Kompakta kvantprickar för enda molekyl Imaging

Summary

Vi beskriver framställningen av kolloidala kvantprickar med minimerad hydrodynamisk storlek för enda molekyl fluorescens avbildning. Jämfört med konventionella kvantprickar, dessa nanopartiklar har liknande storlek som globulära proteiner och är optimerade för enda molekyl ljusstyrka, stabilitet mot fotonedbrytning, och beständighet mot ospecifik bindning till proteiner och celler.

Abstract

Enda molekyl avbildning är ett viktigt verktyg för att förstå mekanismerna för biomolekylär funktion och för att visualisera den rumsliga och tidsmässiga heterogenitet av molekylära beteenden som ligger till grund cellbiologi ^1-4. Att avbilda en individuell molekyl av intresse, är det typiskt konjugerad till en fluorescerande tagg (färgämne, protein, kula, eller quantum dot) och observerades med epifluorescens eller total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Medan färgämnen och fluorescerande proteiner har grunden för fluorescens avbildning i årtionden, är deras fluorescens instabil under höga photon flöden krävs för att iaktta enskilda molekyler, vilket ger bara några sekunder för observation innan total förlust av signal. Latex pärlor och färgämnesmärkta pärlor ger förbättrad signal stabilitet, men på bekostnad av drastiskt större hydrodynamisk storlek, som skadligt kan förändra spridning och beteende av molekylen som studeras.

ntent "> Kvantprickar (QDs) erbjuder en balans mellan dessa två problematiska regimer. Dessa nanopartiklar består av halvledarmaterial och kan konstrueras med en hydrodynamiskt kompakt storlek med exceptionell motståndskraft mot fotonedbrytning ^5. Således under de senaste åren QDs har varit avgörande för möjliggöra långsiktiga observation av komplexa makromolekylära beteende på den enda molekyl nivå. Men dessa partiklar har fortfarande visat sig uppvisa försämrad diffusion i trånga molekylära miljöer som den cellulära cytoplasman och det neuronala synaptiska klyftan, där deras storlekar är fortfarande alltför stora ^{4,6 , 7.}

Nyligen har vi utvecklats kärnorna och ytbeläggningar av QDs för minimerad hydrodynamisk storlek, samtidigt balansera offset till kolloidal stabilitet, fotostabilitet, ljusstyrka och ospecifik bindning som har hindrat nyttan av kompakta QDs tidigare ^8,9. Målet med denna artikel är att visasyntesen, modifiering och karakterisering av dessa optimerade nanokristaller, bestående av en legerad Hg _x CD _1-x Se kärna belagd med ett isolerande Cd _y Zn _1-y S-skal, ytterligare belagd med en flertandad ligand polymer modifierad med kort polyetylenglykol ( PEG) kedjor (figur 1). Jämfört med konventionella CdSe nanokristaller, Hg _x Cd _1-x Se-legeringar ger större kvantutbyten av fluorescens, fluorescens vid röda och nära infraröda våglängder för ökad signal-till-brus i celler, och excitation vid icke-cytotoxiska synliga våglängder. Flertandade polymerbeläggningar binder till nanokristallen ytan i en sluten och platt konformation att minimera hydrodynamisk storlek, och PEG neutraliserar ytladdningen att minimera ospecifik bindning till celler och biomolekyler. Slutresultatet är ett ljust fluorescerande nanokristallen med emission mellan 550-800 nm och en total hydrodynamisk storlek nära 12 nm. Detta är i Same storleksområde så många lösliga globulära proteiner i celler, och väsentligt mindre än konventionella PEGylerade QDs (25-35 nm).

Protocol

Följande syntesförfaranden omfattar standardkontroller luftfria tekniker och användning av en vakuum / inert gas grenrör, detaljerad metod kan hittas i referenser 10 och 11. Säkerhetsdatablad för alla potentiellt giftiga och brandfarliga ämnen bör rådfrågas före användning och alla brandfarliga och / eller luft-labila föreningar bör alikvoteras till septum-tillslutna flaskor i en handskbox eller handskpåse.

