Summary
אנו מתארים שיטה גנטית כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים עם transgene שימוש שאינו ויראלי
Abstract
מערכת transposon piggyBac היא טבעי פעילה, המופק ממקור 1,2 כרוב Looper העש. מערכת שאינה נגיפית זה פלסמיד מבוסס, בדרך כלל ניצול שני פלסמידים עם אחד המבטא את אנזים transposase piggyBac וtransposon פלסמיד מטפח את הגן (ים) של עניין בין אלמנטים חוזרים הפוכים אשר נדרשים לפעילות העברת גנים. העברת גנים מתווך PiggyBac דרך מנגנון "גזור ודבק" לפי transposase משלב קטע transposon לתוך הגנום של תא המטרה (הים) של עניין. PiggyBac הוכיח פעילות מסירת גן יעילה במגוון רחב של חרקי 1,2, 3-5 יונקים, ו אדם cells6 לרבות תאי T אנושיים ראשוניים 7,8. לאחרונה, transposase piggyBac היפראקטיבי נוצר שיפור יעילות העברת גני 9,10.
תאי T של אדם הם intere הקלינירח לחיסון מאמצת של 11 סרטן. מן ראוי לציין כי הניסוי הקליני הראשון הכולל שינוי transposon של תאי T אנושיים המשתמשים במערכת transposon היפיפייה הנרדמת אושר 12. יש לנו הערכה בעבר את השירות של piggyBac כהמתודולוגיה שאינה נגיפית הנדסה גנטית של תאי T אנושיים. מצאנו piggyBac להיות יעיל בשינוי הגנטי של תאי T אנושיים עם גן כתב וגן ההתאבדות מושרה אינו immunogenic 7. ניתוח של אתרי אינטגרציה הגנומי חשף חוסר ההעדפה להשתלבות או ליד אונקוגנים פרוטו ידוע 13. אנחנו השתמשנו piggyBac לימפוציטים גנים לשנות ציטוטוקסיות T לבצע קולט אנטיגן chimeric מופנה כנגד אנטיגן גידול HER2, וגילינו כי תאים ששונו גנטי T מתווכים סיכול ממוקדים של תאי גידול מסוג HER2 חיוביים במבחנת in vivo במודל עכבר orthotopic 14. השתמשנו גם piggyBacכדי לייצר תאי T אנושיים עמידים לrapamycin, אשר אמור להיות יעילים בטיפול בסרטן שבי rapamycin מנוצל 15.
בזאת, אנו מתארים שיטה לשימוש piggyBac גנטי כדי לשנות את תאי T אנושיים ראשוניים. זה כולל בידוד של תאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) מדם של בני אדם ואחריו תרבות, שינוי גנטי, והפעלת תאי טי. לצורך הדו"ח זה, תאי T שונו עם גן כתב (eGFP) לניתוח וכימות של ביטוי גנים על ידי cytometry זרימה.
PiggyBac ניתן להשתמש כדי לשנות את תאי T אנושיים עם מגוון רחב של גנים של עניין. למרות שיש לנו להשתמש piggyBac לכוון תאי T לאנטיגנים סרטניים 14, יש לנו גם בשימוש piggyBac להוסיף מתג בטיחות מושרה על מנת לחסל תאים מהונדסים גנטיים במידת צורך 7. קיבולת המטען הגדולה של piggyBac גם אפשרה העברת גנים שלמולקולה גדולה rapamycin עמיד mTOR (15 ק"ג) 15. לכן, אנו מציגים מתודולוגיה שאינה נגיפית לגני שינוי יציב של תאי T האנושיים ראשוניים למגוון רחב של מטרות.
Protocol
יום 0
1. בידוד של PBMCs דם אנושי
- איסוף 20 מ"ל של דם אדם טרי באמצעות venipuncture לתוך צינורות vacutainer Na-ההפרין.
- דם תערובת והמתקדמת RPMI 1640 ב1:1 (v / v) יחס.
- הוסף בינוני 20 מ"ל lymphoprep לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל (25 מעלות צלזיוס). לאט 25-30 מיליליטר שכבה של 1640 תמהיל דם RPMI על גבי lymphoprep.
- צנטריפוגה XG ב 400 במשך 40 דקות ללא בלמים.
- לאסוף שתי שכבות נפרדות ומטושטשות באמצעות פיפטה פנויה ל10 מ"ל של 1x PBS (25 ° C) ולהביא את הנפח של עד 50 מ"ל עם 1x PBS.
- צנטריפוגה ב XG 450 עבור 10 דקות.
- לשאוב supernatant לחלוטין ולהוסיף 20 מ"ל של המתקדם RPMI 1640.
- צנטריפוגה XG ב 400 למשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant. הוסף 10 מ"ל של תקשורת הסלולרית T המלאה בתוספת 5 ng / ml rhIL-15 prewarmed ב 37 ° C.
