Summary
אנו מתארים את ההכנה של נקודתי קוונטיות colloidal עם גודל הידרודינמית ממוזער עבור דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדה. בהשוואה לנקודות קוונטיות קונבנציונליות, חלקיקים אלה הם בגודל דומים לחלבונים כדוריים ומותאמים לבהירות מולקולה בודדה, יציבות נגד photodegradation, והתנגדות לקשירה לא ספציפית לחלבונים ותאים.
Abstract
הדמיה יחידה מולקולה היא כלי חשוב להבנת המנגנונים של תפקוד biomolecular ולהמחשת הטרוגניות מרחב ובזמן של התנהגויות מולקולריות שבבסיס ביולוגיה תאית 1-4. לתמונת מולקולה בודדה של עניין, זה בדרך כלל מוצמד לניאון תג (צבע, חלבון, חרוז, או נקודה קוונטית) ונצפה עם השתקפות מיקרוסקופ הפנימי epifluorescence או מלא פלואורסצנטי (TIRF). אמנם צבעים וחלבוני ניאון היו עמוד התווך של דימות פלואורסצנטי במשך עשרות שנים, הקרינה שלהם אינה יציבה תחת נתיבים גבוהים פוטון דרושים כדי להתבונן מולקולות בודדות, מניב רק כמה שניות של התבוננות לפני האובדן מוחלט של אות. חרוזים וחרוזי לטקס צבע כותרת-לספק יציבות אות השתפרה אבל על חשבון גודל הידרודינמית דרסטי גדול יותר, שיכול לשנות deleteriously דיפוזיה וההתנהגות של המולקולה נחקרת.
ntent "> נקודות קוונטיות (QDs) מציע איזון בין שני משטרים הבעייתיים אלה. חלקיקים אלה מורכבים מחומרים מוליכים למחצה ויכולים להיות מהונדס בגודל hydrodynamically קומפקטי עם עמידות יוצאת דופן לphotodegradation 5. כך בשנים האחרונות QDs היה גורם חשוב במאפשר תצפית ארוכת טווח של התנהגות macromolecular המורכבת ברמת המולקולה הבודדה. עם זאת חלקיקים אלה עדיין נמצאו להפגין דיפוזיה מולקולריות לקויה בסביבות צפופות כגון ציטופלסמה התאית ועצבית סינפטית שסועה, בו הגדלים שלהם עדיין גדולים מדי 4,6 , 7.לאחרונה יש לנו מהונדסים הליבות וציפויי פני שטח של QDs לגודל הידרודינמית ממוזער, תוך איזון קיזוז ליציבות colloidal, photostability, בהירות, ומחייב לא ספציפי שהפריע את התועלת של QDs הקומפקטי ב8,9 העבר. מטרת מאמר זה היא להראותהסינתזה, שינוי, והאפיון של nanocrystals אופטימיזציה אלה, מורכבים ממ"כ x Cd ליבת 1-x Se alloyed מצופה בבידוד Cd y 1-y Zn S קליפה, נוסף מצופה בפולימר יגנד multidentate שונה עם פוליאתילן גליקול הקצרה ( PEG) שרשרות (איור 1). לעומת nanocrystals CdSe הקונבנציונלי, כספית x Cd סגסוגות 1-x Se מציעות תשואות גבוהות יותר של קוונטי פלואורסצנטי, פלואורסצנציה באורכי גל אדומים וקרובים אינפרא אדום לאות לרעש משופר בתאים, ועירור בתחום האור הנראה אינם ציטוטוקסיות. ציפויים פולימריים Multidentate להיקשר אל פני שטח ננו בקונפורמציה סגורה והשטוחה כדי למזער את הגודל הידרודינמית, וPEG מנטרל את מטען המשטח כדי למזער מחייבים לא ספציפית לתאים וביומולקולות. התוצאה הסופית היא ננו מאור ניאון עם פליטה בין 550-800 ננומטר וגודל הידרודינמית כמעט מוחלט 12 ננומטר. זה ביםטווח גודל ame כמו חלבונים רבים מסיסים בתאים כדוריים וקטנים באופן משמעותי מQDs PEGylated הקונבנציונלי (25-35 ננומטר).
Protocol
ההליכים כרוכים בטכניקות הבאים סינתזת אוויר ללא תקן ושימוש ב/ סעפת גז אינרטי ואקום; המתודולוגיה מפורטת ניתן למצוא בהפניות 10 ו 11. MSDS לכל החומרים רעילים ודליקים יש להתייעץ לפני השימוש ותרכובות כל דליקות ו / או אוויר בלתי יציבות יש aliquoted לתוך צלוחיות מחיצה אטומות בתא הכפפות או בתיק כפפה.
1. סינתזה של Selenide קדמיום מרקורי (הכספי x Cd 1-x Se) ליבות נקודה קוונטית
- הכן את פתרון M 0.4 הסלניום בtrioctylphosphine (למעלה). הוסף סלניום (0.316 גרם, 4 mmol) לבקבוק 50 מ"ל 3-צוואר, אז לפנות ולמלא עם הארגון באמצעות קו Schlenk. בתנאים נטולי אוויר (חנקן יבש או אווירת ארגון), להוסיף TOP וחום מ"ל 10-100 ° C תוך ערבוב 1 השעה להניב פתרון ברור, חסר צבע. לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר ולהגדיר את הבקבוק בצד.
