Summary
हम एक जीवित भ्रूण zebrafish मस्तिष्क की पारगम्यता के लिए पूरे पशु मात्रात्मक माप का वर्णन. तकनीक न्यूरल ट्यूब लुमेन के भीतर मस्तिष्कमेरु और विभिन्न आणविक भार के तरल पदार्थ अणुओं को बनाए रखने की क्षमता का विश्लेषण करती है और उनके आंदोलन ventricles के बाहर quantifies. इस विधि उपकला और विकास और रोग के दौरान पारगम्यता परिपक्वता में मतभेद के बारे में फैसला लेने के लिए उपयोगी है.
Protocol
1. Microinjection के लिए तैयारी
- केशिका Sutter उपकरणों सुई डांड़ी का उपयोग ट्यूबों खींच कर microinjection सुइयों तैयार.
- फ्लोरोसेंट डाई के साथ लोड microinjection सुई (FITC Dextran).
- Micromanipulator और microinjection तंत्र पर सुई माउंट.
- सावधानी के microinjection सुई तोड़ चौड़ाई में लगभग 2 सुक्ष्ममापी संदंश का उपयोग करने के लिए, लेकिन, इस अपने microinjector स्थापना पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. हमारे microinjection सुइयों के लिए, यह टिप है कि मोड़ नहीं करता है से सुई के पहले क्षेत्र से मेल खाती है.
- तेल में गिरावट के आकार को मापने, इंजेक्शन समय और दबाव समायोजन, ताकि प्रत्येक इंजेक्शन 1 nl बचाता है. उदाहरण के हार्वर्ड उपकरण microinjector के लिए सेटिंग कर रहे हैं: पी शेष = 1.4 साई, = 1.4 साई बाहर पी, पी 0.4-0.7 सेकंड का एक इंजेक्शन समय के साथ = 22.9 साई, पी स्पष्ट = 67.8 साई इंजेक्षन. इन सेटिंग्स का उपयोग हमारे सुई का व्यास लगभग 2 सुक्ष्ममापी है. हालांकि, सेटिंग्स microinjector विशिष्ट हो सकता है, और एक भिन्न होसुई व्यास ccording.
2. भ्रूण की तैयारी
- कोट प्रत्येक हालत के लिए पानी में 1% agarose के साथ 2 व्यंजन, agarose में एक 1-200 μl विंदुक टिप के साथ प्रहार छेद, और agarose प्लग हटा. भ्रूण मीडिया के साथ बर्तन भरें.
- संदंश का प्रयोग, dechorionate भ्रूण कि 18 या एक stereomicroscope के तहत HPF पुराने हैं. भ्रूण Kimmel एट अल के अनुसार बनाया जाता है 11.
- 1 agarose लेपित पकवान में dechorionated भ्रूण स्थानांतरण.
- भ्रूण anesthetize, डिश के लिए tricaine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने जब तक भ्रूण बढ़ रोकने के लिए 12 Westerfield के अनुसार किया.
3. मस्तिष्क ventricles इंजेक्शन
- ओरिएंट भ्रूण ताकि आप अपने पृष्ठीय पक्ष में छेद में भ्रूण की पूंछ डालने से देख रहे हैं. यदि आपके micromanipulator सही पर है, तो भ्रूण कदम इतना है कि अग्रमस्तिष्क छोड़ दिया और सही पश्चमस्तिष्क है.
- वाई में स्थिति सुईपश्चमस्तिष्क वेंट्रिकल की गंतव्य बिंदु.
- पश्चमस्तिष्क वेंट्रिकल की जर्दी (चित्रा 1 ए) में नहीं जाना मस्तिष्क की गहराई के माध्यम से सुनिश्चित किया जा रहा ध्यान बेध छत प्लेट.
- यकीन है कि डाई मस्तिष्क ventricles की पूरी लंबाई भरता बनाने ventricles में 1-2 nl फ्लोरोसेंट रंजक की सुई.
- 2 agarose लिपटे भ्रूण मीडिया के साथ भरा पकवान भ्रूण स्थानांतरण और फिर से anesthetize के रूप में 2.4 में वर्णित है.