1. Syntes av kvicksilver kadmium selenid (Hg _x CD _1-X Se) Quantum Dot kärnor

1. Förbered en 0,4 M lösning av selen i trioktylfosfin (TOP). Lägg selen (0,316 g, 4 mmol) till en 50 ml 3-halsad kolv, sedan evakuera och fylla med argon med användning av en Schlenk-linje. Under luft-fria betingelser (torr kväve eller argon atmosfär), tillsätt 10 ml TOP och värme till 100 ° C under omröring under 1 h för att ge en klar, färglös lösning. Kyl lösningen till rumstemperatur och ställa kolven åt sidan.
2. Till en 250 ml 3-halsad kolv, tillsätt kadmiumoxid (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), tetradecylphosphonic syra (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) och oktadeken (ODE, 27,6 ml) och evakuera lösningen med en Schlenk linje under omrörning. Öka temperaturen till 100 ° C och evakuera under ytterligare 15 min för att avlägsna lågkokande orenheter punkt.
3. Under argon eller kvävgas, värm blandningen till 300 ° C under 1 timme till fullständig upplösning CDO. Lösningen kommer att ändras från en rödaktig färg till klar och färglös. Kyl lösningen till rumstemperatur.
4. Lägg hexadecylamin (HDA, 7,0 g) till lösningen kadmium, värme till 70 ° C, och evakuera. När ett konstant tryck uppnåtts, öka temperaturen till 100-110 ° C och återflöde lösningen under 30 minuter. Växla Schlenk linjen ventilen till inert gas och in termoelementet direkt i lösningen.
5. Under luft-fria betingelser, tillsätt difenylfosfin (DPP, 100 ul) till lösningen och öka temperaturen till 310 ° C. Ta 7,5 ml av 0,4 M TOP-Se-lösning(3 mmol selen) i en engångs plastspruta fäst till en 16 gauge nål.
6. När temperaturen jämvikt vid 310 ° C, ställ in temperaturreglaget till 0 ° C och snabbt injicera TOP-Se-lösning direkt i kadmium lösningen. Lösningen ändras från färglös till gul-orange och temperaturen sjunker snabbt och öka igen till ~ 280 ° C. Efter 1 minut av reaktion, avlägsna kolven från värmemanteln och snabbt kyler med en ström av luft tills temperaturen är lägre än 200 ° C.
7. När temperaturen når ~ 40 ° C, späd med 30 ml hexan, de flesta av de återstående kadmium prekursorn kommer att sedimentera ut ur lösningen. Ta bort denna fällning genom centrifugering (5000 xg, 10 min).
8. I vart och ett av sex 50 ml polypropylen koniskt centrifugrör, späd 12 ml av den råa nanokristallen lösningen med 40 ml aceton, centrifug (5.000 x g under 10 min), och noggrant dekantera och kassera supernatanten.
9. Lös nanocrystal pellets i hexan (25 ml total volym). Extrahera denna lösning 3 gånger med en lika stor volym metanol, behålla den övre fasen. För den tredje extraktionen, kan volymen av metanol justeras till ~ 15 ml för att erhålla en koncentrerad hexanlösning av rena CdSe QDs på ungefär 200 pM. Den typiska utbytet av denna reaktion är 3 pmol CdSe nanokristaller med en diameter av 2,3 nm (50-60% reaktionsutbytet).
10. Bestäm nanokristallen diameter och koncentration genom att mäta UV-Vis absorptionsspektrum och samråd storlek åtsittande diagram av Mulvaney och medarbetare ¹² och korrelationerna utrotning av Bawendi och medarbetare ^13. Se bilaga för mer information.
11. Kvicksilver katjonbyte: nanokristaller kan delvis bytas ut mot kvicksilver till rödförskjutningen absorptionen och fluorescensemissionen. Blanda följande tillsammans för i en 20 ml glasflaska med omrörarstav (denna reaktion kan skalas efter önskemål): 3 ml hexan, 2 ml kloroform, 1 ml 200 M CdSe QD-lösning (200 nmol), 15 pl oleylamin (OLA), och 500 pl av en 0,1 M lösning av Hg (OT) ₂ i kloroform. Kvicksilver octanethioate (HgOT ₂₎ kan framställas genom att reagera kvicksilveracetat och oktantiol i metanol (se bilaga). När reaktionen katjonbytar fortskrider, kan graden av rödförskjutningen övervakas med UV-Vis absorptionsspektrofotometri. Efter att den önskade absorptionsbandet har uppnåtts, mäter absorptionen av nanokristallen lösningen vid 350 nm och fastställa den nya extinktionskoefficienten, förutsatt att nanokristallen koncentrationen inte har ändrats (30,7 pM i detta exempel). Släck reaktionen genom att avlägsna den oreagerade kvicksilver: tillsätt 5 ml dekan, 10 ml hexan, och 7 ml metanol och extrahera lösningen, håller den övre fasen innehåller nanokristaller. Extrahera två gånger med hexan och metanol, och justera volymen av metanol så att den övre fasen är ~ 7 ml. Om faserna är långsamma att separera, kan lösningen centrifugerades (5000 x g,10 minuter). Tillsätt 100 | il, 100 | il OLA, och 100 | il oljesyra till nanokristaller följt av 40 ml aceton för att inducera fällning. Samla nanokristaller via centrifugering och sprida i 3 ml hexan. Centrifugera igen för att avlägsna olösliga komponenter och bestämma koncentrationen nanokristallen igen, med den nya extinktionskoefficienten vid 350 nm. Låt nanokristallen lösningen åldras under minst 24 timmar vid rumstemperatur innan man fortsätter till nästa steg.