- לבקבוק 250 מ"ל 3-צוואר, להוסיף תחמוצת קדמיום (CDO 0.0770 גרם, 0.6 mmol), tetradecylphosphonic חומצה (TDPA, 0.3674 גרם, 1.32 mmol), וoctadecene (יודה, 27.6 מ"ל), ולפנות את הפתרון באמצעות קו Schlenk תוך ערבוב. הגדל את הטמפרטורה ל 100 מעלות צלזיוס, ולפנות ל15 דקות נוספות כדי להסיר זיהומי נקודת רתיחה נמוכה.
- תחת ארגון או גז חנקן, מחמם את התערובת עד 300 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לפרק CDO באופן מלא. הפתרון ישתנה מצבע אדמדם לצלול וחסרי צבע. לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר.
- הוסף hexadecylamine (HDA, 7.0 גר ') לפתרון קדמיום, חום עד 70 מעלות צלזיוס, ולהתפנות. ברגע שלחץ תמידי להשגה, להגביר את הטמפרטורה ל 100-110 מעלות צלזיוס וריפלוקס הפתרון למשך 30 דקות. לעבור את שסתום קו Schlenk לגז אינרטי ולהכניס את הצמד התרמי ישירות לפתרון.
- בתנאים נטולי אוויר, להוסיף diphenylphosphine (DPP, 100 μl) לפתרון ולהעלות את הטמפרטורה של 310 ° C. הסר 7.5 מ"ל של הפתרון 0.4 מ 'TOP-Se(סלניום mmol 3) במזרק פלסטיק חד פעמי מצורף מחט מד 16.
- ברגע שטמפרטורת equilibrates ב310 מעלות צלזיוס, להגדיר את בקר הטמפרטורה ל 0 מעלות צלזיוס, ובזריזות להזריק פתרון TOP-Se ישירות לתוך פתרון קדמיום. הפתרון ישתנה מחסרי צבע לצהוב כתום והטמפרטורה תהיה ירידה במהירות ולהגדיל שוב ל ~ 280 ° C. לאחר 1 דקות של תגובה, הסר את הבקבוקון ממעטפת החימום ומהירות מגניבה עם זרם של אוויר עד שהטמפרטורה היא פחות מ 200 ° C.
- כאשר הטמפרטורה מגיעה ל ~ 40 ° C, לדלל עם 30 המ"ל הקסאן, רוב מבשר קדמיום הנותר יהיה ליישב מחוץ לפתרון. הסר משקע זה על ידי צנטריפוגה (5000 XG, 10 דקות).
- בכל אחד מצינור 6 50 מ"ל פוליפרופילן חרוטי צנטריפוגה, לדלל 12 מ"ל של פתרון ננו הגולמי עם אצטון 40 מ"ל, צנטריפוגה (5000 XG למשך 10 דקות), ובזהירות למזוג ולהשליך supernatant.
- ממס את nanocrכדורי ystal בקסאן (25 מיליליטר נפח כולל). חלץ את הפתרון הזה 3 פעמים עם נפח שווה של מתנול, שמירת השלב העליון. לחילוץ השלישי, הנפח של מתנול יכול להיות מותאם ל~ 15 מ"ל כדי להשיג פתרון הקסאן מרוכז של QDs CdSe הטהור בבערך 200 מיקרומטר. התשואה האופיינית של התגובה הזו היא 3 μmol של nanocrystals CdSe בקוטר של 2.3 ננומטרים (50-60 תשואת תגובת%).
- לקבוע את הקוטר וריכוז ננו על ידי מדידת ספקטרום בליעת UV-VIS ויעוץ בטבלה המידות לגוף של Mulvaney ועמיתים לעבודה 12 ומתאמי הכחדת Bawendi ועמיתים לעבודה 13. ראה נספח לפרטים.
