Summary
Vi beskriver ett förfarande för att genetiskt modifiera primära humana T-celler med en transgen med det icke-virala
Abstract
Det piggyBac transposon systemet är naturligt aktiva, ursprungligen härrör från kål griparen mal 1,2. Denna icke-viralt system är plasmiden baserad, vanligast använda två plasmider med en uttrycker piggyBac transposaset enzymet och en transposon-plasmid hyser genen (generna) av intresse mellan inverterade repetetiva element som krävs för genöverföring aktivitet. PiggyBac förmedlar genöverföring genom en "klippa och klistra"-mekanism varigenom transposaset integrerar transposonen segmentet i genomet hos målcellen (er) av intresse. PiggyBac har visat effektiv aktivitet gentillförsel i en mängd olika insekter 1,2, däggdjurs 3-5, och mänskliga cells6 inklusive primära humana T-celler 7,8. Nyligen har en hyperaktiv piggyBac transposas genereras effektivisering genöverföring 9,10.
Humana T-lymfocyter är av klinisk interest för adoptiv immunterapi av cancer 11. Att notera, har den första kliniska studie med transposon modifiering av humana T-celler med hjälp av Sleeping Beauty transposon godkänts 12. Vi har tidigare utvärderat användbarheten av piggyBac som en icke-viral metodik för genetisk modifiering av mänskliga T-celler. Vi hittade piggyBac att vara effektiv i genetisk modifiering av mänskliga T-celler med en reportergen och en icke-immunogen inducerbar självmordsgen 7. Analys av genomiska integrationsställen avslöjade en brist på preferens för integration i eller nära kända proto-onkogener 13. Vi använde piggyBac till gen-modifiera cytotoxiska T-lymfocyter att bära en chimär antigenreceptor riktad mot tumörantigenet HER2, och fann att gen-modifierade T-celler medierad riktade dödande av HER2-positiva tumörceller in vitro och in vivo i ett ortotopisk musmodell 14. Vi har också använt piggyBacatt generera humana T-celler resistenta mot rapamycin, som bör vara användbara i cancerterapier där rapamycin används 15.
Häri beskriver vi en metod för att använda piggyBac att genetiskt modifiera primära humana T-celler. Detta inbegriper isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från humant blod, följt av odling, genmodifiering, och aktivering av T-celler. Vid tillämpningen av denna rapport har T-celler modifierade med en reportergen (EGFP) för analys och kvantifiering av genuttryck genom flödescytometri.
PiggyBac kan användas för att modifiera humana T-celler med en mängd olika gener av intresse. Även om vi har använt piggyBac att styra T-celler till tumörantigener 14 har vi också använt piggyBac att lägga till en switch inducerbart säkerhet för att eliminera genmodifierade celler om det behövs 7. Den stora lastkapacitet på piggyBac har också gjort det möjligt genöverföring aven stor rapamycin resistent mTOR molekyl (15 kb) 15. Därför presenterar vi en icke-viral metod för stabil gen-modifiering av primära humana T-celler för en mängd olika syften.
Protocol
Dag 0
1. Isolering av PBMC från humant blod
- Samla 20 ml färskt humant blod med användning av venpunktion i Na-heparin vacutainerrör.
- Blanda blod och avancerad RPMI 1640 i 1:1 (v / v) förhållande.
- Tillsätt 20 ml Lymphoprep medium till en 50 ml centrifugrör (25 ° C). Långsamt skikt 25-30 ml blod-RPMI 1.640 blandning ovanpå Lymfoprep.
- Centrifugera vid 400 xg under 40 min utan bromsar.
- Samla både distinkta och fuzzy skikt med en engångspipett i 10 ml 1 x PBS (25 ° C) och späd till 50 ml med 1 x PBS.
- Centrifugera vid 450 x g under 10 minuter.
- Aspirera supernatanten fullständigt och tillsätt 20 ml Avancerad RPMI 1640.
- Centrifugera vid 400 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten. Tillsätt 10 ml av komplett T-cell-medium kompletterat med 5 ng / ml rhIL-15 förvärmt vid 37 ° C.
