Summary
と呼ばれる手法
Abstract
植物の細胞壁は、植物の生理と発展に重要な役割を果たしており、人間社会のために原材料を提供異種糖鎖の複雑なマトリックス（ 例えば、木材、紙、繊維、バイオ燃料産業）1,2です。しかし、これらの成分の生合成と機能を理解することは困難なままである。
細胞壁糖鎖は、化学とその構築ブロック、グリコシル残基の複雑さに起因するコンフォメーションが多様である。これらのフォームの複数の位置に結合およびリング構造が異なり、異性体またはアノマー配置されているだけでなく、無糖残基の配列で置換されている。グリカンの組成物は、単一細胞壁3の異なる細胞および/ または組織型あるいはサブドメインに変化する。さらに、それらの組成物はまた、開発1時、または環境手がかり4に対応して変更されます。
EXで2000遺伝子の目的税は、植物の細胞壁は、異種の糖鎖の複雑なマトリックスシロイヌナズナ 5で細胞壁糖鎖の生合成と修飾に関与することが予測された多数持っています。しかし、生合成遺伝子の比較的少ないが、機能的に4,5特徴付けられてきた。遺伝子はしばしば差別的細胞型6の間に、多くの場合、低レベルで発現しているので、逆遺伝学的ア プローチが困難である。また、変異体の研究は、多くの場合、適切な細胞壁機能は7に維持されていることを確認するために、遺伝子の冗長性または代償機構によって妨げられている。したがって、新たなアプローチが急速に糖鎖構造の多様な範囲を特徴づけるために理解と細胞壁の生合成と修飾に機能ゲノミクスアプローチを容易にするために必要とされる。
モノクローナル抗体（mAb）8,9は、植物の糖鎖構造と分布を決定するための重要なツールとして浮上している。これらは、dist認識ペクチン、キシログルカン、キシラン、マンナン、グルカンやアラビノガラクタンを含む植物細胞壁糖鎖の主要なクラス内に存在INCTエピトープ。最近、それらの使用は植物や組織の種類を同時に9,10,11の広い範囲で糖鎖の相対量を決定するために、大規模なスクリーニング実験にも拡張されました。
ここでは、複数のサンプル（100秒）が減少した試薬及びサンプル量で小型化されたマイクロアレイプラットフォームを用いてスクリーニングすることができる包括的なマイクロアレイポリマープロファイリング（CoMPP）（ 図1および2）10,11と呼ばれるマイクロアレイベースグリカンスクリーニング法を提案する。マイクロアレイ上のスポット信号は正式に糖鎖エピトープの発生に関する半定量的データを与えるために定量することができる。このアプローチは、複雑な生物システム12の糖鎖変化を追跡し、細胞壁組成のグローバルな概観を提供することに適している場合は特に事前知識Ofはこれができません。
Protocol
1。組織収集＆準備
- 関心のある各組織には、少なくとも三重に植物組織100 mgの生体重（10 mgの乾燥重量の最小値）を収集します。次の手順では、植物組織からの細胞壁物質の調製を記載している。貯蔵組織の場合には、非指名澱粉を酵素的に前述の13のような細胞壁ポリマーの抽出を続行する前に削除されます。
- 24チューブアダプタセットと3 mmのタングステンカーバイドビーズ（30ヘルツ、2×30秒）で、キアゲンTissueLyserをIIを用いて液体窒素で微粉末にサンプルをホモジナイズする。唯一のいくつかのサンプルが処理されている場合、あるいは、乳鉢と乳棒を使用しています。
- 10ミリリットルプラスチックのコニカルチューブにホモジネートを転送します。
- 室温で10ミリリットル80パーセントv / vエタノールでホモジネートを洗浄し、2分間激しくボルテックスすることによって細胞壁材料を準備します。
- 3500 xgでサンプルを遠心分離し、上清を捨てる。上澄みが透明になるまで70％エタノールが特にクロロフィルを含む組織のために、または少なくとも3回洗いを繰り返します。
- 100％アセトンで最終洗浄を行い、一晩空気乾燥する際には、アルコール性残留物（AIR）を含有するペレットを残す。
- ふるい0.4ミリメートル2メッシュを使用したAIRサンプルは罰金、均質な粉末を達成し、いつかホモジネートに残るほど、貧弱グラウンド粒子を除去する。
- マイクロチューブ、サンプルの混合を助けるために3ミリメートルのガラスビーズを含んだそれぞれに10mgのAIRサンプルを計量する。
2。細胞壁糖鎖の抽出
- ペクチン、およびペクチンに関連付けられたポリマーは、各試料に50μMのCDTA液（pH7.5）500μlを加えてサンプルから抽出されます。
- 簡潔にボルテックスチューブは溶媒が試料物質と接触していることを確認してから、8 Hzで3時間TissueLyserを用いて混合します。
- 慎重に、12,000 xgでサンプルを遠心R4℃で上清と店を残したまま削除
- 13000×gで残っている溶剤、ボルテックス、遠心を薄めて除去するために脱イオン水1ml中のペレットを洗浄します。ペレットを乱さずに、この手順を繰り返して、次のステップに進む前に、チューブから液体をすべて削除します。