- חילופי קטיון מרקורי: את nanocrystals ניתן להחליף עם כספית באופן חלקי לאדום להעביר את הבליעה ופליטת קרינה. מערבב יחד במטרה הבאה בבקבוקון 20 מיליליטר זכוכית עם stirbar (התגובה הזו עשויה להיות מדורגת כרצויה): 3 המ"ל הקסאן, 2 מיליליטר כלורופורם, Cd מיקרומטר 1 המ"ל 200פתרון Se QD (200 nmol), oleylamine 15 μl (OLA), ו500 μl של פתרון 0.1 מ 'מהמ"כ (OT) 2 בכלורופורם. מרקורי octanethioate (HgOT 2) יכול להיות מוכן על ידי מגיב יצטט כספית וoctanethiol במתנול (ראה נספח). ככל שמתקדם תגובת exchange קטיון, ההיקף אדום המשמרת עשוי להיות במעקב עם ספקטרופוטומטריה ספיגת UV-Vis. לאחר שלהקת הקליטה הרצויה הושגה, מדידת הבליעה של פתרון ננו ב 350 ננומטר ולקבוע מקדם ההכחדה החדשה, בהנחה שריכוז ננו לא השתנה (30.7 מיקרומטר בדוגמה זו). להרוות את התגובה על ידי הסרת כספית unreacted: להוסיף 5 המ"ל decane, הקסאן 10 מ"ל, ומתנול מ"ל 7 ולחלץ פתרון, שמירת השלב העליון המכיל את nanocrystals. לחלץ עוד פעמים בקסאן ומתנול, ולהתאים את עוצמת הקול של מתנול, כך שהשלב העליון הוא ~ 7 מ"ל. אם השלבים הם איטיים להפריד, הפתרון עשוי להיות centrifuged (5000 XG,10 דקות). הוסף TOP 100 μl, OLA 100 μl, וחומצה אולאית 100 μl לnanocrystals אחרי אצטון מ"ל 40 כדי לזרז ירידת משקעים. לאסוף את nanocrystals באמצעות צנטריפוגה ולפזר בקסאן 3 מ"ל. צנטריפוגה שוב כדי להסיר את הרכיבים מסיסים ולקבוע את ריכוז ננו שוב, תוך שימוש במקדם ההכחדה החדש ב 350 ננומטר. אפשר פתרון ננו לגיל במשך לפחות 24 שעות בטמפרטורת חדר לפני שתמשיך לשלב הבא.
2. צמיחה של אבץ גופריתי קדמיום (Cd y Zn 1-y S) Shell
- הכן 0.1 פתרונות מבשרים פגז ז 50 מיליליטר צלוחיות 3-עורפות. קדמיום מבשר: מימה קדמיום יצטט (230.5 מ"ג, mmol 1) ו 10 המ"ל oleylamine (OLA). מבשר אבץ: אבץ יצטט (183.5 מ"ג, mmol 1) 10 מ"ל ואולה. מבשר גופרית: גופרית (32.1 מ"ג, mmol 1) ו 10 מ"ל יודה. תחת ואקום, חום כל פתרון לריפלוקס לשעות 1 עד להניב פתרונות ברורים, ואז אקח עם ארגון. פתרון הגופרית עלוללהיות מקורר לטמפרטורת חדר, אבל מבשרי קדמיום ואבץ נשמרים על כ 50 ° C. חישובים של כמויות מבשרות מעטפת ניתן למצוא בהתייחסות 14.
- הוסף לבקבוק 3-צוואר: המ"כ x Cd 1-x Se QDs (120 nmol, 2.3 קוטר ננומטר), יודה (2 מ"ל), וtrioctylphosphine תחמוצת (topo, 250 מ"ג). לפנות את הקסאן בטמפרטורת חדר באמצעות קו Schlenk. הגדל את הטמפרטורה ל 100 מעלות צלזיוס וריפלוקס במשך 15 דקות. שנה את שסתום קו Schlenk לארגון או גז חנקן ולהכניס את הצמד התרמי בפתרון ננו.
- הגדל את הטמפרטורה עד 120 המעלות צלזיוס, להוסיף 0.5 monolayers של פתרון מבשר גופרית (140 μl), ולאפשר את התגובה כדי להמשיך במשך 15 דקות. aliquots הקטן (<50 μl) ניתן להסיר באמצעות מזרק זכוכית ועוקבת אחר ההתקדמות של התגובה באמצעות פלואורסצנטי ו / או ספקטרופוטומטריה ספיגת UV-Vis. הגדל את הטמפרטורה עד 140 מעלות צלזיוס, להוסיף 0.5 monolayers של פתרון מבשר קדמיום (140 μl), ולאפשר לתגובה כדי להמשיך במשך 15 דקות. הוסף 500 נטולי מי אולה לפתרון תגובת μl.
- ב160 ° C להוסיף 0.5 monolayers של פתרון מבשר גופרית (220 μl) ואחריו כמות שווה של פתרון מבשר אבץ ב 170 ° C עם 15 דקות בין כל הוספה. אז ב 180 מעלות צלזיוס להוסיף 0.25 monolayers של פתרון מבשר אבץ במרווחים של 15 דקות פתרון מבשר גופרית (150 μl) ו.
- לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר ושוב לחשב מקדם הכחדה חדשה לחלקיקים אלה באמצעות ספקטרום UV-Vis, בהנחה שמספר nanocrystals לא השתנה (120 nmol בפתרון 3.8 מיליליטר תגובה). אחסן את פתרון התגובה כתערובת גולמית במקפיא; את nanocrystals עשוי להיות מופשר ומטוהר במידת צורך תוך שימוש באותה השיטה שתוארה בסעיפי 1.8 ו -1.9.
- את nanocrystals ניתן לאפיין באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, ספקטרוסקופיה קליטת UV-Vis ו קרינת ספקטרוסקופיה. תשואת קוונטים יכולה להיותמחושב לחלוטין באמצעות שילוב או תחום יחסית בהשוואה לתקן ידוע בשיטות של 15 הפניה.
