Summary
Uma técnica chamada
Abstract
Paredes das células de planta são matrizes complexas de glicanos heterogéneos, que desempenham um papel importante na fisiologia e desenvolvimento de plantas e fornecer as matérias-primas para as sociedades humanas (por exemplo, as indústrias de madeira, papel, têxteis, e biocombustíveis) 1,2. No entanto, compreender a biossíntese e função destes componentes permanece um desafio.
Glicanos de parede celular são quimicamente e conformacionalmente diversificada, devido à complexidade dos blocos de construção, os resíduos glicosilo. Estas ligações formam em posições múltiplas e diferem na estrutura do anel, a configuração isomérica ou anomérico, e, além disso, são substituídas por uma matriz de não-açúcar resíduos. Composição varia de glicano na célula diferente e / ou tipos de tecidos, ou mesmo sub-domínios de uma única célula de parede 3. Além disso, a sua composição é também modificado durante o desenvolvimento 1, ou em resposta a estímulos ambientais 4.
Em excesso de 2.000 genes têm paredes celulares de plantas são matrizes complexas de glicanos heterogéneas foram previstos para ser envolvido na biossíntese de glicanos parede celular e modificação em 5 Arabidopsis. No entanto, relativamente poucos dos genes biossintéticos foram funcionalmente caracterizados 4,5. Genética reversa são difíceis porque os genes expressos diferencialmente são muitas vezes, muitas vezes em níveis baixos, entre os tipos de células 6. Além disso, estudos mutantes são muitas vezes dificultada pela redundância gene ou mecanismos compensatórios para garantir o funcionamento adequado parede celular é mantida 7. Assim, novas abordagens são necessárias para rapidamente caracterizar a diversidade de estruturas de glicano e facilitar abordagens genômica funcional para a compreensão a síntese da parede celular e modificação.
Os anticorpos monoclonais (mAb) 8,9 surgiram como uma ferramenta importante para a determinação da estrutura de glicano e distribuição nas plantas. Estes reconhecem distepítopos INCT presentes dentro das principais classes de glicanos da parede celular vegetal, incluindo pectinas, xiloglucanos, xilanos, mananos, glucanos e Arabinogalactanos. Recentemente o seu uso tem sido estendido para experiências em grande escala de triagem para determinar a abundância relativa de glicanos em uma ampla gama de tipos de tecido da planta e, simultaneamente, 9,10,11.
Apresentamos aqui um microarray-based método de rastreio de glicano chamado Comprehensive Polymer Microarray Profiling (CoMPP) (Figuras 1 & 2) 10,11, que permite múltiplas amostras (100 s) a ser rastreada utilizando uma plataforma de microarray miniaturizado com o reagente reduzida e os volumes de amostra. Os sinais no local de microarray pode ser formalmente quantificadas para dar semi-quantitativas de dados sobre a ocorrência de glicano epítopo. Esta abordagem é bem adequado para o rastreamento de alterações glicano em sistemas biológicos complexos 12 e proporcionando uma visão global da composição da parede celular particularmente quando o conhecimento préviof este não está disponível.
Protocol
1. Coleção de tecidos e Preparação
- Recolher 100 mg de peso fresco de tecidos de planta (um mínimo de 10 mg de peso seco) em pelo menos em triplicado para cada tecido de interesse. Os passos que se seguem descrevem a preparação de material de parede celular a partir de tecidos vegetativos. No caso de tecidos de armazenamento, não-desejado amido é enzimaticamente removida antes de se proceder à extracção de polímeros da parede celular, como descrito anteriormente 13.
- Homogeneizar a amostra até um pó fino com azoto líquido utilizando um Qiagen TissueLyser II, com 24 conjuntos de tubos de adaptador e 3 mm grânulos de carboneto de tungsténio (30 Hz, 2 x 30 s). Em alternativa, se apenas alguns exemplos estão a ser tratados, de um almofariz e pilão é usado.
- Transfira os homogeneizados em 10 ml de plástico tubos cónicos.