- तुरंत इमेजिंग, के रूप में धारा 4 में वर्णित क्रम में एक समय शून्य छवि को पाने के लिए शुरू.
4. इमेजिंग
- ओरिएंट उनकी पूँछ के साथ छेद में भ्रूण के रूप में 3,1 में वर्णित है.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप दोनों प्रेषित और फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ उपयोग करने के लिए एक brightfield पृष्ठीय छवि ले. बढ़ाई अलग भ्रूण की इमेजिंग के बीच निरंतर रखें. यह छवि जम्मू (5.2-6) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन विश्लेषण के प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है.
- भ्रूण, माइक्रोस्कोप, या पकवान हिल के बिना, एक लेइसी फ्लोरोसेंट छवि.
- वांछित समय बिंदुओं पर प्रत्येक भ्रूण के लिए दोहराएँ.
5. डाई आंदोलन की मात्रा
- मर्ज brightfield और फ़ोटोशॉप में फ्लोरोसेंट छवियों के रूप में पहले से Gutzman और निर्णायक 10 के द्वारा वर्णित है.
- दूरी उपाय छवि जम्मू में उपलब्ध सॉफ्टवेयर में डाई सामने चाल http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
- छवि जम्मू और लाइन उपकरण का उपयोग करने के लिए काज बिंदु अग्रमस्तिष्क से एक लाइन के लिए एक 10-20 neuroepithelium से डिग्री कोण (चित्रा 1 ए) के सामने डाई आकर्षित में विलय फ़ाइल खोलें. इस क्षेत्र में चुना गया था क्योंकि यह डाई का पहला और सबसे महत्त्वपूर्ण साइट जंगली प्रकार neuroepithelium के बाहर लीक.
- रेखा की लंबाई की गणना करने के लिए माप उपकरण का चयन करें.
- प्रत्येक समय बिंदु के लिए दोहराएँ.
- डाई सामने अन्य समय अंक से t = 0 पर दूरी subtracting द्वारा समय पर चले गए शुद्ध दूरी की गणना.
- पर प्लॉटग्राफ.
6. प्रतिनिधि परिणाम
एक neuroepithelial पारगम्यता जंगली प्रकार भ्रूण का उपयोग परख में प्राप्त परिणामों के एक उदाहरण 1B डी चित्रा में दिखाया गया है. सही पारगम्यता अंतर है, यह करने के लिए अलग आणविक weightsto के साथ रंगों का परीक्षण एक आकार है कि केवल थोड़ा जंगली प्रकार या नियंत्रण भ्रूण (2 चित्रा) में टपकाया है की पहचान करने के लिए उपयोगी है. यह आनुवंशिक म्यूटेंट या पर्यावरण की स्थिति की पहचान करने के लिए अनुमति देता है कि या तो वृद्धि या कमी पारगम्यता (चित्रा 1D, हरे और लाल लाइनों क्रमशः). 24 HPF zebrafish neuroepithelium के लिए, 70 केडीए FITC Dextran लीक धीरे 2 घंटे से अधिक है, जबकि 2000 केडीए और 10 के लगभग तुरंत केडीए लीक से बाहर नहीं है. इसलिए 70 केडीए आदर्श आणविक वजन के लिए स्थिति है कि दोनों वृद्धि और neuroepithelial पारगम्यता कम की पहचान है.
यदि सुई वेंट्रिकुलर लुमेन, प्रतिदीप्ति w याद करते हैंबीमार टी में मस्तिष्क के बाहर दिखाई 0 = (एक उदाहरण के लिए Gutzman और निर्णायक, 2009 10 देखें). इंजेक्शन डाई के बाद से शुरू में मस्तिष्क के भीतर समाहित नहीं किया गया था और डाई और neuropeithelium की पारगम्यता के आंदोलन के बारे में कोई स्पष्ट निष्कर्ष बनाया जा सकता है इन भ्रूण को खारिज किया जाना चाहिए.