3. העברת שלב
- הוסף מטוהר ליבה / קליפה הכספי x Cd 1-x Se / CD y Zn 1-y S QDs (5 מ"ל, 20 מיקרומטר) לבקבוק 50 מ"ל 3-צוואר ולהסיר הקסאן תחת ואקום גבוה להניב סרט יבש. מלא את הבקבוק בארגון, להוסיף נטול המים פירידין (3 מ"ל) לסרט nanoparticle וחום slurry עד 80 ° C. במשך 1-2 שעתי החלקיקים יתמוססו באופן מלא.
- הוסף 1-thioglycerol (מ"ל 1) לפתרון ומערבב במהירות של 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לאחר מכן לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר ולהוסיף triethylamine (0.5 מ"ל) לdeprotonate thioglycerol. מערבב למשך 30 דקות. הפתרון עשוי להיות עכור לאחר התוספת של triethylamine בשל המסיסות הגרועה של nanocrystals הקוטבי בתערובת ממס זה.
- להעביר את הפתרון להמשך QD 50 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה צינורaining תערובת של הקסאן 20 מ"ל ואצטון מ"ל 20, ומערבב היטב. מבודד את nanocrystals זרז באמצעות צנטריפוגה (5000 XG, 10 דקות), ולשטוף את הגלולה עם אצטון.
- ממס את QD גלול ב DMSO (5 מ"ל) עם sonication אמבטיה, ולאחר מכן צנטריפוגה (7000 XG, 10 דקות) כדי להסיר אגרגטים אפשריים. לקבוע את ריכוז nanoparticle מספקטרום ספיגת UV-Vis. פתרון זה של QDs הטהור יש להשתמש במרחק של עד 3 שעות, כמו thiols המשטח יכול להתחמצן לאט בתנאי סביבה באוויר.
- לדלל את תמיסת QD עד 10 מיקרומטר או פחות עם DMSO ולהעביר לבקבוק מ"ל 50. הכן את פתרון 5 מ"ג / מ"ל של חומצת polyacrylic thiolated (סינתזה המפורטת בנספח) בDMSO. הוסף פולימר הפתרון (0.15 מ"ג לפולימר nmol QDs) dropwise לפתרון QD תוך הערבוב ודגת הפתרון בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- לטהר את פתרון QD / פולימר עם ארגון וחום עד 80 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר מכן לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדרד dropwise להוסיף נפח שווה של borate 50 mM נתרן, 8-PH. מערבב למשך 10 דקות.
- לטהר את QDs באמצעות דיאליזה (20 הפסקת KDA) בborate 50 mM נתרן, 8-pH, ולאחר מכן לרכז את החלקיקים באמצעות מסנן צנטריפוגלי (10 הפסקת KDA). לקבוע את הריכוז מספקטרום ספיגת UV-Vis.
4. PEG ציפוי
- בבקבוקון זכוכית עם 4 מיליליטר stirbar, לערבב 1 QDs nmol במאגר borate עם עודף טוחן 40000 x של 750 דה monoamino-פוליאתילן גליקול (30 מ"ג, 40 μmol). אם פונקציונלי כימי ספציפי הוא שיש להוסיף את nanocrystals (למשל hydrazide או maleimide), זה עשוי להיות מוצג על ידי החלפת חלק של-PEG עם האמין-PEG אמין heterobifunctional (שבריר שומה 30% בדרך כלל עובד היטב). לדלל את תמיסת ננו ל1 מיקרומטר עם חיץ borate. תגובה זו עשויה להיות מדורגת כרצונך.
- הכן את פתרון חדש של DMTMM (20 מ"ג, 72 μmol) בDMSO (144 μl). פתרון זה יכול להיות מחומם בקצרה under זרם של ברז מים חמים או מתחת למים באמבטיה sonicator לפזר DMTMM באופן מלא. להוסיף במהירות העולה 25,000 x טוחן של פתרון זה 0.5 מ 'DMTMM (50 μl) לפתרון QD ומערבב בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
- חזור על שלב 4.2 עוד ארבע פעמים כדי להרוות את משטח ננו עם PEG. לבסוף, להוסיף 200 μl 1 ז טריס החיץ כדי להרוות את התגובה ולטהר את nanocrystals באמצעות דיאליזה, מסננים צנטריפוגליים, או ultracentrifugation.