- CDTA抽出のために2.4 - 架橋結合型糖鎖を順次ステップ2.1で説明したのと同じ手順を使用して、0.1％（w / v）の水素化ホウ素ナトリウムと4M NaOHを500μlの残りの細胞壁ペレットから抽出されます。 NaBH 4をそれによって多糖類の剥離を防止するベースアルコールに多糖類の還元末端にアルデヒド基（またはケト基）を低減するために追加されます。
- 遠心分離後、上清を再び除去され、4℃で保存し、ペレットは、次の抽出に進む前に、脱イオン水で2回洗浄した。
- オプションの手順として、セルロースなどの残留性ポリマーは、500μlのcadoxen（31％v / vの1,2 - diamiで抽出する2.4 - 手順2.1で説明したのと同じ手順を使用して、0.78 MのCDOとnoethane）。代わりに、残りのペレットで絶対セルロース含有量は、酢酸/硝酸アッセイ（説明を参照してください）を使用して決定することができます。
3。印刷マイクロアレイ
- 任意の粒子状物質を除去するためにxgの13000で抽出された細胞壁ポリマーを含有する上清を遠心分離します。
- ウェルポリプロピレン384サンプルは、組織の種類と抽出の種類に応じて配置され、あらかじめデザインされたカスタムレイアウトを使用したマイクロタイタープレートに各サンプル50μlをロードします。
- 脱イオン水で0,5、および25×シリアル希釈系列の細胞壁ポリマー試料を希釈します。
- そのようなピンの高さなどのパラメータは、収集および滞留時間、および洗浄工程は、マイクロアレイを制御するソフトウェアで設定されます。
- 印刷室の湿度は、サンプルの蒸発を防ぐために60％に制御されます。
- 印刷ジョブがLabNEXTソフト制を使用して開始されreとマイクロアレイのレイアウトに対応したプログラム。
- ロボットは機械で平板に取り付けられた20×20cmのニトロセルロース膜上にサンプルプレートから溶液をプリントする毛管チャネルピンを使用しています。アレイ上の各スポットは、溶液15 NLが含まれており、三重に印刷されています。
- 印刷ジョブが完了した後、同一のマイクロアレイは、個々の配列への膜とカットで隣同士に印刷されます。
- 各実験において、配列は多かれ少なかれサンプル、希釈または複製に対応するために修正することができます。
4。糖鎖マイクロアレイのプロービング
- 印刷後、非特異的結合を低減するために2時間、室温で生理食塩水（MPBS）をリン酸緩衝に溶解し5％w / vの脱脂粉乳で個々のマイクロアレイをブロック。
- MPBSで2時間の細胞壁糖鎖エピトープに特異的なモノクローナル抗体を用いたプローブのマイクロアレイ。モノクローナルantibの過半数細胞壁糖鎖に対するodiesは、次の3つの会社から市販されており、Biosupplies（ www.biosupplies.com.au ）、Carbosourceサービス（ www.carbosource.net ）とPlantProbes（ www.plantprobes.net ）。
- ネガティブコントロール、のみMPBS無一次抗体と共にインキュベートマイクロアレイを含む。
- マイクロアレイのリン酸塩で3回洗浄すると、非特異的な結合を除去するために5分間緩衝生理食塩水（PBS）。
- 2時間MPBSにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合させた二次抗体を用いてマイクロアレイを探る。細胞壁糖鎖に対する最もモノクローナル抗体は抗マウスまたは抗ラット二次抗体を必要とします。
- 非特異的結合を除去するために5分間3回PBS緩衝液での洗浄手順を繰り返します。
- 発色（3,3 - ジアミノベンジジン）またはchemilを使用してマイクロアレイを開発uminecent（ルミノール）基板。
5。定量化
- 現像後、高解像度（1,200 dpiの）デスクトップスキャナを使用して、個々のマイクロアレイをスキャンして、負の、16ビットのTIFFファイル（ 図3）のように画像を保存します。
- 自動グリッドツールを搭載画像処理ソフトウェア（LabNEXT）Xplore使用して、各スポットの積分強度を計算します。インテグラルスポット強度は、各スポットを囲むグリッド領域内のピクセルの合計から導出されます。
- 各マイクロアレイのグリッドデータをtxtファイルとしてエクスポートされ、手動で解析するためのExcelスプレッドシートにインポートすることができます。オンラインツール（ http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/は ）自動的に翻訳して、個々のtxtファイルからのデータを処理するために開発されました。
- インテグラルスポット強度は '平均スポットを得るために、印刷複製し、希釈液で平均化されている各サンプルの強度"の値（ 図2）。代わりに、アレイ上のちょうど1希釈値に対応するスポット信号は、各サンプルの相対的な糖鎖エピトープの存在量を定量化するために使用されています。