2. Tillväxt av kadmium zinksulfid (Cd _y Zn _1-y S) Shell

1. Bered 0,1 M skal prekursorlösningarna i 50 ml 3-halsad kolvar. Kadmium prekursor: kadmiumacetat hydrat (230,5 mg, 1 mmol) och 10 ml oleylamin (OLA). Zink prekursor: zinkacetat (183,5 mg, 1 mmol) och 10 ml OLA. Svavel prekursor: svavel (32,1 mg, 1 mmol) och 10 ml ODE. Under vakuum, värme varje lösning till återflöde under 1 timme för att ge klara lösningar, och sedan ladda med argon. Den svavellösning kankylas till rumstemperatur, men kadmium och zink prekursorer hålles vid ca 50 ° C. Beräkningar av skal föregångare mängder finns i referens 14.
2. Lägg till en 3-halskolv: Hg _x CD _1-x Se QDs (120 nmol, 2,3 nm i diameter), ODE (2 ml) och trioktylfosfinoxid (TOPO, 250 mg). Utrym utanför hexan vid rumstemperatur med användning av Schlenk-linjen. Öka temperaturen till 100 ° C och återflöde under 15 min. Ändra Schlenk linjen ventilen till argon eller kvävgas och infoga termoelementet i nanokristallen lösningen.
3. Öka temperaturen till 120 ° C, tillsätt 0,5 monoskikt av svavel prekursorlösning (140 pl), och låt reaktionen fortsätta i 15 minuter. Små alikvoter (<50 pl) kan avlägsnas med användning av en glasspruta för att övervaka framskridandet av reaktionen med användning av fluorescens och / eller UV-Vis absorptionsspektrofotometri. Öka temperaturen till 140 ° C, tillsätt 0,5 monoskikt av kadmium prekursorlösningen (140 pl), och låt reaktionen fortsätta i 15 minuter. Lägg 500 il vattenfri OLA till reaktionslösningen.
4. Vid 160 ° C tillsätt 0,5 monoskikt av svavel prekursorlösning (220 pl) följt av en lika stor mängd av zink prekursorlösning vid 170 ° C med 15 minuter mellan varje tillsats. Sedan vid 180 ° C tillsätt 0,25 monoskikt av svavel prekursor-lösning (150 pl) och zink prekursorlösningen i 15 minuters intervall.
5. Kyl lösningen till rumstemperatur och åter beräkna en ny extinktionskoefficient för dessa partiklar med hjälp av en UV-Vis-spektrumet, förutsatt att antalet nanokristaller inte har ändrats (120 nmol i 3,8 ml reaktionslösning). Förvara reaktionslösningen som en rå blandning i en frys, nanokristaller kan tinas och renas efter behov med användning av samma metod som beskrivits i avsnitten 1.8 och 1.9.
6. Nanokristaller kan karakteriseras med användning av elektronmikroskopi, UV-Vis absorptionsspektroskopi och fluorescensspektroskopi. Kvantutbyte kanberäknat absolut använder en integrerande sfär eller relativt i jämförelse med en känd standard med hjälp av metoderna enligt referens 15.