अंत में, यदि भ्रूण छोटे ventricles या संयुक्त राष्ट्र फुलाया मस्तिष्क ventricles, एक नमकीन घोल के साथ ventricles की पूर्व इंजेक्शन फ्लोरोसेंट डाई का इंजेक्शन से पहले किया जा सकता है. यह ventricles के बाद दृश्य आसान बनाने ventricles जब फ्लोरोसेंट डाई के साथ इंजेक्शन फुलाते. उचित नियंत्रण के लिए तय है कि खारा के इंजेक्शन सामान्य न्यूरल ट्यूब के विकास को बाधित करने के लिए किया जाना चाहिए.
चित्रा 1. विभिन्न आणविक भार रंगों के समय पाठ्यक्रम (ए) प्रायोगिक आरेख. पहले, फ्लोरोसेंट डाई ventricles में इंजेक्ट किया जाता है. एक्स = इंजेक्शन के लिए सुई की स्थिति. अगला पृष्ठीय छवियों को समय पर कब्जा कर रहे हैं. अंत में, दूरी अग्रमस्तिष्क काज बिंदु मापा जाता है (एक लाल रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व) से डाई सामने से ले जाया गया है. (BC) brightfield और फ्लोरोसेंट पृष्ठीय छवियों 22 (टी = 0 मिनट, बी) और 24 HPF HPF (टी = 120 मिनट, सी) में विलय कर दिया. व्हाइट लाइन अग्रमस्तिष्क वेंट्रिकल से डाई सामने की दूरी को इंगित करता है. (D) काल्पनिक नमूना पारगम्यता डेटा. ब्लू = जंगली प्रकार या नियंत्रण, लाल की कमी हुई रिश्तेदार पारगम्यता को नियंत्रित करने के लिए वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए रिश्तेदार पारगम्यता के साथ और हरे रंग = नमूना के साथ = नमूना.
चित्रा 2. Neuroepithelial पारगम्यता अलग आणविक वजन रंजक मापन (एई) पृष्ठीय मर्ज किए गए brightfield और = 0 मिनट FITC - घ के साथ इंजेक्शन के बाद टी में 22 HPF जंगली प्रकार भ्रूण फ्लोरोसेंट छवियों10 केडीए (ए), 40 केडीए (बी), 70 केडीए (सी), 500 केडीए (डी) और 2,000 केडीए (ई): निम्न आणविक भार के extran. (A'ई ') के रूप में ही भ्रूण = 24 HPF में 120 मिनट टी में (एई). बाईं करने के लिए पूर्वकाल. F = अग्रमस्तिष्क, एम = मध्यमस्तिष्क, एच = पश्चमस्तिष्क. Asterisk = कान.
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Discussion
हम करने के लिए रहने वाले भ्रूण zebrafish मस्तिष्क के पारगम्यता यों के रूप में एक दिया आणविक वजन के एक इंजेक्शन डाई के लिए निर्धारित करने की क्षमता प्रदर्शित करता है. हमारी अवलोकन है है कि भ्रूण zebrafish neuroepithelium विभिन्न प्रकार से आणविक भार भिन्न रंगों पारगम्य है पता चलता है है कि डाई paracellular पारगम्यता के माध्यम से बढ़ रहा है. हालांकि, हम बाहर मनाया पारगम्यता transcellular योगदान की संभावना से इंकार नहीं कर सकते हैं. इस तकनीक को दोनों और ट्यूब के अंदर बाहर और देखा जा सकता है और लुमेन इंजेक्ट किया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में किसी अन्य ट्यूबलर संरचना करने के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, अन्य अंगों के लिए आदर्श आणविक भार की पहचान के रूप में इस ऊतकों और विकास के चरणों के बीच अलग निर्धारित किया जा सकता है की आवश्यकता होगी.
यह परख उपकला पारगम्यता की भूमिका में लुमेन मुद्रास्फीति और लुमेन आकार के विनियमन के दौरान आगे की जांच पड़ताल के लिए सक्षम हो जाएगा. इसके अलावा, इस तकनीक को वहएल.पी. उपकला जलशीर्ष और पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के रूप में इस तरह के विकारों के साथ जुड़े पारगम्यता में परिवर्तन चिह्नित.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के मानसिक स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय संस्थान, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया. कई उपयोगी चर्चा और रचनात्मक आलोचना, विशेषज्ञ मछली पालन के लिए और ओलिवर Paugois के लिए निर्णायक प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए विशेष धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
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