- 異なるサンプル間の相対的な平均スポット強度は、Excelまたはオンラインヒートマッパーツール（で条件付き書式を使用してヒートマップ（ 図4）として提示されているhttp://bar.utoronto.ca/welcome.htm ）。各抗体の種類のデータを100に修正され、5％のカットオフ値は、バックグラウンド信号と誤検出を除去するために課せられています。
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Representative Results
ニコチアナダイジョの花から6種類の組織における糖鎖の相対的な存在量（葯フィラメント、花粉、卵巣、花弁、萼片と偏見）がCoMPPを用いて決定した。図3Aは、部分的に（低）メチルエステル化homogalacturonan（HG）、ペクチン多糖類14日に発生したエピトープに対して特異的mAb JIM5でプロービングされた代表的なマイクロアレイを示しています。 JIM5エピトープは、しかし、柱頭組織中の花粉や最下位（ 図3Aおよび4A）で最も高く、すべての花の組織のCDTA抽出物中に検出されます。興味深いことに、JIM5エピトープはまた、花粉ではなく、他の組織中のNaOH抽出物（ 図3A）で検出される。
興味のある糖鎖の発生に関する定量的な情報は、マイクロアレイ上の内部標準（ 図3B）として精製された多糖類のシリーズを含むことによって得られる。異なるトンの抽出物の積分スポット強度 mAbのJIM5でプロービングの問題がhomogalacturonanの連続希釈（メチルエステル化の25％程度、DE）に由来スポット信号に整合しています。卵巣組織では、JIM5エピトープを含むhomogalacturonanの約157μgのは、総細胞壁残基（ 図3C）の約1.5％（重量比）を占め、それぞれの試料中に存在していた。 JIM5エピトープを含む625μgのhomogalacturonanは、総細胞壁残基の約6.25パーセント（重量比）を占め、花粉の組織に存在していたのに対し。
15糖鎖エピトープの相対的な存在量がカラーバーの強度は、各サンプルの補正平均スポット強度に比例した図4のヒートマップのように要約される。このデータの絵図でも図5に示されており、私たちは急速に異なる花の組織間の糖鎖エピトープの発生の違いを解釈することができますされています。
ontent ">我々の結果は、個々のグリカンエピトープが一意N.ダイジョ花の組織に分散していることを示している。例えば、LM13エピトープ（線形化（1-5）-α-L-アラビ15）は葯フィラメントと萼片の組織で最も豊富である他の組織（ 図5D）と比較してこのパターンは、短鎖のものと対照的である（1-5）-α-L-アラビは、エピトープ優先mAbのLM6（ 図5E）15によって検出された。架橋グリカンはまた別個の持っているN.ダイジョの花で発生。LM10エピトープ（低置換度（1-4）-β-D-キシラン）のパターンは、他の組織に比べて柱頭組織に豊富に存在するが、卵巣組織（ 図5G）から不在である。LM15 heteromannansは葯のフィラメント（ 図5J）で最も高いのに対しxyloglycanエピトープは、他の組織（ 図5H）に比べて花弁と葯フィラメントで最高です。図1：包括的マイクロアレイポリマープロファイリング（CoMPP）の5つの主要なステップを表す簡略化されたフロー図。
図2：包括的マイクロアレイポリマープロファイリング（CoMPP）の重要なステップのイラスト。 （）植物組織は、次の3つの複製として、収集されたアルコール不溶性の残基（AIR）を作るために均質化し、70％エタノール及びアセトンで洗浄する。 （B）細胞壁糖鎖が順次50mMのCDTAと4M NaOHを用いて大気試料から抽出されます。 （C）抽出された細胞壁グリカンマイクロアレイロボットを用いてニトロセルロースに印刷されています。各サンプルは3つの濃度と4つの印字レプリカのシリーズとして表されTES。 （D）が印刷された配列は、細胞壁糖鎖エピトープに対するmAbで個別にプローブされます。 （E）のスポット信号はtxtファイルとしてエクスポートして、相対的な平均スポット強度の値が自動的にオンラインデータ処理ツールを使用して計算され、マイクロアレイのイメージングソフトウェアを用いて定量化されています。
ニコチアナダイジョ花の組織の図3糖鎖プロファイリング。 （A）は、代表的なマイクロアレイは、モノクローナル抗体（mAb）homogalacturonan用JIM5特定の（部分的には、低メチルエステル化）でプロービングが負、16ビットのTIFFファイルとして表示されます。 （B）は、興味のある糖鎖エピトープを含む多糖類の量は、多糖類の一連の標準を印刷することにより定量することができる。 （C）対象試料の積分スポット強度は、mAbによってプローブJIM5が計算され、サンプルでは、このエピトープを含有する多糖の量（μg）を推定するための標準曲線と照合されます。