3. Fasöverförings

1. Lägg renad kärna / skal Hg _x CD _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs (5 ml, 20 | iM) till en 50 ml 3-halsad kolv och avlägsna hexan under högt vakuum för erhållande av en torr film. Fyll kolven med argon, tillsätt vattenfri pyridin (3 ml) till nanopartiklars filmen och värme uppslamningen till 80 ° C. Under loppet av 1-2 tim nanopartiklarna kommer fullständig upplösning.
2. Tillsätt 1-tioglycerol (1 ml) till lösningen och omrör vid 80 ° C under 2 timmar. Sedan kyla lösningen till rumstemperatur och tillsätt trietylamin (0,5 ml) för att deprotonera tioglycerol. Rör om under 30 minuter. Lösningen kan bli grumlig efter tillsatsen av trietylamin på grund av den dåliga lösligheten av polära nanokristaller i denna lösningsmedelsblandning.
3. Överför QD lösningen till en 50 ml koniskt centrifugrör fortsaining en blandning av 20 ml hexan och 20 ml aceton, och blanda väl. Isolera de utfällda nanokristaller via centrifugering (5.000 x g, 10 minuter), och tvätta pelleten med aceton.
4. Lös QD pelleten i DMSO (5 ml) med bad sonikering, och därefter centrifugera (7.000 x g, 10 min) för att avlägsna eventuella aggregat. Bestäm koncentrationen nanopartiklar från en UV-Vis-absorptionsspektrum. Denna lösning av rena QDs bör användas inom 3 timmar, eftersom ytan tioler kan sakta oxidera under omgivningsförhållanden i luft.
5. Späd QD lösningen till 10 pM eller mindre med DMSO och överför till en 50 ml kolv. Bered en 5 mg / ml lösning av tiolerad polyakrylsyra (syntes beskriven i Appendix) i DMSO. Tillsätt polymerlösningen (0,15 mg polymer per nmol QDs) droppvis till QD lösningen under omrörning och avgasa lösningen vid rumstemperatur under 5 min.
6. Rensa QD / polymerlösningen med argon och värme till 80 ° C under 90 minuter. Sedan kyla lösningen till rumstemperatur ettd droppvis tillsätt en lika stor volym av 50 mM natriumborat, pH 8. Rör om under 10 minuter.
7. Rena QDs via dialys (20 kDa gränsvärde) i 50 mM natriumborat, pH 8, och sedan koncentrera partiklarna med en centrifugalfilter (10 kDa gränsvärde). Bestäm koncentrationen från en UV-Vis-absorptionsspektrum.