- את nanocrystals עשוי להיות מנותח לmonodispersity, גודל הידרודינמית, ותשלום לפני שטח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ג'ל אלקטרופורזה agarose, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לקבוע את הגודל הידרודינמית והתפלגות גודל באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטית (GE AKTAprime פלוס), השתמש בעמודת 6 Superose, קצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה עם eluent חיץ PBS, וזיהוי קליטה ב260 או 280 ננומטר. השווה פעמי elution nanoparticle עם אלה של סטנדרטי משקל מולקולריים. לagarose ג'ל electrophoמתנ, להכין 0.5% agarose ג'ל בחיץ 50 mM נתרן borate (pH 8.5) או חיץ 50 mM נתרן פוספט (pH 7.4), לערבב 1 דגימות מיקרומטר עם גליצרול 10% ועומס לתוך בארות, ולהפעיל ב100 וולט למשך 30 דקות . תמונה את nanocrystals בג'ל באמצעות שרביט יד UV או transilluminator UV ולעירור קרינה. לתמונה את nanocrystals ברמת המולקולה הבודדה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לדלל את החלקיקים ל -0.2 ננומטר בחיץ פוספט 10 מ"מימ, ירידה של 2.5 μl הפתרון בcoverslip זכוכית, ומניח בזהירות על coverslip 2 העליונים של חרוז נוזל להתפשט סרט בין coverslips. תמונת חלקיקי המשטח בכריכה באמצעות אובייקטיבי צמצם מספרי גבוהה (רצוי לפחות 1.40) בכל אחד ממצבי epifluorescence או TIRF עם עירור באורכי גל שבין 400-580 ננומטר ומצלמת CCD אלקטרונים ומתרבים. פרמטרי הדמיה מדויקים משתנים בין ההגדרה מיקרוסקופית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מתאר קליטת נציג וספקטרום פלואורסצנטי לnanocrystals CdSe, nanocrystals הכספית x Cd 1-x Se לאחר חילופי קטיון, והמ"כ x Cd 1-x Se / CD y Zn 1-y nanocrystals S לאחר צמיחת פגז. את nanocrystals CdSe הליבה יש תשואת קוונטים של קרינה בקרבת 15% (כולל פליטה ארוכת גל מלכודת עמוקה), אבל יעילות זה יורדת ל פחות מ 1% לאחר כספית חליפין, כנראה עקב לחייב מלכודות מובילות הציגו באמצעות שיבוש אטום שטח 9. עם זאת הצמיחה של קליפה דקה של CD y Zn 1-y S מגבירה את יעילות זו ליותר מ 70%, אשר נשמר במידה רבה לאחר העברה למים (50% טיפוסיים). לעומת זאת, nanocrystals CdSe / CD y Zn S 1-y ללא התאגדות כספית מאבד חלק נכבד מתשואת קוונטיהם במים, אלא אם כן קליפה עבה היא גדלה. לכן על ידי שילוב של כספית לתוך ליבת nanocrystaאני, קטן בגודל של ננו יכול להישמר (ראה TEM באיור 3), מבלי להקריב את הבהירות. חשוב לציין כי מכסה עם התקליטור y Zn 1-y S מסיטה את הספקטרום לזליגה של נושאי מטען האלקטרוניים לחומר המעטפת האדומה; שינוי זה הוא סביב 20-30 ננומטר לCdSe 16 ליבות, ועולה עם הגדלת תכולת כספית בליבה (עד 100 ננומטר).
השימוש בהעברת שלב 2-צעד למים הוא קריטי להשגת אוכלוסייה הומוגנית של nanocrystals שאינו דורש גודל נוסף מיון להסיר אשכולות ואגרגטים. בשלב הראשון, nanocrystals מועברים באמצעות DMSO 1-thioglycerol, שדוחק oleylamine על פני השטח של ננו. אז Thioglycerol מוחלף בפולימר multidentate יניארי, וכתוצאה מהחלקיקים מאוד יציבים עם עלייה מינימאלית בגודל הידרודינמית כתוצאה מהציפוי האורגני (<4 ננומטר לאומיעל לקוטר הידרודינמית). הכרומתוגרמה גודל ההדרה מתוארת באיור 4 א מאשרת כי הגודל דומה לזה של conalbumin (75 KDA), ואחרי שינוי עם 750 Da-PEG אמינו, בגודלו עלה ל רק 12 ננומטר, בדומה לזה של נוגדן IgG . PEG שינוי מנטרל את מטען המשטח, כפי שאושר בניסוי אלקטרופורזה ג'ל agarose המתואר באיור 4 ב. אנו משתמשים באופן שגרתי כרומטוגרפיה גודל הדרה ואלקטרופורזה ג'ל לאפיון מהיר של גודל, התפלגות גודל, ותשלום לפני שטח. פיזור האור דינאמי וpotentiometry זטה יכולים לשמש גם, עם זאת פיזור החתך של חלקיקים אלה ultrasmall הוא קטן מאוד, ואנחנו רואים שתוצאות ממכשירים מסחריים הן לא לשעתק. 5a חושף מיקרוסקופ epifluorescence של nanocrystals אלה שהופקד על coverslip זכוכית ונרגשת עם 545 ננומטר אור נראה. nanocrystals האלה בקלות הם o. Bserved ברמת המולקולה בודדה בקצב של 30 מסגרות לשנייה עם מצלמת CCD אלקטרוני הכפלת 5b האיור מראה כי מספר חלקיקי ניאון שנצפו בכל מסגרת משתנה לאורך זמן עם גירוי רצוף, וזאת עקב שילוב של מהבהב וphotodegradation . מהבהב שולט ל1 ~ 7 דקות לפני photodegradation חמצונים הופך לאט נראה לעין.