図4ヒートマップとして表さニコチアナダイジョ花組織の糖鎖プロファイリング。色の強さは相対的な平均のスポットID値（スケールバー）に比例します。モノクローナル抗体（上部に表示されている）によって検出された15グリカンエピトープの相対量は、CDTAおよびNaOH（左側）で抽出した6種類の組織について分析した。ペクチン、架橋グリカンとアラビノガラクタンタンパク質（AGPS）;グリカンエピトープは、多糖類の3つの広範なクラスに分類されます。私、メチルエステル化、DP、重合度、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体; AGP、アラビノガラクタン - プロテイン。
図5 ニコチアナダイジョ花組織の糖鎖プロファイリングが絵で表されます。 ALは異なる花組織におけるモノクローナル抗体によって検出された12糖鎖エピトープの相対的な豊かさを表しています。スケールバーの色強度がCDTA又はNaOH抽出物または両方の合計のいずれかから派生した相対的な平均スポットID値に比例します。私、メチルエステル化、DP、重合度、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体;。AGP、アラビノガラクタン-プロテイン拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
CoMPPは、数日のうちに何百もの植物由来のサンプルの糖組成をプロファイリングするための迅速かつ高感度な方法である。この方法は、レクチン、受容体、抗体16と糖結合タンパク質と糖の相互作用のハイスループットスクリーニングのためにすでに利用可能な細菌または哺乳動物糖鎖アレイ·プラットフォームを補完します。細胞壁糖鎖を検出するための利用可能なプローブの大きな多様性と、それは植物の細胞壁8,9の多糖類のすべての主要なクラスに属するグリカンエピトープに関する詳細な情報を得ることが可能である。しかし、これらは8,9確認されている糖鎖構造のわずかな割合を包含し、いくつかの事情でCoMPPのわかりやすさを制限します。それにもかかわらず、この機能は最近植物グリカン17に対して、また、非グリコシル解像度によって特徴付けエピトープに対する糖結合モジュールの使用（CBMS）によって拡張されましたそのようなグリコシル残基を変更し、糖鎖機能に重要な役割を果たしているフェノール類18とアセチル残19としてidues。
CoMPPはサンプルのセット全体で糖鎖の相対的なレベルを決定しますが、それは知られている規格（ 図3BおよびC）のそれと特定サンプルにおいて結合信号を比較することによって、順次抽出物中のエピトープのレベルを定量化することが可能である。マイクロアレイベースのプラットフォームの縮小サンプル量の利点にもかかわらず、正確にグリカン発生を定量化する能力はスポット形態またはスポット信号の彩度の違いによって妨げられる。これらの問題は（だけでなく、偽陽性など）、分析の前に、細胞壁物質の詩抽出ボリュームの量を最適化し、複製し、希釈液としてはここと哺乳類の糖鎖アレイ法16に概説のシリーズなどによって回避される。さらに、スポット形態の違いは、（サンプルの拡散による接触点から異なる速度で）は、非接触インクジェットマイクロアレイ技術16を使用することによって克服することができる。
CoMPPは細胞壁20の単離とその準備のための確立された手順と組み合わせて使用される。また、興味のあるサンプル中の糖含量についての更なる情報を得るために、既存の生化学的、酵素的および物理的方法と並行して使用することができます。代わりにセルロース系ポリマー、酢酸/硝酸アッセイを抽出たとえば20はペクチンとCDTAとNaOHとの架橋結合糖鎖の逐次抽出後に残ったセルロース含有量（mg）を定量化するために使用することができます。グリカンマイクロアレイ21の酵素処理は、試料間グリカンエピトープ分布の違いについて詳細を明らかにする、またはマイクロアレイ上で検出されたエピトープ構造の特異性を確認することができます。このような最近記載されているような独立した分析技術によって糖鎖組成の決定 我々は、糖鎖がNの臓器または組織特異的に分布していることを実証するダイジョの花。この情報は、これらの異なる種類の細胞に存在する酵素を合成するまたは変更する糖鎖エピトープまたは糖鎖の生物学的機能への洞察を与えることができます。 CoMPPは、以前に開発23,24中または突然変異10,25に対応して草型22との関係で発生する細胞壁の変化への洞察を提供してきました。要約すると、CoMPPは、植物細胞壁中の糖鎖と糖鎖合成と修正遺伝子の多様な役割を勉強するための貴重なツールです。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
IEMは資金調達のためにデンマークの研究評議会（FTPとFNU）を承認したいと思います。 ERLは、ARCのDP助成金の支援を認めている。 ABは、植物の細胞壁の助成金で優秀のARCセンターの支援を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
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