Summary
אנו מתארים מדידת חיה כל חיה כמוני לחדירות של מוח דג הזברה העוברי. הטכניקה מנתחת את היכולת לשמור על נוזל השדרתי ומולקולות של משקולות מולקולריות שונות בתוך חלל הצינור העצבי, והוא מכמת את תנועתם מחוץ לחדרי לב. שיטה זו יעילה לקביעת הבדלים בחדירות וההתבגרות אפיתל במהלך פיתוח ומחלה.
Abstract
מערכת חדרית המוח נשמרת בין חוליות והוא מורכב מסדרה של חללים המחוברים ביניהם בשם חדרים במוח, שיוצר בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות מוח ונשמרים לאורך חייו של בעל החיים. מערכת חדרית המוח נמצאת בבעלי חוליות, ואת החדרים להתפתח לאחר היווצרות צינור עצבית, כאשר החלל המרכזי מתמלא בנוזל שדרה (CSF) 1,2. CSF הוא נוזל עשיר בחלבון שהוא חיוני להתפתחות תקינה של מוח ותפקוד 3-6.
בדג הזברה, אינפלצית חלל המוח מתחילה בכ 18 הפרית הודעה לשעה (hpf), לאחר שהצינור העצבי סגור. תהליכים מרובים קשורים בהיווצרות חלל מוח, כולל היווצרות neuroepithelium, היווצרות צומת הדוקה המווסתת את החדירות וייצור CSF. אנחנו הראינו כי Na, K-ATPase נדרש לאינפלצית חלל המוח, משפיעים כל התהליך אלהes 7,8, ואילו 5a claudin הוא הכרחי להיווצרות צומת הדוקה 9. בנוסף, הראה כי "רגיעה" של neuroepithelium העוברי, באמצעות עיכוב של שרירן, קשור באינפלצית חלל מוח.
כדי לחקור את הרגולציה של חדירות במהלך אינפלצית חלל מוח דג זברה, שפתחנו assay שמירת צבע חדרית. שיטה זו משתמשת בהזרקת חלל מוח בעובר דג זברת חיה, טכניקה שפותחה בעבר במעבדה שלנו 10, fluorescently לתייג את הנוזל השדרתי. עוברים ואז הם צלמו לאורך זמן את מהלכי צבע הניאון דרך החדרים במוח וneuroepithelium. המרחק מול הצבע מתרחק מהצד הבסיסי (שאינו luminal) של neuroepithelium לאורך הזמן הוא לכמת והוא מדידת חדירות neuroepithelial (איור 1). אנו צופים שבצבעים 70 KDA וקטן יעברו דרך neuroepithelium ויכולים להיות detecteד מחוץ למוח העוברי דג הזברה ב 24 hpf (איור 2).
assay שמירת צבע זה יכול לשמש כדי לנתח חדירות neuroepithelial במגוון רחב של רקע גנטי שונה, בזמנים שונים במהלך פיתוח, ולאחר הפרעות סביבתיות. זה יכול להיות שימושי גם בבדיקה פתולוגית של הצטברות CSF. באופן כללי, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לנתח את התפקיד והרגולציה של חדירות במהלך פיתוח ומחלה.
Protocol
1. הכנה לmicroinjection
- הכן את מחטי microinjection ידי משייכת צינורות נימים באמצעות חולץ מחט מכשירי סאטר.
- מחט עומס microinjection עם צבע זרחני (FITC-dextran).
- הר מחט על micromanipulator ומכשירי microinjection.
- לשבור מחט microinjection זהירות בעזרת מלקחיים לבערך 2 מיקרומטר ברוחב, לעומת זאת, זה משתנה בהתאם להגדרת microinjector. למחטי microinjection, זה מקביל לאזור 1 של המחט מהקצה שלא מתכופף.
- למדוד את גודל ירידה בנפט, התאמת זמן הזרקה ולחץ, כך שכל זריקה מספקת 1 nl. הגדרות דוגמה לרווארד Apparatus microinjector הם: איזון P = 1.4 psi, P = יצא 1.4 psi, P = 22.9 psi להזריק, P = 67.8 psi הברור עם זמן הזרקה של 0.4-0.7 שניות. הקוטר של המחט שלנו תוך שימוש בהגדרות אלה הוא בערך 2 מיקרומטר. עם זאת, הגדרות תהיינה microinjector ספציפית, ולהשתנותccording למחט הקוטר.