איור 1. תיאור סכמטי של הליך סינתזת nanoparticle. (א) מבשרי קדמיום סלניום להגיב ליצירת nanocrystals CdSe, אשר טופל בכספית octanethiolate, גרימה חלקיים → חילופי קטיון כספיים Cd להניב הכספי Cd x nanocrystals סגסוגת המשולשת Se 1-x. קליפה של Cd y Zn 1-y S היא אז גדל על הליבה באמצעות תצטט קדמיום, יצטט אבץ, וגופרית. (ב) כsynthesized, nanocrystals האלה מצופים בligands האורגני nonpolar (oleylamine). לsolubilize חלקיקים אלה במאגרים מימיים, ligands מוחלף בליגנד הפולימרים multidentate, אשר יחד קוולנטית לאמין-PEG.
איור 2. תכונות אופטיות של המ"כ x Cd 1-x Se / CD y Zn nanocrystals S 1-y. (א) קליט (שחור) ופלואורסצנטי ספקטרום (אדום) של ננו CdSe ליבות, המ"כ x Cd ליבות Se 1-x לאחר חילופי קטיון, והמ"כ x Cd 1-x Se / CD y Zn 1-y nanocrystals S לאחר צמיחת פגז . ספקטרה מקוזזת לבהירות (ב) ספקטרום קרינה של כספית x Cd 1-x Se / CD y Zn 1-y S עם כמויות יחסיות שונות של התאגדות כספית. הספקטרום הכחול מתאר ליבות עם תוכן אפס כספית (x = 0, CdSe).
איור 3. הילוכי האלקטרון מיקרוסקופ () וגודל חלקיקי הפצה (ב) למ"כ x Cd 1-x Se / CD y Zn 1-y nanocrystals S, מראים קוטר ממוצע ± סטיית תקן של 3.2 ± 0.6 ננומטר.
איור 4. אפיון הידרודינמית של המ"כ x Cd 1-x Se / CD y Zn 1-y QDs S בתמיסה מימית. (א) הכרומתוגרמה הדרת גודל של nanocrystals מצופית בפולימר יגנד multidentate לפני (אדום) ואחרי הנטייה (כחול) לאמין-PEG. סטנדרטי חלבון משקל מולקולריים הם ציינו לעיל החלקות. (ב) ניסוי agarose ג'ל אלקטרופורזה של QDs במאגר borate נתרן (pH ~ 8.5) לפני (משמאל) ואחרי נטייה (מימין) לאמין-PEG. גם מסומן בחץ וקוטביות האלקטרודה מצוינת בימין, מראה כי לפני הצמיד את nanocrystals להעביר כחלקיקי anionic וnanocrystals PEGylated הם אלקטרוסטטי ניטראליים.
איור 5. הכספי x Cd 1-x Se / CD y Zn 1-y QDs S adsorbed על coverslip זכוכית בחיץ פוספט, צלם עם מיקרוסקופיה epifluorescence. (א) תמונת QD הושגה ב 33 פריימים לשניים. תמונה היא 15 x 15 מיקרומטר מיקרומטר. (ב) מספר QDs ניאון לשדה ראייה בתאורה רציפה במשך 20 דקות עם מנורת קשת מרקורי עם 545 ננומטר (30 bandpass ננומטר) וסינון עירור של 625 ננומטר (20 bandpass ננומטר) פליטת סינון ו100x אובייקטיבי 1.4 NA. מדידות של 3 שדות של נוף היו ממוצעות מעל 20 דקות ב12.5 פריימים לשניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהשוואה לנקודות קונבנציונליות CdSe קוונטים, nanocrystals סגסוגת המשולשת הכספי x Cd 1-x Se יכול להיות מכוון בגודל ובאורך גל פלואורסצנטי באופן עצמאי. הגודל נבחר לראשונה במהלך הסינתזה של ננו CdSe ליבות, ואורך גל פלואורסצנטי נבחר בצעד משני כספית קטיון חליפין, שאינו משמעותי לשנות את גודל ננו 9. חשוב לאפשר מטוהרי כספית nanocrystals x Cd 1-x Se לדגירה בטמפרטורת חדר למשך 24 שעות לפחות לפני המכסה. זה מאפשר לחלק מקטיונים הכספיים adsorbed חלושה לפזר לתוך סריג ננו. מבלי לאפשר את התהליך הזה להתרחש, להקה שנייה בפלואורסצנטי הקרוב אינפרא אדום לעתים קרובות נצפה בשל נוקלאציה הומוגנית של nanocrystals HGS מיוני הכספי ניתק.
בדוגמא שמוצגת בעבודה זו, אנו מוכנים ליבות CdSe עם גודל קרוב 2.3 ננומטר, מה שיכול להיותמכוון בפלואורסצנטי בין 550-800 ננומטר לאחר שסיים לכסות על ידי שינוי הכמות כספית שולבה סריג הליבה. עם קליפת monolayer 2.5, הקוטר הסופי של QDs אלה היה קרוב 3.2 ננומטר, שהוא למעשה nanoparticle הגודל הקטן ביותר שאנחנו יכולים להכין שהוא מספיק photostable הן ובהיר מספיק להדמית מולקולה בודדה (מקדם הכחדה קרובה 350.000 M -1 סנטימטר -1 ב 400 ננומטר ותשואת קוונטים קרובים 50% במים). nanocrystals אלה הם באופן משמעותי ובהירים יותר מאשר photostable nanocrystals שתואר קודם לכן עם גדלים דומים שפולטים מעל טווח הספקטרום הזה (למשל CdTe, InAs, InP). כמו רוב fluorophores, הקרינה מן החלקיקים אלה ברמת המולקולה הבודדה היא לסירוגין (מהבהב) 5,6.