- Preparar o material da parede celular, por lavagem dos homogeneizados em 10 ml de etanol a 80% v / v à temperatura ambiente e agitação em vórtex vigorosamente durante 2 min.
- Centrifugue as amostras a 3500 xg e elimine o sobrenadante. Repita o etanol a 70%, pelo menos, lava três vezes ou até que o sobrenadante é claro, em particular para os tecidos que contêm clorofila.
- Realizar uma lavagem final com acetona a 100% e deixar os grânulos contendo os resíduos de álcool insolúvel (AIR) secar ao ar durante a noite.
- Sieve as amostras de ar com uma malha de 0,4 mm 2 para conseguir um pó fino, homogéneo e para remover maior, mal partículas do solo, que por vezes ficam no homogenato.
- Pesar 10 mg de amostra de ar em microtubos contendo, cada um, de 3 mm de contas de vidro para auxiliar a homogeneização das amostras.
2. Extracção de Glicanos parede celular
- Pectinas, e polímeros relacionados com as pectinas são extraídas as amostras pela adição de 500 ul de 50 mM CDTA (pH 7,5) para cada amostra.
- Brevemente os tubos de vórtice para garantir o solvente está em contacto com o material da amostra e, em seguida misturar com o TissueLyser durante 3 horas a 8 Hz.
- Centrifugue as amostras a 12.000 xg, cuidadosamente remover-se os sobrenadantes e armazenar a 4 ° C.
- Lavar peletes em 1 ml de água desionizada para diluir e remover qualquer remanescente de vórtice, solvente e centrifuga-se a 13.000 x g. Repetir esta etapa, sem perturbar o sedimento e remover todo o líquido a partir dos tubos, antes de prosseguir para o passo seguinte.
- Reticulantes glicanos são sequencialmente extraída da parede celular de pellet restante com 500 ul de NaOH 4M com 0,1% w / v NaBH4, usando o mesmo processo descrito nos passos 2,1-2,4 para a extracção CDTA. NaBH4 é adicionada para reduzir o aldeído (ou cetona) grupo na extremidade redutora dos polissacáridos para uma base de álcool impedindo descamação de polissacarídeos.
- Após centrifugação, os sobrenadantes são novamente removidos, armazenados a 4 ° C, e as pelotas lavadas duas vezes em água desionizada antes de se proceder à extracção seguinte.
- Como passo opcional, os polímeros residuais, tais como a celulose são extraídos com 500 uL cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane com 0,78 M CdO), utilizando o mesmo procedimento tal como descrito nos passos 2,1-2,4. Alternativamente, o teor de celulose total em peletes restantes podem ser determinadas usando ensaios acético / nítrico (ver discussão).
3. Microarrays impressão
- Sobrenadantes de centrífuga contendo polímeros extraída da parede celular a 13000 xg para remover qualquer matéria particulada.
- Carregar 50 ul de cada amostra para um polipropileno de 384 poços de placas de microtitulação utilizando uma disposição de pré-concebido costume em que as amostras são organizados de acordo com o tipo de tecido e do tipo de extracção.
- Dilui-se a parede celular da amostra de polímero em um 0, 5 e 25 da série de diluição em série × com água desionizada.
- Parâmetros como altura do pino, coleta e tempo de espera, e de lavagem são definidas no software que controla a microarrayer.
- A humidade da câmara de impressão é controlada em 60% para evitar a evaporação da amostra.
- O trabalho de impressão é iniciado usando LabNEXT software e de um programa, que corresponde ao esquema de microarray.
- O robô utiliza pinos do canal capilar para imprimir as soluções da amostra sobre a placa de 20 x 20 centímetros membrana de nitrocelulose, que é anexada a uma placa plana na máquina. Cada ponto na matriz contém 15 nl de uma solução e é impressa em triplicado.
- Microarrays idênticos são impressas lado a lado sobre a membrana e corte em matrizes individuais, após o trabalho de impressão está completa.
- Em cada experimento, as matrizes podem ser modificados de modo a acomodar mais ou menos amostras, diluições ou repetições.
4. Sondagem de Microarrays glicano
- Após a impressão, bloquear os microarrays individuais em 5% w / v de leite em pó desnatado dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (MPBS) à temperatura ambiente durante 2 horas para reduzir a ligação não específica.