- לספור את מספר התאים והצלחת בפרוות תרביות רקמה גם 24צלחת אד ב2 10 x 6 תאים / גם בתקשורת סלולרית T המלאה בתוספת 5 ng / ml rhIL-15 הוסף מים סטריליים לבארות סמוכות. דגירת הלילה בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
יום 1
2. פלטות עם ציפוי אנטי-CD28 ואנטי CD3 נוגדן לגירוי תאי T
- דלל נוגדנים אנטי CD28 ואנטי CD3 במים סטריליים בריכוז של מיקרוגרם 1 / מ"ל כל אחד.
- הוסף 500 μl פתרון כל נוגדנים ל 5 בארות מסומנות של תרבות רקמות שאינן מצופית 24 צלחת היטב.
- הוסף מים סטריליים כדי לנוח מהבארות. עטוף את הצלחת בניילון ומקום פסיכולוג ב4 ° C מקרר.
3. Nucleofection של תאי T Unstimulated
- ° C ותוספת עם 5 ng / ml של rhIL-15 תקשורת הסלולרית T Prewarm ב 37. להכין תמיסת nucleofector מלאה על ידי הוספת 500 μl של מוסף Nucleofector 1-2.25 מ"ל של פתרון Nucleofector.
- 5 מיקרוגרם liquot כל אחד מtransposon (Zeo-PT-CMV-eGFP) וtransposase (pCMV-piggyBac) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge הערה:. זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל transposase וכמות DNA transposon למסירת גן אופטימלית ולמזער רעילות סלולרית. את פלסמידים ניתן לקבל מהמחברים על ידי בקשה.
- PBMCs אסיף מצלחת 24 גם תרבות הרקמה לתוך צינור מ"ל 50. לספור את מספר התאים. שמור 2 10 x 6 תאים לשימוש כשליטה במהלך cytometry זרימה.
- הוסף 07-10 אוקטובר 6 תאי x לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה XG ב 400, 5 דקים ', לשאוב supernatant ואצבע קפיצי הגלולה.
- הוסף 100 μl של פתרון תא T מלא nucleofection לרופף תא גלול.
- הוסף את תערובת פתרון תאים למבחנה המכילה את פלסמידים.
- מוסיף את התערובת בתאי פלסמיד פתרון לחלק התחתון של קובט nucleofection. היזהר שלא להציג את כל בועות.
- Nucleofect התאים באמצעות פרוגרם U-014 (תאי T, Unstimulated אדם, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/).
- מייד להוסיף 500 μl של תקשורת prewarmed עם rhIL-15 לקובט. להעביר את התאים להיטב של צלחת גם 24 עם 1.5 מ"ל של תקשורת עם prewarmed rhIL15.
- דגירת הלילה בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
יום 2
4. גירוי לא ספציפי של תאי T
- תאי קציר ולקבוע מספרים סלולריים. להפריש 0.5 x 10 6 תאים לזרימה cytometry כדי לקבוע את התדירות של תאי GFP חיוביים. השתמש בPBMCs הלא transfected כקבוצת ביקורת.
- לשאוב את פתרון נוגדן CD3/28 מהצלחת שאינה רקמת התרבות המצופית ולשטוף היטב עם כל תקשורת סלולרית טי.
- Resuspend תאי nucleofected ב0.5 10 x 6 תאים למ"ל בתקשורת CTL המלאהבתוספת 5 ng / ml rhIL-15. הוסף 2.0 מ"ל כל אחד מתאי nucleofected ב 4 בארות של צלחת תרבית הרקמה שאינן. הוסף 0.5 x 10 6 תאי nucleofected שאינם ל 5 כן.
- דגירה במשך 3 ימים בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
יום 5
- לקצור את תאי T מגורה מצלחת תרבית הרקמה שאינה המצופית.
- לספור וreplate את התאים בתרבית רקמת צלחת גם מצופית 24 על 0.7 x 10 6 תאים / מ"ל בתקשורת סלולרית T עם 5 ng / ml IL-15.
יום 7
7. ניתוח של ביטוי גנים
- תאי קציר וכתם עם CD8 נוגדן אנטי אנושי (אפשר גם להשתמש CD4 אנטי אנטי CD3 ו) ולנתח עם cytometry זרימה לביטוי של GFP%.