עבור יישומים מסוימים, זה עשוי להיות מועיל כדי להשתמש nanocrystals מידה מעט גדול יותר. באמצעות ננו גדולה CdSe ליבה, פלואורסצנטי bandwiDTH הוא צר לאחר חילופי קטיון כספית. רוחב שיא קרינה אופייני עבור כספית x Cd nanocrystals 1-x Se עם פליטה בחלון ננומטר הוא 600-650 ננומטר 50-70 לליבות 2.3 ננומטר ו40-50 ננומטר עבור 3.2 ליבות ננומטר. ובכך, nanocrystals הגדול לאפשר יכולת גבוהה יותר לריבוב רפאים. בנוסף, הגדלת הגודל יהיה גם להגדיל את חתך הקליטה של nanocrystals. הגדלת עובי שכבת מעטפת ביניים התקליטורים יהיה גם להגדיל את הבהירות, ועוד יותר להאריך את יציבות פלואורסצנטי במהלך עירור. גודל ליבת CdSe ניתן להעלות פשוט על ידי הארכת משך סינתזת ליבת CdSe, וניטור הגודל יעיל באמצעות ספקטרופוטומטר הספיגה UV-VIS.
אנחנו גילינו שQDs המימי מצופה חומצות carboxylic נוטה ספיחה לא ספציפית לתאים וחלבונים, ונטרולו של המטען השלילי החזק שלהם במאגרים פיסיולוגיים הוא CRitical לצמצום אינטראקציות לא ספציפיות 17. בדוגמות כאן, השתמש PEG קצר שרשרת לנטרל את מטען המשטח ולשמור על יציבות במים. PEG יכול להיות הציג לתוך עמוד שדרת הפולימר או לפני קובץ מצורף לQDs או לאחר ציפוי. שני הליכים גורמים לחלקיקים כמעט ניטראליים, אבל אלו מצופים ראשונים עם פולימר carboxyl הם קטנים באופן משמעותי, כנראה בשל אינטראקצית multidentate משופרת עם פני השטח. לנטרול משטח שלם עם PEG, מצאו שחיבור חוזר של סוכני מפעילות חומצת carboxylic הוא הכרחי בשל זמן מחצית חיים הקצרים של המינים תגובתי. אנו משתמשים DMTMM במקום של ריאגנטים carbodiimide נפוצים יותר (למשל EDC) בגלל היציבות המשופרת של DMTMM באחסון ובשל יעילות תגובה משופרת במי 18.
לבסוף, חשוב לציין שנקודות קוונטיות וסוגים רבים אחרים של nanocrystals מכיליםאלמנטים ציטוטוקסיות 5. יוני קדמיום וכספיים יכולים להשפיע על התהליכים הנורמלים של תאים ואורגניזמים חיים ועלולים להיות 19-21 מסרטנים. עם זאת cytotoxicity של CdSe הקונבנציונלי / nanocrystals ZnS נחקר באופן נרחב וזה כבר דווח כי nanocrystals חסון המצופה עם ligands האורגני יציב לא לעורר תגובות גלוי ציטוטוקסיות בהשוואה לאלמנטים המרכיבים אותן, פשוט כי היסודות הרעילים הם מוחרמים משם ביעילות מסוכני חמצון 5. יתר על כן, עבור יישומי הדמית מולקולה בודדה, השפעות רעילות הן סביר בשל ריכוזים הקטנים מאוד המשמשים להדמיה (בדרך כלל 1 ננומטר או פחות) שהם סדרי גודל קטן יותר מההתפרצות של השפעות רעילות גילוי (50-100 NM). רוב ניסויי המולקולה בודדה מיישמים QDs עד כה מנוצל nanocrystals ZnS, שהם גדולים בהרבה מאלה המתוארים במסמך CdSe / הזמין מסחרי. על ידי צמצום nגודל anocrystal, המספר הכולל של אטומי משטח לחלקיקים ואת המספר הכולל של אטומי חלקיקים רעילים למופחת באופן משמעותי, ובכך להפחית את הפוטנציאל להשפעה הכולל טוקסיקולוגי. שילוב של כספית לתוך ננו צפוי להקטין עוד יותר את פוטנציאל הרעילות, ככספית divalent ידוע להיות פחות רעיל מקדמיום divalent בסוגי תאים רבים 19-21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר הונג יי בליבה המיקרוסקופית המשולבת אוניברסיטת האמורי להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338, ו1K99CA154006-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865 | |
| Tri-n-octylphosphine | Strem | 15-6655 | 97% pure, unstable in air |
| Cadmium oxide | Sigma-Aldrich | 202894 | Highly toxic: use caution |
| Tetradecylphosphonic acid | PCI Synthesis | 4671-75-4 | |
| Octadecene | Alfa Aesar | L11004 | Technical grade |
| Hexadecylamine | Sigma-Aldrich | H7408 | |
| Diphenylphosphine | Sigma-Aldrich | 252964 | Pyrophoric |
| Mercury acetate | Sigma-Aldrich | 456012 | Highly toxic: use caution |
| 1-Octanethiol | Sigma-Aldrich | 471836 | Strong odor |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | W281506 | |
| Zinc acetate | Alfa Aesar | 35792 | |
| Cadmium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 229490 | Highly toxic: use caution |
| Oleylamine | Fisher Scientific | AC12954 | Unstable in air |
| Sulfur | Sigma-Aldrich | 344621 | |
| Trioctylphosphine oxide | Strem | 15-6661 | 99% |
| Pyridine | VWR | EM-PX2012-6 | Anhydrous |
| Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753 | Strong odor |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | Anhydrous |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 131342 | 20 kDa cutoff |
| Centrifugal filter | Millipore | UFC801024 | 10 kDa cutoff |