- Microarrays de sonda com anticorpos monoclonais específicos para a célula-parede glicano epítopos durante 2 h em MPBS. A maioria dos Antib monoclonalodies glicanos contra paredes celulares estão comercialmente disponíveis a partir de três empresas; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Serviços ( www.carbosource.net ) e (PlantProbes www.plantprobes.net ).
- Incluir um controlo negativo, um microarray incubadas com MPBS e não apenas o anticorpo primário.
- Lavar os microarrays 3 vezes em tampão fosfato salino (PBS) durante 5 minutos para remover ligação não específica.
- Sondar os microarrays com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) em MPBS durante 2 horas. A maioria dos anticorpos monoclonais contra glicanos da parede celular exigem anti-rato ou anti-ratazana de anticorpos secundários.
- Repita os passos de lavagem 3 vezes com tampão PBS, durante 5 minutos para remover ligação não específica.
- Desenvolver os microarrays utilizando cromogênico (3,3-diaminobenzidina) ou chemiluminecent (luminol) substratos.
5. Quantificação
- Após o desenvolvimento, digitalizar os microarrays individuais usando uma alta resolução (1200 dpi) scanner de desktop e salvar as imagens negativas, como arquivos TIFF de 16 bits (Figura 3).
- Calcular a intensidade integral de cada mancha usando Xplore Software Image Processing (LabNEXT) equipado com uma ferramenta automatizada de grade. A intensidade local integrante é derivado a partir da soma de pixels na área da grelha em torno de cada ponto.
- Os dados de grade para cada microarray é exportado como um arquivo txt e pode ser importado manualmente em uma planilha do Excel para análise. Uma ferramenta online ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) foi desenvolvido para traduzir automaticamente e processar dados de arquivos txt individuais.
- A intensidade de manchas integral é na média entre impressão repetições e diluições para obter um ponto "médiavalor de intensidade "para cada amostra (Figura 2). Alternativamente, os sinais de ponto correspondente a um único valor de diluição em série são utilizados para quantificar a abundância relativa de epítopo de glicano para cada amostra.
- As intensidades relativas local médias entre diferentes amostras são apresentados como um mapa de calor (Figura 4), utilizando ferramentas de formatação condicional no excel ou online heatmapper ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Os dados para cada tipo de anticorpo é corrigida para 100 e um valor de corte de 5% é aplicada para remover o sinal de fundo e falsos positivos.
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Representative Results
A abundância relativa de glicanos em seis tipos de tecidos (filamentos das anteras, pólen, ovários, pétalas, sépalas e estigma) de flores Nicotiana alata foi determinada utilizando CoMPP. A Figura 3A mostra um microarray representativa que foi sondado com mAb específico para JIM5 parcialmente (baixo) homogalaturonano methylesterified (HG), um epitopo que ocorre em polissacarídeos pécticos 14. O epitopo JIM5 é detectada em extractos de CDTA de todos os tecidos florais no entanto é mais alta e mais baixa no pólen de estigma tecido (Figura 3A e 4A). Interessantemente, o epítopo JIM5 também é detectada nos extractos de NaOH em pólen, mas não em outros tecidos (Figura 3A).
Informação quantitativa sobre a ocorrência de um glicano de interesse é obtida através da inclusão de uma série de polissacarídeos purificado como padrões internos no microarray (Figura 3B). Intensidade de manchas Integral de extratos de diferentes t questões sondadas com mAb JIM5 é combinado com os sinais provenientes de um ponto de diluição em série de homogalaturonano (25% de grau de estéril icação de metilo, DE). Em tecido de ovário, de aproximadamente 157 ug de homogalaturonano contendo o epitopo JIM5 estava presente em cada amostra, o que representa cerca de 1,5% (em peso) de resíduos de células totais de parede (Figura 3C). Considerando homogalaturonano 625 mg contendo o epitopo JIM5 estava presente no tecido do pólen, o que representa cerca de 6,25% (em peso) de resíduo total da parede celular.