יום 8 (אופציונלי)
8. התרחבות של תאי T
- ביום 8 לאחר transfection, תאי T ניתן replated בTמדיה סלולרית עם IL-15 בצפיפות של 0.7 x 10 6 תאים לכל גם להתרחבות נוספת 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכמטי להדגים את השלבים בשינוי תאי T אנושיים עם גן כתב (eGFP) הגנטי מוצג באיור 1. פלסמידים אלה זמינים על פי בקשה מהמחברים. Schemtic מדגים את השלבים בלימפוציטים מסוג T האנושי מהונדס גנטי עם גן כתב (eGFP) הוא showin באיור 2. זה הכרחי להפעלת תאי T על מנת לקבל אותם להתחלק, להתרחב, ולהפיץ בתרבות. תאי T האנושיים השתנו אז היו בתרבית ונותחו באמצעות cytometry זרימה על ביטוי גנים ביום 1 ויום 7. הראה הם תוצאות מתורם אחד באיור 3. תאים הוכתם allophycocyanin (APC)-מצומדות אנטי CD8, נתח לeGFP (transgene) וAPC פלואורסצנטי ידי FACSCalibur מצויד בסט המסנן עבור 4 אותות קרינה באמצעות תוכנת Quest סלולרי (הקיטון דיקינסון). אנו צפינו בשינוי גנטי של שני CD4 CD8 ותאי T חיוביים ושד בזאת בעברStrate CD8 תאים חיוביים כדוגמה 7. למרות שנותחנו בהסכם ביטוי transgene יחיד, piggyBac שמש גם להעברת גני גנים רבים (או multiplexed) בתאים אנושיים 17. הירידה בביטוי eGFP בין היום 1 ויום 7 היא ככל הנראה בשל העובדה כי לא כל תאי transfected לעבור אינטגרציה יציבה של DNA transposon.
איור 1. סכמטי של פלסמידים משמשים לשינוי גנטי בתיווך piggyBac של תאי T אנושיים. CMV, אמרגן ציטומגלווירוס; אינטרון, SV40 אינטרון לייצוב mRNA; piggyBac, transposase cDNA; הרשות פלסטינית SV40, אתר polyadenylation; PUC, מקורו של שכפול; 'חוזר הפוך; PB5' PB3'IR, piggyBac 3; ב-lactamase, גן התנגדות אמפיצילין IR, piggyBac.. חוזרת '5 הפוכים; ZeoR, גן התנגדות zeocin; R6K האורים, מקורו של שכפול; צינורות עירוי, הרצף להתערב; eGFP, גן הכתב פלואורסנט הערה: אנטיביוטיקה המשמשת לבחירה והתפתחות חיידקים, אך לא הייתה בשימוש בתרביות תאי T לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. סכמטי המתאר את השינוי של תאי T האנושיים ראשוניים באמצעות מערכת transposon piggyBac.
איור 3. ביטוי transgene יציב בתאי T שונה עם piggyBac transposon systeמ '. לוחות שמאל: ביטוי eGFP על יום 1. פנלי ימין:. ביטוי eGFP ביום 7 לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשרת שינוי transgene יציב של לימפוציטים מסוג T האנושי ראשוני. בדקנו את השימוש במערכת transposon piggyBac עבר לשנות תאי T להביע גן כתב (יותר מ 4 שבועות), גן התאבדות אינו immunogenic, קולט אנטיגן chimeric לחיסון מאמצת (ליותר מ 100 ימים), ולהנדס התנגדות לתרופות מדכאות חיסון 7,13-15. שינוי ללא נגיפי של תאי T לחיסון מאמצת ויישומים אחרים צריך להיות הרבה פחות יקר ולכן מנוצלים באופן נרחב יותר מאשר תמרת retroviral. השימוש באלמנטים של piggyBac היפראקטיביים חדשים צריך להגדיל את הכדאיות של ייצור של transgene היציב השונים T תאי אדם 9. למרות שלא תואר כאן, ניתן להשיג מספרים דרושים של תאי T transfected יציבות ליישום קליני פוטנציאלי. באמצעות שילוב של העברה וAK גן piggyBac בתיווך562 (אנטיגן הצגה המלאכותי) תאים מזינים, תשואה ראשונית של כ 2 10 6 תאי T transfected ביציבות x ניתן להרחיב על ידי 4-5 יומנים ליותר מ 10 10 transduced תאי T ב 4 עד 5 שבועות ועד 10 12 ב6-7 שבועות 7. ניתוח של אתרי אינטגרציה piggyBac בתאי T אנושיים לא הראה שום הטיה לאב - אונקוגנים, עם זאת, זה לא מראה נטייה להשתלבות בגנים הביעו מאוד בתאי T מופעלים בעת שימוש בטכנולוגית nucleofection תוארה לעיל 13. PiggyBac מייצג מתודולוגיה מבטיחה ליציב הנדסה גנטית של תאי T אנושיים למגוון רחב של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
האס נתמך בחלקו על ידי HHMI המד לגראד ההדרכה גרנט באמצעות תכנית TBMM. MHW נתמך בחלקו על ידי פרס קריירת פיתוח מהמחלקה לענייני יוצאי הצבא ותמיכתה הנדיבה של ד"ר והגב 'הרולד Selzman. עבודה זו נתמכה גם בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות לימפומה נבג המענק P50CA126752 וNIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