| Monoamino-PEG | Rapp Polymere | 12 750-2 | 750 Da |
| DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate | Alfa Aesar | H26333 | |
| AKTAprime Plus Chromatography System | GE HealthCare | ||
| Superose 6 10/300 GL chromatography column | GE HealthCare | 17-5172-01 | |
| Agarose, OmniPur | VWR | EM-2120 | |
Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12:
Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13:
|
|||
References
- Toprak, E., Selvin, P. R. New fluorescent tools for watching nanometer-scale conformational changes of single molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 349-369 (2007).
- Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. J. Advances in single molecule fluorescence methods for molecular biology. Annu. Rev. Biochem. 77, 51-76 (2008).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nat. Method. 7, 275-285 (2010).
- Smith, A. M., Wen, M. M., Nie, S. M. Imaging dynamic cellular events with quantum dots. Biochemist. 32, 12-17 (2010).
- Smith, A. M., Duan, H. W., Mohs, A. M., Nie, S. M. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240 (2008).
- Smith, A. M., Nie, S. M. Next-generation quantum dots. Nature Biotech. 27, 732-733 (2009).
- Groc, L., Lafourcade, M., Heine, M., Renner, M., Racine, V., Sibarita, J. -B., Lounis, B., Choquet, D., Cognet, L. Single trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. J. Neurosci. 27, 12433-12437 (2007).
- Smith, A. M., Nie, S. M. Minimizing the hydrodynamic size of quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands. J. Am. Chem. Soc. 130, 11278-11279 (2008).
- Smith, A. M., Nie, S. M. Bright and compact alloyed quantum dots with broadly tunable near-infrared absorption and fluorescence spectra through mercury cation exchange. J. Am. Chem. Soc. 133, 24-26 (2011).
- Shriver, D. F., Drezdzon, M. A. The Manipulation of Air-Sensitive Compounds. , 2nd edn, Wiley-Interscience. (1986).
- Errington, R. J. Advanced Practical Inorganic and Metalorganic Chemistry. , Blackie. (1997).
- Jasieniak, J., Smith, L., van Embden, J., Mulvaney, P., Califano, M. Re-examination of the size-dependent absorption properties of CdSe quantum dots. J. Phys. Chem. C. 113, 19468-19474 (2009).
- Leatherdale, C. A., Woo, W. K., Mikulec, F. V., Bawendi, M. G. On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots. J. Phys. Chem. B. 106, 7619-7622 (2002).
- Smith, A. M., Mohs, A. M., Nie, S. M. Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain. Nature Nanotech. 4, 56-63 (2009).
- Demas, J. N., Crosby, G. A. The measurement of photoluminescence quantum yields. A review. J. Phys. Chem. 75, 991-1024 (1971).
- Van Embden, J., Jasieniak, J., Mulvaney, P. Mapping the optical properties of CdSe/CdS heterostructure nanocrystals: the effects of core size and shell thickness. J. Am. Chem. Soc. 131, 14299-14309 (2009).
- Smith, A. M., Duan, H. W., Rhyner, M. N., Ruan, G., Nie, S. M. A systematic examination of surface coatings on the optical and chemical properties of semiconductor quantum dots. Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3895-3903 (2006).
- Zhang, X., Mohandessi, S., Miller, L. W., Snee, P. T. Efficient functionalization of aqueous CdSe/ZnS nanocrystals using small-molecule chemical activators. Chem. Comm. 47, 3532-3534 (2011).
- Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chavez, E., Carabez, A., Guiterrez-Ruiz, M. C. Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL-68 cells). Toxicol. 102, 285-299 (1995).
- Han, S. G., Castranova, V., Vallyathan, V. J. Comparative cytotoxicity of cadmium and mercury in a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and its role in oxidative stress and induction of heat shock protein 70. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 70, 852-860 (2007).
- Strubelt, O., Kremer, J., Tilse, A., Keogh, J., Pentz, R. J. Comparative studies on the toxicity of mercury, cadmium, and copper toward the isolated perfused rat liver. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 47, 267-283 (1996).