- Räkna antalet celler och platta i en 24 brunnars vävnadsodlingsplatta coated platta vid 2 x 10 6 celler / brunn i komplett T-cell-medium kompletterat med 5 ng / ml rhIL-15 Lägg sterilt vatten till omgivande brunnar. Inkubera över natten i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
Dag 1
2. Coating Plattor med anti-CD28 och anti-CD3-antikropp för att stimulera T-celler
- Späd anti-CD28 och anti-CD3-antikroppar i sterilt vatten vid en koncentration av 1 pg / ml vardera.
- Lägg 500 pl varje antikroppslösning till 5 märkta brunnar i en icke-belagd vävnadskultur 24 brunnsplatta.
- Tillsätt steril vatten till resten av brunnarna. Linda plattan i krympplast och placera det i en 4 ° C kylskåp.
3. Nucleofection av Ostimulerade T-celler
- Förvärm T-cell medier vid 37 ° C och komplettera med 5 ng / ml rhIL-15. Bered komplett nucleofector lösning genom att tillsätta 500 pl Nucleofector tillägg 1 till 2,25 ml Nucleofector lösning.
- ENliquot 5 pg vardera av transposon (Zeo-pT-CMV-EGFP) och transposas (pCMV-piggyBac) i ett 1,5 ml mikrofugrör Anm:. kan det vara nödvändigt att optimera transposaset och transposonet DNA belopp för optimal gentillförsel och minimera cellulär toxicitet. Plasmiderna kan erhållas från författarna på begäran.
- Harvest PBMC från 24 brunnars vävnadsodlingsplatta i en 50 ml tub. Räkna antalet celler. Spara 2 x 10 6 celler för användning som kontroll under flödescytometri.
- Lägg 7-10 x 10 6 celler till en 15 ml rör och centrifugera vid 400 xg, 5 minuter, aspirera supernatanten och finger-snärt pelleten.
- Tillsätt 100 | il av T-cell komplett nucleofection lösning lossas cellpellet.
- Tillsätt lösningen-cellblandningen till röret innehållande plasmiderna.
- Tillsätt lösningen-cell-plasmiden blandningen till botten av nucleofection kyvetten. Var noga med att inte införa några bubblor.
- Nucleofect cellerna med program U-014 (Ostimulerade T-celler, mänskliga, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Omedelbart tillsätt 500 pl förvärmd medier med rhIL-15 till kuvetten. Överför cellerna till en brunn i en 24 brunnars platta med 1,5 ml förvärmd media med rhIL15.
- Inkubera över natten i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
Dag 2
4. Ospecifik Stimulering av T-celler
- Harvest celler och bestämma cellantal. Avsätt 0,5 x 10 6 celler för flödescytometri för att bestämma frekvensen av GFP-positiva celler. Använd de icke-transfekterade PBMC som kontroller.
- Aspirera CD3/28 antikroppslösningen från den icke vävnadskultur belagd platta och skölj varje brunn med T-cell-medier.
- Återsuspendera nucleofected celler vid 0,5 x 10 6 celler per ml i komplett CTL medierkompletterat med 5 ng / ml rhIL-15. Tillsätt 2,0 ml vardera av de nucleofected cellerna i 4 brunnar av den icke vävnadsodlingsplattan. Lägg 0,5 x 10 6 icke nucleofected celler till 5: e brunn.
- Inkubera under 3 dagar i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
Dag 5
- Skörda de stimulerade T-celler från den icke-belagda vävnadskulturplatta.
- Räkna och förnyad utbredning cellerna i en 24 väl belagd vävnadsodlingsplatta vid 0,7 x 10 6 celler / ml i T-cellmedium med 5 ng / ml IL-15.
Dag 7
7. Analys av genuttryck
- Harvest celler och färgas med anti-human CD8 antikropp (kan även använda anti-CD3 och anti-CD4) och analysera med flödescytometri för% GFP uttryck.