2. הכנת העוברים
- מעייל 2 מנות עם 1% agarose במים לכל מצב, חורים להציץ לתוך agarose עם קצה פיפטה 1-200 μl, ולהסיר תקעי agarose. מלא מנות עם תקשורת עובר.
- מלקחי שימוש בעוברים, dechorionate ש18 hpf או מבוגר תחת stereomicroscope. עוברים מבוימים פי קימל et al. 11.
- העברת עוברי dechorionated לצלחת מצופית 1 agarose.
- להרדים עוברים, להוסיף tricaine (0.1 מ"ג / מ"ל) למנה עד עוברים מפסיקים לנוע (שנעשה על פי 12 Westerfield).
3. הזרקת החדרים במוח
- עוברי אוריינט אז אתה מסתכלים על צד הגב שלהם על ידי הצבת את הזנב של העובר לתוך החור. אם micromanipulator הוא בצד ימין, ולאחר מכן להעביר את העובר כך שהמוח הקדמי הוא לשמאל ולמוח האחורי בצד ימין.
- מחט בעמדת wiנקודת dest של חלל המוח אחורי.
- זהירות צלחת גג לנקב של חלל המוח האחורי להיות בטוח שלא לעבור את עומק המוח בחלמון (איור 1 א).
- להזריק 1-2 nl של צבע פלואורסצנטי אל חדרי הלב מוודאים צבע ממלא את כל האורך של חדרי המוח.
- העברת עוברים לצלחת המצופית agarose השנייה, מלאת תקשורת עובר ולהרדים מחדש כפי שמתואר ב2.4.
- מייד להתחיל הדמיה, כאמורה בסעיף 4 על מנת לקבל תמונת זמן אפס.
4. הדמיה
- עוברי אוריינט עם הזנב בחור כמתואר בסעיף 3.1.
- השתמש במיקרוסקופ לנתח עם אור ניאון וגם משודר לקחת תמונה הגבה brightfield. שמור את ההגדלה מתמדת בין ההדמיה של עוברים שונים. זה מאפשר השוואה ישירה של ניתוחים שבוצעו באמצעות התמונה J (5.2-6).
- מבלי להזיז את העובר, מיקרוסקופ או צלחת, לוקחתמונת ניאון מקבילה.
- חזור עבור כל עובר בנקודתי זמן רצוי.
5. כימות של תנועת דיי
- מיזוג brightfield ותמונות ניאון בפוטושופ כפי שתואר בעבר על ידי Gutzman וסייב 10.
- מדוד את מרחק המהלכים הקדמיים לצבוע בתוכנת J תמונה זמינה בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/.
- קובץ ממוזג פתוח בJ תמונה ולהשתמש בכלי קו למתוח קו מנקודת ציר המוח הקדמי לצבוע את החזית בזווית 10-20 מעלות מneuroepithelium (איור 1 א). אזור זה נבחר משום שהוא האתר הראשון והבולט ביותר של צבע דולף neuroepithelium הסוג הפראי.
- בחר כלי מדידה לחישוב אורכו של קו.
- חזור על הפעולה עבור כל פעם נקודה.
- לחשב את מרחק נטו מול הצבע עבר לאורך זמן על ידי הפחתה במרחק t = 0 מנקודתי זמן אחרות.
- עלילה עלגרף.
6. נציג תוצאות
דוגמה לתוצאות המתקבלות בבדיקת חדירות neuroepithelial שימוש בעוברים בסוג בר מוצגת באיור 1 ב-D. מדויק כדי להבדיל חדירות, כדאי לבדוק עם צבעים weightsto המולקולרי שונה לזהות שגודל הוא רק מעט דולף בסוג בר או עוברי ביקורת (איור 2). זה מאפשר זיהוי של מוטציות גנטיות או תנאים סביבתיים שגם עלייה או ירידת חדירות (1D איור, ירוק וקווים אדומים בהתאמה). לneuroepithelium 24 hpf דג הזברה, 70 kDa הדלפות FITC dextran לאט במשך 2 שעות, ואילו 2,000 kDa אין ו10 kDa כמעט מייד דולף החוצה. לכן 70 kDa הוא המשקל המולקולרי האידיאלי כדי לזהות מצבים שגם עלייה וירידת חדירות neuroepithelial.
