor adoptieve immunotherapie van kanker 11. Van de nota, heeft de eerste klinische studie met transposon modificatie van menselijke T-cellen met behulp van de Doornroosje transposon systeem is goedgekeurd 12. We hebben eerder beoordeelde de bruikbaarheid van piggyBac als niet-virale methoden voor genetische modificatie van humane T-cellen. We vonden piggyBac om efficiënt in genetische modificatie van humane T-cellen met een reportergen en een niet-immunogene induceerbare zelfmoordgentherapie 7. Analyse van genomische integratieplaatsen gebleken dat er geen voorkeur voor integratie in of nabij bekende proto-oncogenen 13. We gebruikten piggyBac gen-passen cytotoxische T-lymfocyten een chimeer antigen receptor gericht tegen het tumor antigen HER2 dragen, en dat gen-gemodificeerde T-cellen gemedieerd gericht doden van HER2-positieve tumorcellen in vitro en in vivo in een muizenmodel orthotope 14. We hebben ook piggyBacmenselijke T-cellen tegen rapamycine, die van nut zijn in kankerbehandelingen waar rapamycine wordt gebruikt 15 genereren.
Hierin beschrijven we een methode om met piggyBac genetisch te modificeren primaire humane T cellen. Dit omvat isolatie van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit menselijk bloed gevolgd door kweek, genetische modificatie, en activering van T-cellen. Ten behoeve van dit rapport werden T cellen gemodificeerd met een reportergen (eGFP) voor analyse en kwantificering van genexpressie door flowcytometrie.
PiggyBac kan worden gebruikt om menselijke T-cellen te passen met verschillende genen van interesse. Hoewel we gebruik piggyBac T-cellen voor tumorantigenen 14 sturen, hebben we ook een induceerbare piggyBac veiligheidsschakelaar toevoegen om genetisch gemanipuleerde cellen te elimineren indien nodig 7. De grote laadvermogen van piggyBac is ook mogelijk genoverdracht vaneen grote rapamycine resistent mTOR molecuul (15 kb) 15. Daarom presenteren we een niet-virale methodologie voor stabiele gen-modificatie van primaire humane T cellen voor diverse doeleinden.
Protocol
Day 0
1. Isolatie van PBMC uit humaan bloed
- Verzamel 20 ml vers menselijk bloed met behulp van venapunctie in Na-Vacutainer buizen.
- Mix bloed en geavanceerde RPMI 1640 in 1:1 (v / v) verhouding.
- Voeg 20 ml lymphoprep medium aan een 50 ml centrifugebuis (25 ° C). Langzaam 25-30 ml bloed RPMI 1640 mix bovenop de Lymphoprep.
- Centrifugeer op 400 xg gedurende 40 min zonder remmen.
- Verzamel zowel verschillende en fuzzy lagen met behulp van een disposable pipet in 10 ml 1x PBS (25 ° C) en breng het volume op 50 ml met 1x PBS.
- Centrifugeer bij 450 xg gedurende 10 minuten.
- Volledig Zuig het supernatant en voeg 20 ml van Advanced RPMI 1640.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant. Voeg 10 ml compleet T-cel medium aangevuld met 5 ng / ml rhIL-15 voorverwarmd bij 37 ° C.
- Tel het aantal cellen en de plaat in een 24 well weefselkweek vachted plaat bij 2 x 10 6 cellen / putje in compleet T-cel medium aangevuld met 5 ng / ml rhIL-15 steriel water aan omringende putjes. Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2.
Dag 1
2. Coating platen met anti-CD28 en anti-CD3 antilichaam voor het stimuleren van T-cellen
- Verdun anti-CD28 en anti-CD3 antilichamen in steriel water bij een concentratie van 1 ug / ml elk.
- Voeg 500 ul elk antilichaam oplossing 5 aangegeven putjes van een niet-beklede weefselkweek plaat met 24 putjes.
- Voeg steriel water om uit te rusten van de putten. Wikkel de plaat in krimpfolie en plaats in een 4 ° C koelkast.