4. PEG Beläggning

1. I en 4 ml glasflaska med omrörarstav, blanda 1 nmol QDs i boratbuffert med en 40.000 x molärt överskott av 750 Da monoamino-polyetylenglykol (30 mg, 40 | imol). Om en specifik kemisk funktionalitet skall läggas till nanokristaller (t.ex. hydrazid eller maleimid), kan den införas genom att ersätta en del av amino-PEG med en heterobifunktionell amino-PEG (30% molfraktion typiskt fungerar bra). Späd nanokristallen lösningen till 1 pM med boratbuffert. Denna reaktion kan skalas så önskas.
2. Bered en färsk lösning av DMTMM (20 mg, 72 | imol) i DMSO (144 | il). Denna lösning kan värmas kortvarigt under en ström av varmt tappvatten eller nedsänkt i en badsonikator att helt upplösa DMTMM. Snabbt lägga en 25.000 x molärt överskott av detta 0,5 M DMTMM lösning (50 | il) till QD lösningen och rör om vid rumstemperatur under 30 minuter.
3. Upprepa steg 4,2 ytterligare fyra gånger för att mätta nanokristallen ytan med PEG. Slutligen, tillsätt 200 pl 1 M Tris-buffert för att stoppa reaktionen och rena nanokristaller med dialys, centrifugalfilter eller ultracentrifugering.
4. Nanokristaller kan analyseras för monodispersitet, hydrodynamisk storlek, och ytladdning med vätskekromatografi, agarosgelelektrofores, och fluorescensmikroskopi. För att bestämma hydrodynamisk storlek och storleksfördelning med användning av en automatiserad vätskekromatografisystem (GE AKTAprime Plus), använd en Superose 6-kolonn, en flödeshastighet av 0,5 ml / min med PBS-buffert elueringsmedel, och absorption detektion vid 260 eller 280 nm. Jämför gånger nanopartiklar eluering med de molekylviktsstandarder. För agarosgel electrophomotstånd, utarbeta en 0,5% agarosgel i 50 mM natriumboratbuffert (pH 8,5) eller 50 mM natriumfosfatbuffert (pH 7,4), blanda 1 pM prover med 10% glycerol och belastning i brunnar, och kördes vid 100 V under 30 minuter . Bild nanokristaller i under användning av en UV-handen trollstav eller UV-transilluminator och fluorescens excitation. Att avbilda nanokristaller vid den enda molekyl nivå med fluorescensmikroskopi, späda ut partiklarna till 0,2 nM i 10 mM fosfatbuffert, släpp 2,5 ul av lösningen på ett täckglas, och försiktigt placera en andra täckglas ovanpå det flytande vulsten att sprida en film mellan täckglasen. Bild på ytbundna partiklar med hjälp av en hög numerisk apertur mål (helst minst 1,40) i antingen epifluorescens eller TIRF läge med excitation vid våglängder mellan 400-580 nm och en elektron-multiplicera CCD-kamera. Exakta imaging parametrar varierar mellan mikroskopi setup.

Representative Results

Figur 2 visar representativa absorption och fluorescens spektra för CdSe nanokristaller, HG _x CD _{1-x SE} nanokristaller efter katjonbyte och Hg _x CD _1-X Se / Cd _y Zn _{1-y s} nanokristaller efter skal tillväxt. Kärnan CdSe nanokristaller har kvantutbyte av fluorescens nära 15% (inklusive lång våglängd djupa fälla emission) men denna effektivitet sjunker till mindre än 1% efter kvicksilver utbyte, troligen på grund av laddningsbärare fällor som införs genom ytan atom störningar ^9. Men tillväxten av ett tunt skal av Cd _y Zn _1-y S ökar denna effektivitet till mer än 70%, vilket till stor del upprätthålls efter överföring till vatten (50% är normalt). I motsats, CdSe / Cd _y Zn _1-y S-nanokristaller utan kvicksilver inkorporering förlora en betydande del av deras kvantutbyte i vatten om en tjock skal odlas. Sålunda genom att införliva kvicksilver i kärnan nanocrystaL, den lilla storleken av nanokristallen kan upprätthållas (se TEM i figur 3) utan att offra ljusstyrka. Det är viktigt att notera att capping med Cd _y Zn _1-y S skiftar spektra till den röda grund av läckage av de elektroniska laddningsbärarna in i skalmaterialet, denna förskjutning är cirka 20-30 nm för CdSe kärnorna ^16, och ökar med ökande kvicksilverhalten i kärnan (upp till 100 nm).