A abundância relativa de 15 epitopos glicanos encontram-se resumidos como um mapa de calor na Figura 4, onde a intensidade de barras de cor é proporcional à intensidade da mancha ajustada média para cada amostra. A representação gráfica de dados é também ilustrado na Figura 5, e permite-nos rapidamente interpretar as diferenças de glicano ocorrência epítopo entre os tecidos florais diferentes.
ONTEÚDO "> Os nossos resultados indicam que os epítopos individuais glicanos são exclusivamente distribuídas entre tecidos de N. alata flor. Por exemplo, o epitopo LM13 (linearizado (1-5)-α-L-arabinano 15) é o mais abundante na antera filamentos e tecidos sepal em comparação com os outros tecidos (Figura 5D). Este padrão é, em contraste com a de cadeia mais curta (1-5)-α-L-arabinano epítopos preferencialmente detectado pelo mAb LM6 (Figura 5E) 15. glicanos de reticulação também têm distintas padrões de ocorrência de flores. N. alata O epítopo LM10 (pouco substituída (1-4)-β-D-xilana) é abundante no tecido do estigma comparado a outros tecidos, mas está ausente em tecido de ovário (Figura 5G). LM15 xyloglycan epítopos são mais elevadas na pétala e filamento de antera em comparação com outros tecidos (Figura 5H), enquanto que são mais altos em heteromannans filamentos antera (Figura 5J).Figura 1. Um diagrama de fluxo simplificado representando os cinco principais passos da Comprehensive Profiling Polymer Microarray (CoMPP).
Figura 2. Uma ilustração das principais etapas do Global Profiling Polymer Microarray (CoMPP). (A) os tecidos de plantas são recolhidas como três repetições, homogeneizado e lavado em EtOH a 70% e acetona, para fazer os resíduos de álcool insolúveis (AIR). (B) glicanos parede celular são sequencialmente extraídos de amostras de ar com 50 mM de CDTA e 4 M de NaOH. (C) glicanos paredes celulares extraídas são impressas em nitrocelulose usando um robô microarray. Cada amostra é representada em três concentrações e como uma série de quatro réplicas de impressãotes. (D) As matrizes impressas são sondados individualmente com mAbs dirigidos a epitopos de células de parede glicanos. (E) Os sinais à vista são quantificados utilizando microarray software de imagem, exportados como arquivos txt e relativos valores médios de intensidade local são automaticamente calculadas usando uma ferramenta de processamento de dados on-line.
Figura 3. Profiling glicano de tecidos de Nicotiana alata flor. (A) Um microarray representante sondou com anticorpo monoclonal (mAb) JIM5 específico para homogalaturonano (parcialmente metilesterificação, baixo) é indicado como um negativo, arquivo TIFF de 16 bits. (B) A quantidade de polissacárido que contém um epítopo de glicano de interesse pode ser quantificada por meio da impressão de uma série de padrões de polissacárido. (C) intensidade de manchas Integral da amostra de interesse sondado pelo mAbJIM5 é calculada e corresponde a uma curva padrão para estimar a quantidade (ug) de polissacarídeo contendo este epitopo na amostra.
Figura 4. Glicano perfis de tecidos de Nicotiana alata flor representado como um mapa de calor. A intensidade da cor é proporcional ao valor de identidade local médio relativo (barra de escala). Abundância relativa de 15 epitopos de glicano detectados por anticorpos monoclonais (listado na parte superior) foi analisada por seis tipos de tecidos extraídos com CDTA e NaOH (lado esquerdo). Os epítopos glicano se dividem em três grandes classes de polissacarídeos; pectinas, cross-linking glicanos e proteínas arabinogalactanos (AGPS). me, metil-esterif icação; DP, Grau de polimerização; mAb os anticorpos monoclonais; AGP, arabinogalactana-proteína.