Dag 8 (tillval)
8. Expansion av T-celler
- På dag 8 efter transfektion, kan T-celler ströks åter i T-Cellmedium med IL-15 vid en densitet av 0,7 x 10 6 celler per brunn för ytterligare expansion 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk visar stegen i genetiskt modifiera humana T-lymfocyter med en reportergen (EGFP) visas i figur 1. Dessa plasmider finns tillgängliga på begäran från författarna. En schemtic visar stegen i genetiskt modifierade humana T-lymfocyter med en reportergen (EGFP) är showin i figur 2. Det är nödvändigt att aktivera T-celler för att få dem att dela, expandera och propagera i kultur. Modifierade humana T-celler odlades sedan och analyserades med användning av flödescytometri för genexpression på dag 1 och dag 7. Visas är resultat från en donator i figur 3. Celler färgades med allofykocyanin (APC)-konjugerad anti-CD8, analyserades för EGFP (transgenen) och APC fluorescens genom en FACSCalibur utrustad med filtret uppsättning för 4 fluorescenssignaler med hjälp av programvara Cell Quest (Becton Dickinson). Vi har tidigare observerat gen modifiering av både CD4-och CD8-positiva T-celler och häri demondemonstrera CD8 positiva celler som ett exempel 7. Även om vi analyserade för enstaka transgenuttryck häri, har piggyBac också använts för multi-gen (eller multiplexerade) genöverföring i humana celler 17. Minskningen i EGFP expression mellan dag 1 och dag 7 beror sannolikt på det faktum att inte alla transfekterade celler genomgå stabil integrering av transposon-DNA.
Figur 1. Schematisk av plasmider som används för piggyBac medierad gen modifiering av humana T-celler. CMV, cytomegalovirus-promotor, intron, SV40-intron för mRNA-stabilisering, piggyBac, transposas-cDNA, SV40-pA, polyadenyleringsställe, pUC, replikationsursprung, b-laktamas, ampicillinresistensgen, PB3'IR, piggyBac 3 'inverterad upprepning, PB5' IR, piggyBac.. 5 "inverterad upprepning, ZeoR, zeocin resistensgen, R6K Ori, replikationsursprung, IVS, mellanliggande sekvens, EGFP, fluorescerande reportergen Anmärkning: antibiotika användes för bakteriell urval och tillväxt, men användes inte i T cellkulturer Klicka här att visa större bild .
Figur 2. Schematisk beskriver modifieringen av primära humana T-celler med hjälp av piggyBac transposon systemet.
Figur 3. Stabil transgenexpression i T-celler modifieras med piggyBac transposonen systemam.. Vänster paneler: EGFP uttryck på dag 1. Höger sida:. EGFP uttryck på dag 7 Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs häri möjliggör stabil transgen modifiering av primära humana T-lymfocyter. Vi har tidigare testat användningen av piggyBac transposonen systemet att modifiera T-celler att uttrycka en reportergen (mer än 4 veckor), en icke-immunogen självmord gen, en chimär antigen receptor för adoptiv immunterapi (mer än 100 dagar), och ingenjör motstånd mot immunsuppressiva läkemedel 7,13-15. Icke-virala modifiering av T-celler för adoptiv immunterapi och andra applikationer bör vara mycket billigare och därför mer allmänt utnyttjade än retroviral transduktion. Användningen av nya hyperaktiva piggyBac delar bör öka möjligheten att tillverkningen av en stabil transgen modifierad humana T-celler 9. Även om det inte beskrivs häri, kan man uppnå nödvändiga antal stabilt transfekterade T-celler för potentiell klinisk tillämpning. Med en kombination av piggyBac-genöverföring och AK562 (artificiell antigenpresenterande) matarceller, en initial utbyte av ca 2 x 10 6 transfekterade stabilt T-celler kan expanderas genom 4 till 5 stockar till över 10 10 transducerade T-celler i 4 till 5 veckor och 10 12 i 6 till 7 veckor 7. Analys av piggyBac integration platser i humana T-celler visade ingen bias mot proto-onkogener, men gjorde det visar en förkärlek för integrering i hög grad uttryckta gener i aktiverade T-celler när du använder nucleofection teknik som beskrivs ovan 13. PiggyBac är en lovande metod för stabil genetisk modifiering av humana T-celler för en mängd olika tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
SS stöds delvis av HHMI Med i Grad Training Grant genom TBMM programmet. MHW stöds delvis av en karriärutveckling utmärkelse från Department of Veterans Affairs och generöst stöd av Dr och Mrs Harold M. Selzman. Detta arbete stöddes också delvis av NIH lymfom SPORE bidraget P50CA126752 och NIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C.
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