Användningen av en 2-stegs fasöverförings till vatten är kritisk för att erhålla en homogen population av nanokristaller som inte kräver ytterligare storlek sortering för avlägsnande kluster och aggregat. I det första steget, är nanokristallerna överförs till DMSO användning av 1-tioglycerol, som förskjuter oleylamin på ytan av nanokristallen. Tioglycerol ersätts sedan med en linjär flertandad polymer, vilket resulterar i mycket stabila partiklar med en minimal ökning av hydrodynamisk storlek till följd av den organiska beläggningen (<4 nm BIDRAGpå den hydrodynamiska diametern). Storleken uteslutning kromatogrammet visas i figur 4a bekräftar att storleken är liknande den i konalbumin (75 kDa), och efter modifiering med 750 Da-amino-PEG är storleken ökas till endast 12 nm, liknande den av en IgG-antikropp . PEG-modifiering neutraliserar ytladdning, vilket bekräftas i agarosgelelektrofores experiment visas i figur 4b. Vi använder rutinmässigt storleks-kromatografi och gel elektrofores för snabb karakterisering av storlek, storleksfördelning, och ytladdning. Dynamisk ljusspridning och zeta potentiometri kan också användas, men spridningen tvärsnitt av dessa ultrasmall partiklar är mycket små, och vi har funnit att resultaten från kommersiella instrument är inte reproducerbara. Figur 5a visar en epifluorescens mikrofotografi av dessa nanokristaller deponeras på en täckglas och glada med 545 nm synligt ljus. Dessa nanokristaller är o lätt. bserved vid enda molekyl nivå med 30 bilder per sekund med en elektron-multiplicera CCD-kamera Figur 5b visar att antalet fluorescerande partiklar som observerats i varje ram varierar över tiden med kontinuerlig excitation, detta beror på en kombination av blinkande och fotonedbrytning . Blinkande dominerar den första ~ 7 min före oxidativ ljusnedbrytning långsamt blir uppenbart.

Figur 1. Schematisk återgivning av nanopartiklar syntesförfarandet. (A) Kadmium och selen prekursorer reagerar generera CdSe nanokristaller, som behandlas med kvicksilver octanethiolate, inducerar partiell Cd → Hg katjonbyte för att ge Hg _x CD _{1-x SE} ternära legeringar nanokristaller. Ett skal av Cd Zn _{y 1-y} S sedan odlas på kärnan med kadmium, zinkacetat, och svavel. (B) Som Synthesized är dessa nanokristaller belagda med opolära organiska ligander (oleylamin). Att solubilisera dessa partiklar i vattenhaltiga buffertar, är liganderna ersätts med en flertandad polymer-ligand, som är kovalent kopplad till amino-PEG.

Figur 2. Optiska egenskaper hos Hg _x CD _1-X Se / Cd _y Zn _{1-y s} nanokristaller. (A) Absorption (svart) och fluorescens spektra (röd) i CdSe nanocrystal kärnor, Hg _x CD _{1-x SE} kärnor efter katjonbyte, och Hg _x CD _1-X Se / Cd _y Zn _{1-y s} nanokristaller efter skal tillväxt . Spektra offset för klarhet (b) Fluorescensspektra Hg _x CD _1-X Se / Cd _y Zn _1-y S med olika relativa mängder kvicksilver inkorporering. Den blå spektrumet visar kärnor med noll kvicksilverinnehåll (x = 0, CdSe).

Figur 3. Transmissionselektronmikroskopbild (a) och partikelstorleksfördelning (b) Hg _x CD _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S nanokristaller, visande en medeldiameter ± standardavvikelse av 3,2 ± 0,6 nm.

