Summary
Техника называется
Protocol
1. Коллекция тканей и подготовка
- Соберите 100 мг сырого веса ткани растений (минимум 10 мг сухого веса) по крайней мере в трех экземплярах для каждой ткани интерес. Следующие шаги описывают подготовку клеточного материала стены из растительной ткани. В случае хранения тканей, нежелательного крахмал ферментативно удалены прежде чем приступить к добыче полимеров клеточной стенки, как описано выше 13.
- Однородный образцов в мелкий порошок с жидким азотом использованием Qiagen TissueLyser II, с 24 трубка наборы и 3 мм из карбида вольфрама бисером (30 Гц, 2 х 30 сек). Либо, если только несколько образцов обрабатываются, ступка и пестик используются.
- Передача гомогенатах в 10 мл коническую пластиковых труб.
- Подготовить материал клеточной стенки, промывая гомогенатах в 10 мл 80% об / об этанола при комнатной температуре и встряхиванием энергично в течение 2 мин.
- Центрифуга образцов при 3500 мкг и отбросить супернатант. Повторите 70% этанола моет по крайней мере, три раза или до супернатант ясно, особенно для тканей, содержащих хлорофилл.
- Выполнение последней промывки со 100% ацетона и оставляют гранулы, содержащие алкоголь нерастворимых остатков (AIR) в воздушно-сухом ночь.
- Сито проб воздуха с 0,4 мм 2 сетки для достижения штрафа, однородный порошок и для удаления крупных, плохо измельченные частицы, которые иногда остаются в гомогената.
- Взвешивание 10 мг пробы воздуха в микропробирки, каждый из которых содержит 3 мм, стеклянная бусина, чтобы помочь перемешивания образцов.
2. Добыча Гликаны клеточной стенки
- Пектины, и полимеры, связанных с пектины выделяются из образцов путем добавления 500 мкл 50 мкМ CDTA (рН 7,5) в каждой пробе.
- Коротко вихревой трубы для обеспечения растворитель находится в контакте с образцом материала, а затем смешать помощью TissueLyser в течение 3 ч при 8 Гц.
- Центрифуга образцов при 12000 мкг, тщательно галить супернатанты и хранить при 4 ° C.
- Вымойте гранул в 1 мл деионизированной воды для разбавления и удаления остатков растворителя, вихрь и центрифуге при 13000 х г. Повторите этот шаг, не нарушая гранул и удалить всю жидкость из трубки, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Сшивка гликанов последовательно извлечены из оставшихся клеточной стенки гранул с 500 мкл 4 М NaOH с 0,1% м / NaBH4, используя ту же процедуру, описанную в шагах 2,1 - 2,4 для извлечения CDTA. NaBH 4 добавляют к снижению альдегида (или кето) группы на сокращение конце полисахаридов с алкоголем тем самым предотвращая шелушение базе полисахаридов.
- После центрифугирования надосадочную жидкость снова снимается, хранится при температуре 4 ° С, а осадки промывают два раза в деионизированной воде, прежде чем переходить к следующей добычи.
- В качестве дополнительного шага, остаточная полимеры, такие как целлюлоза экстрагировали 500 мкл cadoxen (31% об / об 1,2-diaminoethane с 0,78 м CdO), используя ту же процедуру, как описано в пунктах 2.1 - 2.4. Кроме того, абсолютное целлюлозного содержание в оставшиеся гранулы можно определить с помощью уксусной / азотной анализов (см. обсуждение).
3. Печать Microarrays
- Центрифуга супернатантов, содержащих извлеченные полимеров клеточной стенки при 13000 мкг для удаления твердых частиц.
- Загрузите 50 мкл каждого образца в полипропилен 384-луночных планшет использованием заранее разработанных пользовательский макет, где образцы расположены в соответствии с типом ткани и добыча типа.
- Развести клеточной стенки полимера образца в 0, 5 и 25 × последовательный ряд разбавления деионизированной воды.
- Такие параметры, как высота контактный, сбор и время выдержки, и промывки устанавливаются на программное обеспечение управления microarrayer.
- Влажность печати камере контролируется на 60%, чтобы предотвратить испарение образца.
- Задание печати начали использовать LabNEXT SoftwaRe и программы, которые соответствуют макет микрочипов.
- Робот использует капиллярный канал контактов для печати Решения от образца пластину на 20 х 20 см нитроцеллюлозные мембраны, которая прикреплена к плоской пластине в машине. Каждое пятно на массив содержит 15 нл раствора и печатается в трех экземплярах.
- Идентичные микрочипы будут напечатаны рядом друг с другом на мембране и разрезать на отдельные массивы после выполнения задания печати завершена.
- В каждом эксперименте массивы могут быть модифицированы в целях удовлетворения более или менее образцов, разведения или репликации.
4. Зондирование Glycan Microarrays
- После печати блокировать отдельные микрочипы в 5% вес / объем сухого обезжиренного молока растворяют в фосфатном буферном растворе (MPBS) при комнатной температуре в течение 2 ч для уменьшения неспецифического связывания.
- Зонд микрочипов с помощью моноклональных антител, специфичных для клеточной стенки гликана эпитопов в течение 2 часов в MPBS. Большинство моноклональных Антибodies против гликанов клеточной стенки являются коммерчески доступными из трех компаний; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Services ( www.carbosource.net ) и PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
- Включите отрицательного контроля, микрочип инкубируют только с MPBS и нет первичных антител.
- Вымойте микрочипов в 3 раза фосфатным буферным раствором (PBS) в течение 5 мин для удаления неспецифического связывания.
- Зонд микрочипы с вторичными антителами конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) в MPBS в течение 2 часов. Большинство моноклональных антител против гликанов клеточной стенки требуют анти-мышь или крысу анти-вторичными антителами.
- Повторите шаги стиральной 3 раза PBS буфера в течение 5 мин для удаления неспецифического связывания.
- Разработка микрочипов использованием хромогенного (3,3-диаминобензидина) или chemiluminecent (люминол) подложках.
5. Квантификация
- После разработки, сканировать отдельные микрочипы с использованием высокого разрешения (1200 точек на дюйм) настольный сканер и сохранять изображения как отрицательные, 16-разрядные файлы TIFF (рис. 3).
- Вычислить интеграл интенсивности каждой месте с помощью Xplore Image Processing Software (LabNEXT), оснащенный автоматизированным инструментом сетки. Интегральной интенсивности пятна, полученные от суммы пикселов в сетке окрестностях каждого пятна.
- Сетке данных для каждого микрочипов экспортируется в виде текстового файла и может быть вручную импортировать в электронную таблицу Excel для анализа. Онлайн-инструмент ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) была разработана для автоматического перевода и обработки данных из отдельных файлов TXT.
- Интегральной интенсивности пятна среднем по печати повторяет и разведения, чтобы получить "среднюю местеИнтенсивность 'значения для каждого образца (рис. 2). Кроме того, местная сигналы, соответствующие одной разведения значение в массиве используются для количественной оценки относительной эпитопа гликана изобилия для каждого образца.
- Относительная средняя интенсивность место между различными образцами представлены в виде HeatMap (рис. 4) с помощью условного форматирования в Excel или в Интернете heatmapper инструментов ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Данные для каждого типа антител корректируется до 100 и 5% пороговое значение накладывается для удаления фонового сигнала и ложных срабатываний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Относительное содержание гликанов в шести типов тканей (тычиночные нити, пыльца, яичников, лепестков, чашелистиков и стигма) из Nicotiana цветы Alata определяли с помощью CoMPP. 3А показывает представителя микрочипов, которые были исследовали с МАБ JIM5 специфичные для частичной (низкий) methylesterified homogalacturonan (HG), эпитоп, который происходит на пектиновые полисахариды 14. JIM5 эпитоп обнаружены в экстрактах CDTA всех цветов ткани, однако является самым высоким в пыльце и самая низкая в ткань рыльца (рис. 3А и 4А). Интересно, что эпитоп JIM5 также обнаружены в экстрактах NaOH в пыльце, но не в других тканях (рис. 3А).
Количественные данные о возникновении гликана интереса получены в том числе ряд очищенных полисахаридов в качестве внутренних стандартов на микрочипе (рис. 3В). Интегральная интенсивность месте экстрактов различных т вопросы исследовали с МАБ JIM5 согласован с местом сигналов, полученных от серийного разведения homogalacturonan (25% степенью этерификации метил, DE). В яичнике ткани, примерно 157 мкг homogalacturonan содержащие JIM5 эпитоп присутствует в каждом образце, что составляет около 1,5% (по весу) от общего числа клеточных стенок остатков (рис. 3). В то время как 625 мкг homogalacturonan содержащие JIM5 эпитоп присутствует в пыльце ткани, что составляет примерно 6,25% (по весу) от общего числа остаток клеточной стенки.
Относительная численность в 15 эпитопы гликанов представлены как HeatMap на рисунке 4, где интенсивность цвета баров пропорционально скорректированной средней интенсивности место для каждого образца. Графическое представление этих данных также может быть проиллюстрирована на рисунке 5 и позволяет нам быстро интерпретировать различия в возникновении гликана эпитопа между различными тканями цветка.
ontent "> Наши результаты показывают, что отдельные эпитопы гликана однозначно распределены между Н. Alata ткани цветка. Например, LM13 эпитопа (линеариз. (1-5)-α-L-arabinan 15) является наиболее распространенным в тычиночные нити и ткани чашелистик по сравнению с другими тканями (рис. 5D). Эта картина разительно контрастирует с более короткими цепями (1-5)-α-L-arabinan эпитопов преимущественно обнаружены мАт LM6 (Рис. 5E) 15. сшивания гликанов также имеют различные закономерности возникновения в Н. цветы Alata. эпитопа LM10 (с низкой степенью замещения (1-4)-β-D-ксилан) в изобилии стигмы ткани по сравнению с другими тканями, но отсутствует в яичнике ткани (рис. 5Г). LM15 xyloglycan эпитопы являются самыми высокими в лепесток и пыльников нити по сравнению с другими тканями (рис. 5H), в то время как heteromannans являются самыми высокими в нитях пыльника (рис. 5J).Рисунок 1. Упрощенная схема, представляющих пять основных этапов комплексного Microarray полимерных профилирования (CoMPP).
Рисунок 2. Иллюстрация из ключевых этапов комплексного Microarray полимерных профилирования (CoMPP). (A) завод тканей, собранных в трех повторах, гомогенизируют и промывают в 70% этаноле и ацетоне, чтобы сделать алкоголь нерастворимых остатков (AIR). (B) гликанов клеточной стенки последовательно извлечены из проб воздуха с 50 мМ CDTA и 4 М NaOH. (C) Извлеченные гликанов клеточной стенки печатаются на нитроцеллюлозы с помощью робота микрочипов. Каждый образец представлен в трех концентрациях и в серии из четырех печати репликиТЭС. (D) печатных массивов исследовали индивидуально с моноклональных антител направлено на клеточную стенку гликанов эпитопов. (E) пятно сигналы количественно с помощью микрочипов для обработки изображений, экспортируемых в виде файлов TXT и относительные средние значения интенсивности месте рассчитываются автоматически с помощью онлайн обработки данных инструментов.
Рисунок 3. Glycan профилирования Nicotiana Alata ткани цветка. (A) представитель микрочипов исследовали с помощью моноклональных антител (МКА) JIM5 специфичные для homogalacturonan (частично, низкие methylesterification) обозначается как отрицательные, 16-битных файлов TIFF. (B) количество полисахарида, содержащего гликана эпитоп интереса можно оценить по печати серии полисахарид стандартам. (C) интегральной интенсивности месте образца интересом исследовал МАБJIM5 рассчитывается и соответствуют стандартной кривой для оценки количества (мкг) полисахарид, содержащий эту эпитопов в образце.
Рисунок 4. Glycan профилирования Nicotiana Alata ткани цветок представлен в виде HeatMap. Интенсивность окраски пропорциональна относительно среднего значения личности месте (шкалы). Относительная численность от 15 эпитопы гликана обнаружены с помощью моноклональных антител (вверху списка) была проанализирована в течение шести типов тканей экстрагировали CDTA и NaOH (с левой стороны). Гликана эпитопов делятся на три больших класса полисахаридов, пектиновых веществ, сшивание гликанов и арабиногалактан белков (AGPS). Мне, метил-этерификации, DP, степень полимеризации; МАБ, моноклональные антитела, AGP, арабиногалактан-белка.
Рисунок 5. Glycan профилирования Nicotiana Alata ткани цветок представлен наглядно. AL представляет собой относительное изобилие из 12 эпитопы гликана моноклональные антитела обнаружены в различных тканях цветка. Шкалу интенсивности цвета бар пропорционально относительно среднего значения личности месте, полученные либо из CDTA или NaOH экстракты или суммы обоих. Мне, метил-этерификации, DP, степень полимеризации; МАБ, моноклональные антитела;. AGP, арабиногалактан-белка Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CoMPP это быстрый и чувствительный метод для профилирования гликана составе сотни растительного происхождения образцов в течение нескольких дней. Этот метод дополняет уже имеющиеся бактерий и млекопитающих гликана платформ массив для высокопроизводительного скрининга углеводов взаимодействия с гликана-связывающие белки, такие как лектины, рецепторы и антитела 16. С большим разнообразием датчиков для обнаружения гликанов клеточной стенки, можно получить подробную информацию о эпитопов гликана принадлежащие ко всем основным классам полисахаридов в растительном клеточной стенки 8,9. Однако эти охватывают только небольшую часть гликана структур, которые были выявлены 8,9, а в некоторых случаях ограничить усвояемость CoMPP. Тем не менее, эта возможность была недавно расширена за счет использования связывания углеводов модулей (МД) против завода гликанов 17, а также против эпитопов характеризуется не-гликозильные разрешенияidues, таких как фенолы 18 и ацетил остатков 19, который изменить гликозильные остатков и играют важную роль в гликана функции.
Хотя CoMPP определяет относительные уровни гликанов в наборе образцов, можно количественно оценить эпитопа уровней в последовательном экстрактов путем сравнения сигнала связывания в конкретных пробах с известными стандартами (рис. 3В и С). Несмотря на преимущества снижение объемов образца в микрочипов на основе платформы, возможность точного количественного гликана появление может быть затруднено различия в морфологии месте или насыщенности месте сигнала. Эти проблемы (равно как и ложных срабатываний) можно избежать за счет оптимизации количества клеточного материала стен стихи экстрагента объемом до анализа, и в том числе ряд повторяет и разведение, как описано здесь, и в млекопитающих гликана методы массива 16. Кроме того, различия в морфологии месте (в связи с распространением образцовс разной скоростью, с точки контакта) может быть преодолена с помощью бесконтактной струйной технологии микрочипов 16.
CoMPP используется в комбинации с установленными процедурами для выделения и подготовки клеточных стенок 20. Он также может использоваться параллельно с существующими биохимических, ферментативных и физические методы, чтобы получить более подробную информацию о гликана содержание в образцах интерес. Например, вместо извлечения целлюлозные полимеры, уксусной / азотной кислоты 20 анализов могут быть использованы для количественного содержания целлюлозы (мг), оставшегося после последовательного извлечения пектина и сшивания гликанов с CDTA и NaOH. Фермент лечения гликана микрочипы 21 может также выявить дальнейшие различия в распределении гликана эпитопа среди образцов, или подтверждения специфичности структуры эпитопов обнаружены на микрочипе. Определение гликана состав независимых аналитических методов, таких, как недавно описанной Мы показываем, что гликаны распределены в орган или ткань определенным образом в N. Alata цветы. Эта информация может дать представление о биологической функции гликана эпитопы или гликана синтеза или изменения ферментов, присутствующих в этих различных типов клеток. CoMPP ранее дали представление клеточной стенки изменений, которые происходят в связи с посадить типа 22 при разработке 23,24 или в ответ на мутации 10,25. Таким образом, CoMPP является ценным инструментом для изучения разнообразных роль гликанов и гликана гены синтеза и модификации в клеточной стенке завода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
IEM хотел бы отметить датского исследовательского совета (FTP и FNU) для финансирования. ERL признает, поддержка ARC DP гранта. AB благодарит за поддержку АРК центра передового опыта в завод грант клеточных стенок.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