אם המחט מתגעגעת לום חדרית, פלואורסצנציה wחולה מופיע מחוץ למוח בזמן t = 0 (לדוגמה ראה Gutzman וסייב, 2009 10). העוברים האלה אמורים להיות מושלכים מאז לצבוע הזריקו לא הכילו בתחילה בתוך המוח ואין מסקנה ברורה לגבי תנועה של הצבע והחדירות של neuropeithelium יכולה להתבצע.
לבסוף, אם יש עוברים חללים קטנים או חדרים במוח בלתי מנופחים, לפני הזרקה של חדרי מוח עם תמיסת מלח אפשר לעשות לפני הזריקה של צבע פלואורסצנטי. זה מנפח את החדרים שהופכים לאחר מכן להדמיה של חדרים קלים יותר כאשר הזרקה עם צבע פלואורסצנטי. בקרות נאותות חייבות להתבצע כדי לקבוע אם הזרקה של מי מלח משבשת התפתחות צינור עצבית נורמלית.
איור 1. כמובן זמן של צבעי משקל מולקולריים שונים. () תרשים ניסויי. ראשון, צבע פלואורסצנטי מוזרק לתוך חדרי הלב. X = מיקום של מחט להזרקה. תמונות גב באות נלכדות לאורך זמן. לבסוף, המרחק התרגש מול הצבע מהמוח הקדמי ציר נקודה נמדדה (מיוצג ע"י קו אדום). (BC) Merged brightfield ותמונות גב ניאון ב22 hpf (t = 0 דקות, B) ו24 hpf (t = 120 דקות, ג). לבן קו מציין מרחק של חזית הצבע מהמוח הקדמי חדר לב. (ד) נתוני חדירות מדגם היפותטיים. כחול = סוג בר או פקדים, אדום = דגימה עם חדירות ירדו יחסית לשליטה, ו= מדגם ירוק עם חדירות יחסית לשליטה מוגברת.
איור 2. מדידה של חדירות לצבע neuroepithelial משקל מולקולרי שונה. (AE) brightfield ממוזג הגבה ותמונות ניאון של 22 עוברי סוג בר hpf בt = 0 דקות לאחר הזרקה עם FITC-dextran של המשקלים המולקולריים הבאים: 10 KDA (A), 40 KDA (ב '), 70 KDA (C), 500 KDA (ד') וכ -2,000 KDA (E). עובר (A'-E ') בדיוק כמו ב( AE) בt = 120 דקות ב 24 hpf. קדמי לשמאל. F = מוח קדמי, מ = מוח תיכון, H = מוח אחורי. אסטריסק = אוזן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו מדגימים את היכולת לכמת חדירות של המוח העוברי דג זברת החיים כפי שנקבע לצבע מוזרק של משקל מולקולרי נתון. התצפית שלנו שneuroepithelium דג הזברה העוברית הוא דיפרנציאלי חדיר לצבעים שונים של משקולות מולקולריות מצביעה שהצבע עובר דרך חדירות paracellular. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות של תרומת transcellular לחדירות הנצפות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל מבנה צינורי אחר, כל עוד הן בתוך ומחוץ לצינור שניתן לראות ולומן יהיה ניתן להזריק. עם זאת, זיהוי של המשקל המולקולרי האידיאלי לאיברים אחרים יצטרך להיקבע כזה יכול להיות שונה בין רקמות ושלבי התפתחות.
בדיקה זו תאפשר חקירה נוספת לתוך התפקיד של חדירות האפיתל באינפלצית לום והרגולציה של גודל החלל. בנוסף, טכניקה זו תהיה הואlp לאפיין שינויים בחדירות האפיתל קשורות להפרעות כגון הידרוצפלוס ומחלת כליות פוליציסטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש, והקרן הלאומית למדע. תודה מיוחדת לחברי מעבדת סייב לדיונים רבים שימושיים וביקורת בונה, ולאוליבייה Paugois לגידול בעלי דגי מומחה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