Figur 4. Hydrodynamisk karakterisering av Hg _x CD _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S-QDs i vattenlösning. (A) Storlek uteslutande kromatogram av nanokristaller belagda i en flertandad polymer ligand före (röd) och efter (blå) konjugering till amino-PEG. Molekylviktsstandarder protein standarder anges ovan tomter. (B) Agarosgelelektrofores försök av QDs i natriumboratbuffert (pH ~ 8,5) innan (vänster) Och efter (höger) konjugering till amino-PEG. Brunnen är märkt med en pil och polariteter elektroden indikeras till höger, som visar att före konjugering nanokristaller vandrar som anjoniska partiklar och PEGylerade nanokristaller är elektrostatiskt neutrala.

Figur 5. Hg _x CD _1-x Se / Cd _y Zn _1-y S QDs adsorberade på ett täckglas i fosfatbuffert, avbildas med epifluorescensmikroskopi. (A) dagligen bild erhölls vid 33 bilder per sekund. Bilden är 15 nm x 15 nm. (B) Antal fluorescerande QDs per synfält vid kontinuerlig belysning för 20 min med kvicksilverbåglampa med 545 nm (30 nm bandpass) excitationsfilter och en 625 nm (20 nm bandpass) emissionsfilter och 100x 1,4 NA mål. Mätningar från 3 synfält medelvärdesbildades över 20 min vid 12,5 bilder per sekund.

Discussion

Jämfört med konventionella CdSe kvantprickar kan ternära legering Hg _x CD _{1-x SE} nanokristaller ställas i storlek och fluorescens våglängd självständigt. Storleken först väljs under syntesen av CdSe nanocrystal kärnor, och fluorescensen våglängden väljs i en sekundär kvicksilver katjonbytessteg, som inte väsentligt förändrar nanokristallen storlek ^9. Det är viktigt att låta det renade Hg _x CD _{1-x SE} nanokristaller att inkubera vid rumstemperatur i minst 24 timmar innan tak. Detta medger några av de svagt adsorberade kvicksilver katjoner att diffundera in nanokristallen gittret. Utan att denna process att inträffa, ett andra fluorescens band i det nära infraröda ofta observeras på grund av homogen kärnbildning av Hgs nanokristaller från dissocierade kvicksilverjonerna.

I exemplet som visas i detta arbete, förberedde vi CdSe kärnor med en storlek nära 2,3 nm, vilket kan varainställda fluorescens mellan 550-800 nm efter capping genom att ändra den mängd kvicksilver införlivas i kärnan gitter. Med en 2,5 monolager skal, var den slutliga diametern av dessa QDs nära 3,2 nm, vilket är i huvudsak minsta nanopartiklar som vi kan förbereda som är både tillräckligt fotostabila och tillräckligt ljust för enda molekyl avbildning (extinktionskoefficient nära 350.000 M ^-1 cm ^-1 vid 400 nm och kvantutbyte nära 50% i vatten). Dessa nanokristaller är betydligt ljusare och mer fotostabila än tidigare beskrivna nanokristaller med jämförbara storlekar som släpper över detta spektralområde (t.ex. CdTe, InAs, InP). Liksom de flesta fluoroforer är fluorescens från dessa partiklar på enda molekyl nivå intermittent (blinkande) ^5,6.

För vissa tillämpningar kan det vara fördelaktigt att använda något större nanokristaller. Genom att använda en större CdSe nanokristallen kärna, fluorescens bandwiDTH är smalare efter kvicksilver katjonbyte. Typiska fluorescenstopp bredder för Hg _x CD _{1-x SE} nanokristaller med utsläpp i 600-650 nm fönstret är 50-70 nm för 2,3 nm kärnor och 40-50 nm för 3,2 nm kärnor. Därigenom, större nanokristaller möjliggör en större kapacitet för spektral multiplexering. Dessutom, kommer en ökning av storleken likaledes öka absorptionen tvärsnitt nanokristaller. Ökning av tjockleken på CdS tillfälliga skalskiktet kommer också att öka ljusstyrkan, och ytterligare förlänga fluorescens stabilitet under excitation. Den CdSe Kärnan storlek kan ökas genom att helt enkelt förlänga varaktigheten av CdSe kärnan syntes, och kontrollen sker storlek genom UV-Vis absorptionsspektrofotometri.