3. Nucleofectie van gestimuleerde T-cellen
- Voorverwarmen T-cel media bij 37 ° C en supplement met 5 ng / ml rhIL-15. Bereid volledige nucleofector oplossing door toevoeging van 500 pi Nucleofector Supplement 1 2,25 ml van Nucleofector oplossing.
- Eenliquot 5 ug elk van transposon (Zeo-pT-CMV-EGFP) en transposase (pCMV-piggyBac) in een 1,5 ml microfugebuis. Opmerking: Het kan nodig zijn de transposase en transposon DNA bedrag voor optimale genafgifte optimaliseren en te minimaliseren cellulaire toxiciteit. De plasmiden kunnen worden bij de auteurs op verzoek.
- Harvest PBMCs van de 24 wells weefselkweekplaat in een 50 ml buis. Tel het aantal cellen. Bewaar 2 x 10 6 cellen voor gebruik als controle tijdens flowcytometrie.
- Voeg 7-10 x 10 6 cellen om een 15 ml en centrifugeer bij 400 xg, 5 min, aspireren supernatant en vinger trap de pellet.
- Voeg 100 ul van T cel volledige nucleofectie oplossing los cel pellet.
- Voeg de oplossing-celmengsel aan de buis met de plasmiden.
- Voeg de oplossing-cel-plasmide mengsel aan de bodem van de cuvette nucleofectie. Wees voorzichtig en laat geen luchtbellen te introduceren.
- Nucleofect de cellen met behulp program U-014 (gestimuleerde T cellen, humane, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Onmiddellijk voeg 500 ul van voorverwarmde media met rhIL-15 naar de cuvette. Breng de cellen aan een putje van een plaat met 24 putjes met 1,5 ml voorverwarmde media rhIL15.
- Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2.
Dag 2
4. Niet-specifieke stimulatie van T-cellen
- Oogst cellen en bepalen celaantallen. Vernietiging 0,5 x 10 6 cellen voor flowcytometrie om de frequentie van GFP-positieve cellen te bepalen. Gebruik de niet-getransfecteerde PBMC als controles.
- Zuig het CD3/28 antilichaamoplossing uit de niet weefselkweek gecoate platen en spoel elk putje met T-cel media.
- Resuspendeer de nucleofected cellen bij 0,5 x 10 6 cellen per ml in compleet media CTLaangevuld met 5 ng / ml rhIL-15. Voeg 2,0 ml van de cellen in nucleofected 4 wells van de niet weefselkweekplaat. Voeg 0,5 x 10 6 cellen niet nucleofected de 5e goed.
- Incubeer gedurende 3 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO2.
Dag 5
- Oogst de gestimuleerde T-cellen van niet-beklede weefselkweekplaat.
- Tellen en de cellen replate in een 24 wells beklede weefselkweekplaat van 0,7 x 10 6 cellen / ml in T cell media met 5 ng / ml IL-15.
Dag 7
7. Analyse van genexpressie
- Oogst cellen en vlekken met anti-humaan CD8 antilichaam (kon ook anti-CD3 en anti-CD4) en geanalyseerd met flowcytometrie voor GFP expressie%.
Dag 8 (Optioneel)
8. Expansie van T-cellen
- Op dag 8 na transfectie, kunnen T-cellen worden opnieuw uitgeplaat in T-Celmedium met IL-15 bij een dichtheid van 0,7 x 10 6 cellen per putje voor verdere uitbreiding 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische tonen de stappen genetische verandering menselijke T-lymfocyten met een reportergen (eGFP) wordt getoond in Figuur 1. Deze plasmiden zijn op verzoek verkrijgbaar bij de auteurs. Een schemtic tonen de stappen in genetisch gemodificeerde humane T-lymfocyten met een reportergen (eGFP) is showin in figuur 2. Er moet T-cellen activeren om hen te verdelen, uitbreiden en in cultuur propageren. Gemodificeerde menselijke T-cellen werden vervolgens geanalyseerd met behulp van flowcytometrie voor genexpressie op dag 1 en dag 7. Getoond worden de resultaten van een donor in figuur 3. Cellen werden gekleurd met allophycocyanine (APC)-geconjugeerde anti-CD8, geanalyseerd eGFP (het transgen) en APC fluorescentie door een FACSCalibur met de filter set voor 4 fluorescentiesignalen met Cell Quest software (Becton Dickinson). We hebben eerder waargenomen genetische modificatie van zowel CD4 en CD8 positieve T-cellen en hierin demonStrate CD8 positieve cellen als voorbeeld 7. Hoewel we geanalyseerd enkel transgen expressie hierin is piggyBac ook gebruikt voor multi-gen (of multiplex) genoverdracht in menselijke cellen 17. De daling in eGFP expressie tussen dag 1 en dag 7 is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat niet alle getransfecteerde cellen stabiele integratie van transposon DNA ondergaan.
