Et assay for permeabilitet af zebrafisk Embryonic Neuroepithelium

Summary

Vi beskriver en levende hele dyr kvantitativ måling for permeabiliteten af ​​den embryoniske zebrafisk hjernen. Teknikken analyserer evnen til at fastholde cerebrospinalvæske og molekyler med forskellige molekylvægte i de neurale rør lumen og kvantificerer deres bevægelse ud af ventriklerne. Denne metode er nyttig til bestemmelse af forskelle i epitel permeabilitet og modning under udvikling og sygdom.

Abstract

Hjernen ventrikulære system er bevaret blandt hvirveldyr og består af en række indbyrdes forbundne hulrum kaldet hjerneventriklerne, som dannes under de tidligste stadier af hjernens udvikling og vedligeholdes hele dyrets liv. Hjernen ventrikulære system findes i hvirveldyr, og hjertekamrene udvikles efter neuralrøret formation, når den centrale lumen fyldes med cerebrospinalvæske (CSF) ^1,2. CSF er en proteinrig væske, der er vigtig for normal hjernens udvikling og funktion ^3-6.

I zebrafisk, begynder hjerneventriklen inflation på cirka 18 timer efter befrugtning (HPF), efter at neuralrøret er afsluttet. Flere processer er forbundet med hjerneventriklen dannelse, herunder dannelse af en neuroepithelium, tight junction formation, der regulerer permeabiliteten og CSF-produktion. Vi viste, at Na, K-ATPase kræves for hjerneventriklen inflation, der påvirker alle disse proceses ^7,8, mens claudin 5a er nødvendig for tight junction dannelse ^9. Desuden har vi vist, at "afslapning" af den embryoniske neuroepithelium, via inhibering af myosin, er forbundet med hjerneventriklen inflation.

For at undersøge reguleringen af ​​permeabilitet i løbet af zebrafisk hjerneventriklen inflation har vi udviklet en ventrikulær farvestof tilbageholdelse assay. Denne metode anvender hjerneventriklen injektion i en levende zebrafisk embryo, en teknik der tidligere udviklet i vores laboratorium ^10, til fluorescens mærke cerebrospinalvæsken. Embryoner derefter afbildet over tid som det fluorescerende farvestof bevæger sig gennem hjerneventriklerne og neuroepithelium. Afstanden farvefronten bevæger sig væk fra den basale (ikke-luminal) side af neuroepithelium over tid kvantificeres og er et mål for neuroepitelceller permeabilitet (fig. 1). Vi bemærker, at farvestoffer 70 kDa, og mindre vil bevæge sig gennem neuroepithelium og kan være detected udenfor den embryoniske zebrafisk hjernen ved 24 HPF (figur 2).

Dette farvestof retention assay kan anvendes til at analysere neuroepitelceller permeabilitet i en række forskellige genetiske baggrunde, på forskellige tidspunkter under udviklingen, og efter miljømæssige forstyrrelser. Det kan også være nyttige ved behandlingen af ​​patologiske akkumulering af CSF. Samlet set denne teknik gør det muligt for efterforskerne at analysere den rolle og regulering af permeabilitet under udvikling og sygdom.

Protocol

1. Forberedelse til Mikroinjektion

1. Forbered mikroinjektion nåle ved at trække kapillarrør ved hjælp af Sutter instrumenter nål aftrækker.
2. Belastning mikroinjektion nål med fluorescerende farvestof (FITC-dextran).
3. Montere kanylen på mikromanipulator og mikroinjektion apparat.
4. Knæk forsigtigt mikroinjektion nålen med pincet til omkring 2 um i bredden, men dette vil variere afhængig af din microinjector opsætning. For vores mikroinjektion nåle, svarer dette til det første område af nålen fra spidsen, som ikke bøjer.
5. Måle dråbestørrelsen i olie, tilpasning injektion tid og tryk, således at hver injektion giver en nl. Eksempel indstillinger for Harvard Apparatus microinjector er: P balance = 1,4 psi, P ud = 1,4 psi, P injicere = 22,9 psi, P klare = 67,8 psi med en indsprøjtning tid 0,4 til 0,7 sek. Diameteren af ​​vores nål ved hjælp af disse indstillinger er ca 2 um. Imidlertid vil indstillinger være microinjector bestemt, og varierer enccording til nålens diameter.