Vi har funnit att vattenhaltiga QDs belagda med karboxylsyror är benägna att icke-specifik adsorption till celler och proteiner, och att neutralisation av deras starka negativ laddning i fysiologiska buffertar är CRitical för minimering ospecifika interaktioner ^17. I exemplen här, använde vi kortkedjig PEG att neutralisera ytladdningen och bibehålla stabiliteten i vatten. PEG kan införas i polymerhuvudkedjan antingen före fastsättning till QDs eller efter beläggning. Båda förfarandena resulterar i nästan neutrala partiklar, men de som först belagts med karboxyl-polymeren är väsentligen mindre, förmodligen på grund av förbättrad flertandade interaktion med ytan. För hela ytan neutralisation med PEG, har vi funnit att upprepad tillsats av karboxyl medel syraaktiverande är nödvändig på grund av den korta halveringstiden av de reaktiva species. Vi använder DMTMM i stället för mer vanliga karbodiimid reagens (t.ex. EDC) på grund av den förbättrade stabiliteten hos DMTMM vid lagring och på grund av ökad reaktion effektivitet i vatten ^18.

Slutligen, är det viktigt att notera att kvantprickar och många andra typer av nanokristaller innehållercytotoxiska element ^5. Kadmium och kvicksilver joner kan påverka den normala behandlingen med levande celler och organismer och kan vara cancerframkallande ^19-21. Men cytotoxiciteten hos konventionella CdSe / ZnS nanokristaller har studerats ingående och det har rapporterats att robust belagda nanokristaller med stabila organiska ligander inte framkallar öppet cytotoxiska svar jämfört med sina beståndsdelar, helt enkelt för att deras giftiga ämnen effektivt binds åtskilt från oxiderande ämnen ^5. Dessutom, för enkel-molekyl bildprogram, toxiska effekter är osannolika på grund av de extremt små koncentrationer som används för avbildning (typiskt 1 nM eller mindre) som är storleksordningar mindre än uppkomsten av detekterbara toxiska effekter (50-100 nM). De flesta av de enda molekyl experiment genomförande QDs hittills har utnyttjat kommersiellt tillgängliga CdSe / ZnS nanokristaller, som är betydligt större än de som beskrivs här. Genom att minimera nanocrystal storlek, är det totala antalet atomer ytan per partikel och det totala antalet toxiska atomer per partikel väsentligen reduceras, varigenom den totala potentialen för toxikologiska effekter. Införlivandet av kvicksilver i nanokristallen förväntas ytterligare minska toxiciteten potential, som tvåvärt kvicksilver är känd för att vara mindre toxiska än tvåvärd kadmium i många celltyper ^19-21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Selenium	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% pure, unstable in air
Cadmium oxide	Sigma-Aldrich	202894	Highly toxic: use caution
Tetradecylphosphonic acid	PCI Synthesis	4671-75-4
Octadecene	Alfa Aesar	L11004	Technical grade
Hexadecylamine	Sigma-Aldrich	H7408
Diphenylphosphine	Sigma-Aldrich	252964	Pyrophoric
Mercury acetate	Sigma-Aldrich	456012	Highly toxic: use caution
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Strong odor
Oleic acid	Sigma-Aldrich	W281506
Zinc acetate	Alfa Aesar	35792
Cadmium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	229490	Highly toxic: use caution
Oleylamine	Fisher Scientific	AC12954	Unstable in air
Sulfur	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine oxide	Strem	15-6661	99%
Pyridine	VWR	EM-PX2012-6	Anhydrous
Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M1753	Strong odor
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283	Anhydrous
Dialysis tubing	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Centrifugal filter	Millipore	UFC801024	10 kDa cutoff
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus Chromatography System	GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL chromatography column	GE HealthCare	17-5172-01
Agarose, OmniPur	VWR	EM-2120
Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12: Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13: