Summary
En teknik som kallas
Abstract
Växt cellväggar är komplexa matriser av heterogena glykaner som spelar en viktig roll i fysiologi och utveckling av växter och ge råvaror för mänskliga samhällen (t.ex. trä, papper, textil-och biobränsle industri) 1,2. Men förstå biosyntes och funktion av dessa komponenter förblir utmanande.
Cellvägg glykaner är kemiskt och konformationellt olika beroende på komplexiteten i deras byggstenar, de glykosylrester. Dessa bildar bindningar vid flera positioner och skiljer sig i ringstruktur, isomer eller anomeriska konfigurationen, och dessutom är substituerade med en grupp av icke-sockerrester. Glykan sammansättning varierar i olika cell-och / eller typer vävnad eller sub-domäner av en enda cell vägg 3. Dessutom är deras sammansättning också ändras under utveckling 1, eller som svar på miljö-signaler 4.
I excess av 2.000 gener har växt cellväggar är komplexa matriser av heterogena glykaner förutsagts vara inblandade i cellväggen glykan biosyntes och modifiering i Arabidopsis 5. Emellertid har relativt få av de biosyntetiska gener funktionellt karaktäriseras 4,5. Omvänd genetik metoder är svårt eftersom generna ofta är differentiellt uttryckta, ofta vid låga nivåer, mellan celltyper 6. Dessutom är muterade studier ofta hindras av gen redundans eller kompenserande mekanismer för att garantera lämplig cellväggen funktion bibehålls 7. Således nya metoder behövs för att snabbt karakterisera många olika glykanstrukturer och underlätta funktionsgenomiska metoder för att förstå cellväggsbiosyntes och modifiering.
Monoklonala antikroppar (mAbs) 8,9 har dykt upp som ett viktigt verktyg för att bestämma glykan struktur och fördelning i växter. Dessa erkänner distINCT epitoper som finns inom huvudklasser av växtcellväggnedbrytande glykaner, inklusive pektiner, xyloglucans, xylaner, mannaner, glukaner och arabinogalactans. Nyligen deras användning har utvidgats till storskalig screening experiment för att bestämma den relativa förekomsten av glykaner i ett brett spektrum av växt-och vävnadstyper samtidigt 9,10,11.
Här presenterar vi en microarray-baserade glykan screening metod som kallas Omfattande Microarray Polymer Profilering (CoMPP) (figur 1 och 2) 10,11 som gör att flera prover (100 sek) kan ses med en miniatyriserad microarray-plattform med minskad reagens och volymerna prov. De platsen signaler på microarray formellt kan kvantifieras för att ge semi-kvantitativa data om glykan epitop händelse. Detta tillvägagångssätt är väl lämpad att spåra glykan förändringar i komplexa biologiska system 12 och ger en helhetsbild av cellväggen sammansättning särskilt när förkunskaper of detta är tillgänglig.
Protocol
1. Tissue Insamling och förberedelse
- Samla 100 mg färskvikt av växtvävnader (minst 10 mg torrvikt) i minst tre exemplar för varje vävnad av intresse. Följande steg beskriver framställningen av cellväggen material från vegetativa vävnader. När det gäller lagring vävnader är oönskad stärkelse enzymatiskt bort innan du fortsätter med utvinning av polymerer cellväggen som tidigare beskrivits 13.
- Homogenisera proverna till ett fint pulver med flytande kväve med användning av en Qiagen TissueLyser II med 24 uppsättningar Röradapter och 3 mm volframkarbid pärlor (30 Hz, 2 x 30 sek). Alternativt om endast ett fåtal prover behandlas, är en mortel och mortelstöt användes.
- Överför homogenaten i 10 ml plast koniska rör.
- Förbereda material cellvägg genom tvättning av homogenaten i 10 ml 80% vol / vol etanol vid RT och vortexa kraftigt i 2 minuter.
- Centrifugera prover vid 3.500 x g och kasta supernatanten. Upprepa 70% etanol tvättar minst tre gånger eller tills supernatanten är klar, i synnerhet för vävnader som innehåller klorofyll.
- Utför en slutlig tvätt med 100% aceton och lämna pellets innehållande alkohol olösliga rester (AIR) lufttorka över natten.
- Sikta AIR prover med en 0,4 mm 2 mesh för att uppnå ett fint, homogent pulver och ta bort större, dåligt slipade partiklar som någon gång kvar i homogenatet.
- Väg 10 prov mg luft i mikrorör, vardera innehållande en 3 pärla mm glas för att underlätta blandning av prover.
2. Extraktion av glykaner Cell Wall
- Pektiner, och polymerer som är förknippade med pektiner extraheras från proverna genom tillsats av 500 pl av 50 pM CDTA (pH 7,5) till varje prov.
- Kortfattat vortexa rören för att säkerställa att lösningsmedlet är i kontakt med provmaterialet och sedan blanda med TissueLyser under 3 timmar vid 8 Hz.
- Centrifugera proverna vid 12.000 xg, försiktigt rEFlytta supernatanterna och förvara vid 4 ° C.
- Tvätta pelletar i 1 ml avjoniserat vatten för att späda ut och avlägsna eventuellt kvarvarande lösningsmedel, vortexa och centrifugera vid 13.000 x g.. Upprepa detta steg utan att störa pelleten och avlägsna all vätska från rören innan man fortsätter till nästa steg.
- Tvärbindning glykaner sekventiellt extraheras från den återstående cellväggen pelleten med 500 pl 4 M NaOH med 0,1% vikt / vol NaBH4, med användning av samma förfarande som beskrivits i steg från 2,1 till 2,4 för CDTA extraktionen. NaBH 4 sättes för att reducera aldehyden (eller keto) grupp vid den reducerande änden av polysackarider till en alkohol och förhindrar därigenom basen skalning av polysackarider.
- Efter centrifugering, supernatanter avlägsnas åter, lagrad vid 4 ° C och pelletsen tvättas två gånger i avjoniserat vatten innan man går vidare till nästa extraktion.
- Som ett valfritt steg, är återstående polymerer, såsom cellulosa extraherades med 500 ul cadoxen (31% vol / vol 1,2-diaminoethane med 0,78 M CdO) med användning av samma förfarande som beskrivits i steg från 2,1 till 2,4. Alternativt kan absolut cellulosa innehåll i kvarvarande pellets bestämmas med användning av ättiksyra / Nitric analyser (se diskussion).
3. Skriva Microarrays
- Centrifugera supernatanter innehåller extraherade polymerer cellväggen vid 13.000 xg för att avlägsna partiklar.
- Fyll 50 ul av varje prov i en polypropylen 384 brunnars mikrotiterplatta med en i förväg utformad anpassad layout där prover ordnade efter vävnadstyp och utvinning typ.
- Späd cellväggen polymerprov i en 0, 5 och 25 x seriell spädningsserier med avjoniserat vatten.
- Parametrar som stift höjd, insamling och uppehållstid samt tvättningssteg ställs på programvaran styr microarrayer.
- Den fuktighet tryckning kammaren regleras till 60% för att förhindra provavdunstning.
- Utskriften startas med LabNEXT software och ett program som motsvarar microarray layouten.
- Roboten använder kapillärkanal stift för att skriva ut lösningar från provplattan på 20 x 20 cm nitrocellulosamembran som är fäst vid en plan platta i maskinen. Varje plats på matrisen innehåller 15 nl lösning och trycks i triplikat.
- Identiska mikromatriser skrivs bredvid varandra på membranet och skär i enskilda arrayer efter utskriften är klar.
- I varje experiment matriserna kan modifieras för att passa mer eller mindre prover, utspädningar och replikat.
4. Sondering av glykan Microarrays
- Efter utskriften blockera enskilda microarrays i 5% vikt / volym skummjölkspulver löst i fosfatbuffrad saltlösning (MPBS) vid rumstemperatur under 2 h för att reducera icke-specifik bindning.
- Probe microarrays med monoklonala antikroppar specifika för cellväggen glykan epitoper under 2 timmar i MPBS. Majoriteten av monoklonala Antibodies mot glykaner cellväggen är kommersiellt tillgängliga från tre företag, Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource tjänster ( www.carbosource.net ) och PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
- Inkludera en negativ kontroll, en mikromatris inkuberades med endast MPBS och ingen primär antikropp.
- Tvätta mikromatriser 3 gånger i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 5 minuter för att avlägsna icke-specifik bindning.
- Söka av mikromatriser med sekundär antikropp konjugerad till pepparrotsperoxidas (HRP) i MPBS under 2 timmar. De flesta monoklonala antikroppar mot glykaner cellväggen kräver anti-mus eller anti-rått sekundära antikroppar.
- Upprepa tvättningsstegen 3 gånger med PBS-buffert under 5 min för att avlägsna icke-specifik bindning.
- Utveckla microarrays med kromogena (3,3-Diaminobenzidine) eller chemiluminecent (luminol) substrat.
5. Kvantifiering
- Efter utveckling, skanna enskilda microarrays med en hög upplösning (1200 dpi) bordsskanner och spara bilderna som negativa, 16-bitars TIFF-filer (Figur 3).
- Beräkna den integrerade intensiteten för varje plats med hjälp Xplore bildbehandlingsprogram (LabNEXT) utrustad med en automatisk rutnät verktyg. Den integrerade fläcken intensitet härrör från summan av pixlar i rutnätet som omger varje fläck.
- Grid data för varje microarray exporteras som en txt-fil och kan manuellt importeras till ett Excel-kalkylblad för analys. Ett online-verktyg ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) har utvecklats för att automatiskt översätta och bearbeta data från enskilda txt-filer.
- Den integrerade plats intensitet genomsnitt över utskriften replikerar och utspädning för att erhålla en "genomsnittlig platsintensitet "värde för varje prov (Figur 2). Alternativt, är platsen signaler som motsvarar en enda utspädning värde på matrisen används för att kvantifiera relativa glykan epitopen överflöd för varje prov.
- De relativa genomsnittliga plats intensiteter mellan olika prover presenteras som en heatmap (Figur 4) hjälp av villkorsstyrd formatering i Excel eller på nätet heatmapper verktyg ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Data för varje antikropp typ korrigeras till 100 och en 5% gränsvärde införs för att avlägsna bakgrundssignalen och falska positiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den relativa förekomsten av glykaner i sex vävnadstyper (anther filament, pollen, äggstockar, kronblad, foderblad och stigma) från Nicotiana alata blommor bestämdes med användning CoMPP. Figur 3A visar en representativ mikromatris som har undersöktes med mAb JIM5 specifik för partiellt (låg) methylesterified homogalacturonan (HG), en epitop som uppträder på pektin polysackarider 14. Den JIM5 epitopen detekteras i CDTA extrakt av alla blommor vävnader är dock högst i pollen och lägst i stigmatiserad vävnad (Figur 3A och 4A). Intressant är JIM5 epitopen även detekteras i NaOH extrakten i pollen men inte i andra vävnader (figur 3A).
Kvantitativ information om förekomsten av en glykan av intresse erhålls genom att inkludera en serie av renade polysackarider som interna standarder för microarray (Figur 3B). Integrerad plats intensitet extrakt av olika t frågor undersöktes med mAb JIM5 matchas till platsen signaler som härrör från en seriell spädning av homogalacturonan (25% grad av metyl-förestring, DE). I äggstockarna vävnad var cirka 157 pg homogalacturonan innehåller JIM5 epitopen närvarande i varje prov, som står för cirka 1,5% (vikt) av den totala rester cellväggen (Figur 3C). Medan 625 g homogalacturonan innehåller JIM5 epitopen var närvarande i pollen vävnad och står för cirka 6,25% (vikt) av den totala cellväggen rest.
Den relativa förekomsten av 15 glykanstrukturer epitoper sammanfattas som en heatmap i figur 4, där intensiteten av färgstaplar är proportionell mot den justerade genomsnittliga platsen intensitet för varje prov. En illustrerad representation av dessa uppgifter visas också i fig 5 och tillåter oss att snabbt tolka skillnaderna i glykan epitop förekomst mellan de olika blomma vävnader.
ontent "> Våra resultat visar att enskilda glykanstrukturer epitoper unikt distribuerade bland N. alata blomma vävnader. Till exempel är LM13 epitopen (lineariserad (1-5)-α-L-arabinan 15) mest förekommande i ståndarknapp filament och sepal vävnader jämfört med andra vävnader (Figur 5D). Detta mönster är i slående kontrast till den för kortare kedja (1-5)-α-L-arabinan-epitoper företrädesvis detekteras av mAb LM6 (figur 5E) 15. Tvärbindning glykaner också har distinkta mönster av förekomst i N. alata blommor. The LM10 epitop (låg-substituerad (1-4)-β-D-xylan) är rikligt förekommande i stigmatisering vävnad jämfört med andra vävnader, men är frånvarande från äggstockar vävnad (figur 5G). LM15 xyloglycan epitoper är högst i blomblad och anther glödtråd jämfört med andra vävnader (figur 5H), medan heteromannans är högst i anther filament (figur 5J).Figur 1. Ett förenklat flödesschema som representerar de fem viktigaste stegen i omfattande Microarray Polymer Profilering (CoMPP).
Figur 2. En illustration av de viktigaste stegen i omfattande Microarray Polymer Profilering (CoMPP). (A) växtvävnader samlas som tre replikat, homogeniseras och tvättas i 70% EtOH och aceton för att göra alkohol olösliga rester (AIR). (B) Cell vägg glykaner sekventiellt ur luftprover med 50 mM CDTA och 4 M NaOH. (C) Extraherade cell vägg glykaner trycks på nitrocellulosa med en microarray robot. Varje prov är representerad i tre koncentrationer, och som en serie av fyra tryck replikates. (D) De tryckta arrayer sonderas individuellt med mAb riktade mot cellväggs glykaner epitoper. (E) De platsen signalerna kvantifieras med hjälp av microarray bildbehandlingsprogram, exporteras som txt-filer och relativa genomsnittliga plats värden intensitet automatiskt beräknas med hjälp av en online-databehandling verktyg.
Figur 3. Glykan profilering av Nicotiana alata blomma vävnader. (A) En representativ microarray sonderade med monoklonal antikropp (mAb) JIM5 specifik för homogalacturonan (delvis låg methylesterification) anges som en negativ, 16-bitars TIFF-fil. (B) Mängden polysackarid som innehåller en glykan epitop av intresse kan kvantifieras genom att skriva en serie polysackarid standarder. (C) Integrerad fläck intensitet av prov av intresse sonderade med mAbJIM5 beräknas och anpassas till en standardkurva för att uppskatta mängden (pg) polysackarid innehållande denna epitop i provet.
Figur 4. Glykan profilering av Nicotiana alata blomma vävnad representeras som en heatmap. Färgintensiteten är proportionell mot den relativa medelvärdet plats identitet värde (skala bar). Relativa förekomsten av 15 glykan epitoper som detekteras av monoklonala antikroppar (visas överst) analyserades för sex vävnadstyper extraherade med CDTA och NaOH (vänster). Glykanen epitoper delas in i tre breda klasser av polysackarider, pektiner, tvärbindande glykaner och arabinogalaktan proteiner (AGPS). mig, metylförestring, DP, polymerisationsgrad, mAb, monoklonala antikroppar, AGP, arabinogalaktan-proteinet.
Figur 5. Glykan profilering av Nicotiana alata blomma vävnader representerade bildmässigt. AL representerar den relativa abundansen av 12 glykanstrukturer epitoper som detekteras av mAb i olika vävnader blomma. Skalan baren färgintensiteten är proportionell mot den relativa medelvärdet plats identitet värde som härleds från antingen CDTA eller NaOH extrakt eller en summa av båda. mig, metylförestring, DP, polymerisationsgrad, MAB, monoklonala antikroppar,. AGP, arabinogalaktan-protein Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CoMPP är en snabb och känslig metod för profilering av glykan sammansättningen av hundratals vegetabiliska prover i några dagar. Denna metod kompletterar de redan tillgängliga bakterie-eller däggdjursceller glykan array plattformar för high-throughput screening av kolhydrater interaktioner med glykan-bindande proteiner såsom lektiner, receptorer och antikroppar 16. Med en stor mångfald av prober tillgängliga för detektion glykaner cellväggen, är det möjligt att få detaljerad information om glykan epitoper tillhör alla större klasser av polysackarider i växtcellväggen 8,9. Men dessa omfattar endast en liten del av de glykanstrukturer som har identifierats 8,9, och i vissa fall begränsar begriplighet CoMPP. Ändå har denna förmåga nyligen utvidgats genom användning av kolhydratbindande moduler (förtroendeskapande åtgärder) mot växt glykaner 17, och också mot epitoper som kännetecknas av icke-glykosyl residues som fenolföreningar 18 och acetyl rester 19 som modifierar glykosylrester och spelar en viktig roll i glykan funktion.
Även CoMPP bestämmer de relativa nivåerna av glykaner över en uppsättning prover, är det möjligt att kvantifiera de epitop nivåer i sekventiella extrakt genom att jämföra den bindande signalen i specifika prover som av kända standarder (Figur 3B och C). Trots fördelarna med minskade provvolymer i en microarray-baserad plattform, kan förmågan att exakt kvantifiera glykan händelse hindras av skillnader i spot morfologi eller mättnad av spot-signal. Dessa problem (liksom falskt positiva) undviks genom att optimera mängden cellväggmaterialet verser extraktant volym före analys, och med en serie av upprepningar och spädningar som beskrivs här och i däggdjur glykan array metoder 16. Vidare, skillnader i morfologi fläck (orsakad av diffusion av provermed olika hastigheter från kontaktpunkten) kan övervinnas genom användning av icke-kontakt bläckstråle Mikroarrayteknik 16.
CoMPP används i kombination med etablerade förfaranden för isolering och beredning av cellväggar 20. Den kan också användas parallellt med befintliga biokemiska, enzymatiska och fysikaliska metoder för att få ytterligare information om glykan innehåll i prover av intresse. Till exempel istället för att utvinna cellulosapolymerer, Ättiksyra / Nitric analyser sura 20 kan användas för att kvantifiera cellulosa innehåll (mg) som återstår efter sekventiell extraktion av pektin och tvärbindande glykaner med CDTA och NaOH. Enzymbehandling av glykan mikromatriser 21 kan också avslöja ytterligare skillnader i glykan epitop fördelning bland prover eller bekräfta specificiteten hos epitoper strukturer upptäckts på microarray. Bestämningen av glykan komposition av oberoende analytiska tekniker, såsom de som nyligen beskrivits Vi visar att glykaner fördelas i ett organ eller vävnad specifikt sätt i N. alata blommor. Denna information kan ge insikt i den biologiska funktionen av glykan epitoper eller glykan syntes eller modifiera enzymer som förekommer i dessa olika celltyper. CoMPP har tidigare lämnat insikt förändringar cellvägg som uppstår i samband med plantera typ 22 under utveckling 23,24 eller som svar på mutation 10,25. Sammanfattningsvis är CoMPP ett värdefullt verktyg för att studera olika roll glykaner och glykan syntes och modifiering gener i växtcellväggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
IEM skulle vilja erkänna det danska forskningsrådet (FTP och FNU) för finansiering. ERL erkänner stöd av en ARC DP bidrag. AB erkänner stöd av ARC Centre of Excellence i Plant cellväggar bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