Figura 5. Profiling glicano de tecidos de Nicotiana alata flor representada pictoricamente. AL representa a abundância relativa de 12 epitopos de glicano detectadas por mAbs em tecidos florais diferentes. A intensidade da cor é proporcional barra de escala para o valor médio de identidade local relativo, quer derivado a partir de extractos de CDTA ou NaOH ou uma soma de ambos. mim, metil-esterificação; DP, Grau de polimerização; MAB, anticorpos monoclonais;. AGP, arabinogalactana proteína Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
CoMPP é um método rápido e sensível para perfilar a composição de glicano de centenas de plantas derivadas de amostras em uma questão de dias. Este método complementa os já disponíveis bacterianas ou de mamíferos plataformas de matriz de glicano para rastreio de alto rendimento de interacções de hidratos de carbono com glicano de proteínas de ligação, tais como lectinas, receptores e anticorpos 16. Com uma grande diversidade de testes disponíveis para a detecção de glicanos da parede celular, é possível obter informação detalhada sobre epitopos de glicano que pertencem a todas as classes principais de polissacarídeos na parede celular vegetal 8,9. No entanto, estes abrangem apenas uma pequena proporção das estruturas de glicano que foram identificados 8,9, e em algumas circunstâncias, limitar a compreensibilidade das CoMPP. No entanto, esta capacidade foi recentemente alargado através da utilização de módulos de ligação de hidratos de carbono (CBMs) contra glicanos de plantas 17, bem como contra epítopos caracterizados por não-glicosil residues como por exemplo fenóis 18 e 19 resíduos de ácido acético que modificam resíduos glicosilo e desempenham um papel importante na função de glicano.
Embora CoMPP determina os níveis relativos de glicanos em todo um conjunto de amostras, é possível quantificar os níveis de epitopos em extratos sequenciais, comparando o sinal de ligação em que as amostras a das normas conhecidas (Figura 3B e C). Apesar das vantagens de redução de volume da amostra em uma plataforma de microarray-based, a capacidade de quantificar com precisão a ocorrência de glicano pode ser prejudicada por diferenças na morfologia da mancha ou a saturação do sinal de mancha. Estes problemas (bem como os falsos positivos) são evitadas através da optimização da quantidade de volume de material da parede celular versos extractante, antes da análise, e incluindo uma série de repetições e diluições como descrito aqui e em mamíferos métodos de array de glicano 16. Além disso, as diferenças na morfologia da mancha (causadas por difusão de amostrasa taxas diferentes, do ponto de contacto) pode ser superado usando sem contacto por jacto de tinta a tecnologia de microarray 16.
CoMPP é utilizado em associação com os procedimentos estabelecidos para a preparação e isolamento das paredes das células 20. Também pode ser utilizado em paralelo com os actuais métodos bioquímicos, enzimáticos e física para obter mais informação sobre os conteúdos de glicano em amostras de interesse. Por exemplo, em vez de extrair os polímeros celulósicos, os ensaios acético / ácido nítrico 20 pode ser utilizada para quantificar o conteúdo de celulose (mg) remanescente após extracção sequencial de pectina e de ligação cruzada com glicanos CDTA e NaOH. Tratamento com enzimas de microarrays de glicano 21 também pode revelar outras diferenças nas glicano distribuição epítopo entre as amostras, ou para confirmar a especificidade dos epitopos de estruturas detectados no microarray. A determinação da composição de glicano por independentes técnicas analíticas, tais como os que foram recentemente descritos Nós demonstramos que glicanos são distribuídos na forma de um órgão ou tecido específico, em N. flores alata. Esta informação pode dar dicas sobre a função biológica de glicano epitopos ou glicano síntese ou modificação de enzimas presentes nestes diferentes tipos de células. CoMPP tenha fornecido anteriormente visão sobre alterações da parede celular que ocorrem em relação a plantar tipo 22 durante o desenvolvimento 23,24 ou em resposta a mutação 10,25. Em resumo, CoMPP é uma ferramenta valiosa para o. Estudo do papel diverso de glicanos e genes de glicano síntese e modificação da parede celular vegetal
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
IEM gostaria de reconhecer o dinamarquês Research Council (FTP e FNU) para financiamento. ERL reconhece o apoio de uma DP ARC subvenção. AB agradece o apoio do Centro de Excelência em ARC Usina concessão paredes celulares.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
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