2. Forberedelse af Embryoner

1. Coat 2 retter med 1% agarose i vand for hver betingelse, stikke huller i agarose med en 1-200 gl pipettespids, og fjern agarose stik. Fyld retter med embryo medier.
2. Brug pincet, dechorionate embryoner, der er 18 HPF eller ældre under et stereomikroskop. Fostre er iscenesat i henhold til Kimmel et al. ^11.
3. Overfør dechorionated embryoner ind først agarose belagt skål.
4. At bedøve embryoner, tilsættes tricaine (0,1 mg / ml) i skålen, indtil embryoner stopper med at bevæge (fremstillet ifølge Westerfield ^12).

3. Injektion hjerneventriklerne

1. Orient embryoer så du kigger på deres dorsalsiden ved at sætte halen af ​​embryonet ind i hullet. Hvis mikromanipulator er til højre, flyt derefter embryonet, således at forhjerne er til venstre og baghjerne til højre.
2. Position nålen på widest punkt af baghjernen ventrikel.
3. Forsigtigt gennembore topplade af baghjernen ventrikel være sikker på ikke at gå gennem dybden af hjernen i blommen (Figur 1A).
4. Injicer 1-2 nl af fluorescensfarvestof i ventriklerne samt, at farvestoffet fylder hele længden af ​​hjerneventriklerne.
5. Overfør embryoner til den anden agarose belagt fad fyldt med embryo medier og re-anesthetize som beskrevet i 2,4.
6. Straks begynde imaging, som beskrevet i afsnit 4 for at få en tid nul image.

4. Imaging

1. Orient embryoer med halen i hullet som beskrevet i 3.1.
2. Brug et dissektionsmikroskop med både transmitterede og fluorescerende lys til at tage et lysfelt dorsal image. Hold forstørrelsen konstant mellem billeddannelse af forskellige embryoer. Dette giver mulighed for direkte sammenligning af analyser udført ved hjælp af billedet J (5,2-6).
3. Uden at flytte embryo, mikroskop eller parabol, tage entilsvarende fluorescerende billede.
4. Gentag for hver embryo ved ønskede tidspunkter.

5. Kvantificering af farvestof Movement

1. Flet brightfield og fluorescerende billeder i Photoshop som tidligere beskrevet af Gutzman og Sive ^10.
2. Mål afstanden farvefronten bevæger sig i billedet J software til rådighed på http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
3. Open fusionerede fil i Image J og bruge linje værktøj til at tegne en linje fra forhjernen hængsel-punkt at farve foran på en 10-20 ° vinkel fra neuroepithelium (figur 1A). Denne region blev valgt, fordi det er den første og mest iøjnefaldende sted af farvestof lækker ud af vildtype neuroepithelium.
4. Vælg måling værktøj til at beregne længde af linien.
5. Gentag for hvert tidspunkt.
6. Beregn nettovægt afstand farvefronten bevægede over tid ved at subtrahere afstand ved t = 0 fra andre tidspunkter.
7. Plot pågrafen.

6. Repræsentative resultater

Et eksempel på resultater opnået i en neuroepitelceller permeabilitet under anvendelse vildtype-embryoer er vist i figur 1B-D. For nøjagtigt skelne permeabilitet, er det nyttigt at teste farvestoffer med forskellig molekylær weightsto identificere en størrelse, der kun er lidt utætte i vildtype eller kontrol embryoner (figur 2). Dette giver mulighed for identifikation af genetiske mutanter eller miljømæssige forhold, der enten stigning eller et fald permeabilitet (Figur 1D, grøn og røde linjer henholdsvis). For 24 HPF zebrafisk neuroepithelium, 70 kDa FITC Dextran lækager langsomt over 2 timer., Mens 2.000 kDa ikke gør, og 10 kDa næsten øjeblikkeligt siver ud Derfor 70 kDa er den ideelle molekylvægt for at identificere forhold, som både øger og reducerer neuroepitelceller permeabilitet.