Figuur 1. Schema van plasmiden voor piggyBac gemedieerde genetische modificatie van humane T-cellen. CMV, cytomegalovirus promotor, intron, SV40 intron voor mRNA stabiliteit; piggyBac, transposase cDNA; SV40 pA, polyadenylatieplaats, pUC, oorsprong van replicatie; b-lactamase, ampicillineresistentiegen, PB3'IR, "inverted repeat; PB5 'piggyBac 3 IR, piggyBac.. Inverted repeat 5 ', ZeoR, zeocine resistentiegen, R6K Ori, oorsprong van replicatie, IVS, tussenliggende sequentie, eGFP, fluorescerende reporter gen Opmerking: antibiotica werden gebruikt voor bacteriële selectie en groei maar niet in T cel cultures Hier grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Schematische beschrijving van de modificatie van primaire menselijke T-cellen met het piggyBac transposon systeem.
Figuur 3. Stabiele expressie in transgene T-cellen gemodificeerd met de piggyBac transposon system. Linkerpanelen: eGFP expressie op dag 1. Rechts panelen:. EGFP uitdrukking op dag 7 Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven werkwijze worden stabiele transgene modificatie van primaire menselijke T-lymfocyten. We hebben eerder geteste het gebruik van het piggyBac transposon systeem T-cellen wijzigen om een reportergen (meer dan 4 weken), een niet-immunogene suïcidegen een chimeer antigen receptor voor adoptieve immunotherapie (langer dan 100 dagen) te drukken, en om de weerstand ingenieur aan immunosuppressieve geneesmiddelen 7,13-15. Niet-virale modificatie van T cellen voor adoptieve immunotherapie en andere toepassingen moeten veel goedkoper en dus veel gebruikt dan retrovirale transductie. Het gebruik van nieuwe hyperactieve piggyBac elementen is bedoeld om de haalbaarheid van productie van stabiele transgene gemodificeerde humane T-cellen 9. Hoewel niet beschreven, kan men bereiken noodzakelijke aantal stabiel getransfecteerde T cellen potentiële klinische toepassing. Een combinatie van piggyBac-gemedieerde genoverdracht en aK562 (kunstmatig antigeenpresenterende) voedingscellen, een eerste opbrengst van ongeveer 2 x 10 6 stabiel getransfecteerde T-cellen kan worden uitgebreid met 4 tot 5 logs meer dan 10 10 T cellen getransduceerd in 4 tot 5 weken en 10 12 6 tot 7 week 7. Analyse van piggyBac integratieplaatsen in humane T cellen vertoonden geen voorkeur voor proto-oncogenen, echter toonden een voorkeur voor integratie in hoge mate tot expressie gebrachte genen in geactiveerde T-cellen bij gebruik van de bovengenoemde technologie nucleofectie 13. PiggyBac een veelbelovende methode voor stabiele genetische modificatie van humane T-cellen voor een groot aantal toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
SS wordt gedeeltelijk ondersteund door de HHMI Med in Grad Training Grant door de TBMM Program. MHW wordt gedeeltelijk ondersteund door een loopbaanontwikkeling onderscheiding van de Department of Veterans Affairs en de genereuze steun van dr. en mevrouw Harold M. Selzman. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door NIH lymfoom SPORE subsidie P50CA126752 en NIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