Hvis nålen misser ventrikulære lumen, fluorescens wsyg vises uden for hjernen ved t = 0 (for eksempel se Gutzman og Sive, 2009 ^10). Disse embryoer kasseres, da det injicerede farvestof ikke blev oprindeligt indeholdt i hjernen og nogen klar konklusion vedrørende bevægelse af farvestoffet og permeabiliteten af ​​neuropeithelium kan foretages.

Endelig, hvis fostre har små ventrikler eller ikke-oppustede hjerneventriklerne, før injektion af ventrikler med en saltvandsopløsning kan udføres før injektion af det fluorescerende farvestof. Det puster hjertekamrene gør efterfølgende visualisering af hjertekamrene lettere, når indsprøjtning med det fluorescerende farvestof. Ordentlig kontrol skal udføres for at afgøre, om injektion af saltvand forstyrrer normal neuralrøret udvikling.

Figur 1. Tidsforløbet for forskellige molekylvægt farvestoffer. (A) Eksperimentel diagram. Første, Er fluorescerende farvestof injiceres ind i ventriklerne. X = position injektionskanyle. Næste dorsale billeder er taget over tid. Endelig er afstanden bevæges af farvefronten fra forhjernen hængsel-punkt måles (ved en rød linje). (BC) flettet lysfelt og fluorescerende dorsale billeder ved 22 HPF (t = 0 min, B) og 24 HPF (t = 120 min, C). Hvide streg angiver afstand farvefronten fra forhjerne ventrikel. (D) Hypotetiske prøve permeabilitet data. Blå = vildtype eller kontroller, rød = prøve med nedsat permeabilitet i forhold til kontrol, og grøn = prøve med øget permeabilitet i forhold til kontrol.

Figur 2. Måling af neuroepitelceller permeabilitet for forskellige molekylvægt farvestoffer. (AE) Dorsal fusionerede lysfelt og fluorescerende billeder af 22 HPF vildtype embryoer ved t = 0 min efter injektion med FITC-dExtran af følgende molekylvægte: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) og 2.000 kDa (E). (A'-E ') Samme embryo som i (AE) ved t = 120 min ved 24 HPF. Anterior til venstre. F = forhjerne, M = midthjernen, H = baghjernen. Asterisk = øre.

Discussion

Vi demonstrerer evnen til at kvantificere permeabiliteten af ​​den levende embryonale zebrafisk hjerne som bestemt for et injicerbart farvestof af en given molekylvægt. Vores observation, at det embryoniske zebrafisk neuroepithelium er differentielt gennemtrængeligt for farvestoffer med forskellige molekylvægte tyder på, at farvestoffet bevæger sig via paracellulær permeabilitet. Men vi kan ikke udelukke muligheden af ​​en transcellulær bidrag til den observerede permeabilitet. Denne teknik kan anvendes på enhver anden rørformede struktur, så længe både indersiden og ydersiden af ​​røret kan ses og lumen kan injiceres. Imidlertid vil identificere det ideelle molekylvægt for andre organer er nødvendigt at fastlægge da dette kan variere mellem væv og udviklingstrin.

Denne analyse vil give yderligere undersøgelse ind i rollen som epithelial permeabilitet under lumen inflation og regulering af lumen størrelse. Desuden vil denne teknik hanlp karakterisere ændringer i epitel-permeabilitet er forbundet med lidelser, såsom hydrocephalus og polycystisk nyresygdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Tricaine powder	Sigma	A5040
Capillary Tubes	FHC Inc.	30-30-1