En Assay for permeabilitet av Sebrafisk Embryonic Neuroepithelium

Summary

Vi beskriver en levende hel dyr kvantitativ måling for permeabilitet i embryonale sebrafisk hjernen. Teknikken analyserer evnen til å beholde cerebrospinalvæsken og molekyler av forskjellige molekylvekter innenfor nevralrøret lumen og kvantifiserer deres bevegelse ut av ventriklene. Denne metoden er nyttig for å bestemme forskjeller i epithelial permeabilitet og modning under utvikling og sykdom.

Abstract

Hjernen ventrikulære systemet er konservert blant virveldyr og er sammensatt av en serie av sammenkoblede hulrom kalt hjernen ventriklene, som danner under de tidligste stadiene av utvikling av hjernen og vedlikeholdes gjennom dyrets liv. Hjernen ventrikulære systemet finnes i virveldyr og ventriklene utvikler etter nevralrøret formasjon, når det sentrale lumen fylles med cerebrospinalvæsken (CSF) ^1,2. CSF er en proteinrik væske som er viktig for normal utvikling av hjernen og funksjon ^3-6.

I sebrafisk, begynner hjernen ventrikkel inflasjon på ca 18 timer etter befruktning (HPF), etter at nevralrøret er lukket. Flere prosesser er forbundet med hjernen ventrikkel formasjonen, inkludert dannelsen av et neuroepithelium, stramt veikryss formasjon som regulerer permeabilitet og CSF produksjon. Vi viste at Na, er K-ATPase kreves for hjernen ventrikkel inflasjon, påvirker alle disse prosess^7,8 es, mens claudin 5a er nødvendig for tett junction dannelse ^9. I tillegg viste vi at "velvære" av embryonale neuroepithelium, via hemming av myosin, er assosiert med hjernen ventrikkel inflasjon.

For å undersøke regulering av permeabilitet under sebrafisk hjernen ventrikkel inflasjon, har vi utviklet en ventrikulær fargestoff oppbevaring analysen. Denne metoden bruker hjernen ventrikkel injeksjon i en levende sebrafisk embryo, en teknikk tidligere utviklet i vår lab ^10, til fluorescently merke cerebrospinalvæsken. Embryoer blir deretter avbildet over tid som fluorescerende fargestoff beveger seg gjennom hjernen ventriklene og neuroepithelium. Avstanden fargestoff fronten beveger seg bort fra den basale (non-luminal) siden av neuroepithelium over tid er kvantifisert og er et mål på neuroepithelial permeabilitet (Figur 1). Vi observerer at fargestoffer 70 kDa og mindre vil bevege seg gjennom neuroepithelium og kan være detected utenfor embryonale sebrafisk hjernen ved 24 HPF (Figur 2).

Dette fargestoff retensjon Målingen kan brukes til å analysere neuroepithelial permeabilitet i en rekke forskjellige genetiske bakgrunner, til forskjellige tider i løpet av utviklingen, og etter miljømessige perturbasjoner. Det kan også være nyttig i å undersøke patologisk akkumulering av CSF. Totalt sett gir denne teknikken etterforskerne å analysere hvilken rolle og regulering av permeabilitet under utvikling og sykdom.

Protocol

1. Forberedelse til mikroinjeksjon

1. Forbered mikroinjeksjon nåler ved å trekke kapillarrør ved hjelp Sutter instrumenter nål avtrekker.
2. Last mikroinjeksjon nål med fluorescerende fargestoff (FITC-Dextran).
3. Monter nålen på micromanipulator og mikroinjeksjon apparat.
4. Knekk forsiktig mikroinjeksjon nålen med pinsett til om lag 2 mikrometer i bredden, men dette vil variere avhengig av din microinjector oppsett. For våre mikroinjeksjon nåler, svarer dette til den første regionen av nålen fra spissen som ikke bøyer.
5. Måle dråpestørrelsen i olje, justere innsprøytningstid og trykk, slik at hver injeksjon leverer en nl. Eksempel innstillinger for Harvard Apparatus microinjector er: P balanse = 1,4 psi, P ut = 1,4 psi, P injisere = 22,9 psi, P klare = 67,8 psi med en injeksjon tid 0.4-0.7 sek. Diameteren på nål vår med disse innstillingene er omtrent 2 pm. Imidlertid vil innstillingene bli microinjector spesifikk, og varierer enccording til p diameter.

2. Forberede Embryoer

1. Coat 2 retter med 1% agarose i vann for hver tilstand, pirke hull i agarose med en 1-200 ul pipettespiss, og fjern agarose plugger. Fyll retter med embryo media.
2. Bruke tang, dechorionate embryoer som er 18 HPF eller eldre under en stereomikroskop. Embryoer er iscenesatt i henhold til Kimmel et al. ^11.
3. Overfør dechorionated embryoer inn i første agarose belagt parabolen.
4. Å anesthetize embryoer, legg Tricaine (0,1 mg / ml) til parabolantennen inntil embryoer lenger beveger (laget ifølge Westerfield ^12).

3. Injisering hjernen ventriklene

1. Orientere embryo så du ser på deres dorsal side ved å sette halen av embryoet inn i hullet. Hvis micromanipulator er på høyre side, og flytt deretter embryo slik at forebrain er til venstre og hindbrain til høyre.
2. Stilling nål på widest punkt hindbrain ventrikkel.
3. Nøye pierce tak plate av hindbrain hjertekammer blir sikker på ikke å gå gjennom dybden av hjernen til eggeplomme (figur 1A).
4. Injisere 1-2 nl av fluorescerende fargestoff inn i ventriklene og sørger for at fargestoff fyller hele lengden av hjernen ventriklene.
5. Overfør embryoene andre agarose belagt parabolen fylt med embryo medier og re-anesthetize som beskrevet i 2.4.
6. Umiddelbart begynne avbildning, som beskrevet i seksjon 4 for å få en tid null bilde.

4. Imaging

1. Orientere embryoer med halen sin i hullet som beskrevet i 3.1.
2. Bruk en disseksjonsmikroskop med både overført og fluorescerende lys til å ta en lysfelt dorsal bilde. Hold forstørrelse konstant mellom avbildning av ulike embryoer. Dette gir mulighet for direkte sammenligning av analyser utført ved hjelp av Image J (5,2 til 6).
3. Uten å flytte embryo, mikroskop eller parabol, ta entilsvarende fluorescerende bilde.
4. Gjenta for hver embryo på ønskede tidspunkter.

5. Kvantifisering av Dye Movement

1. Flett lysfelt og fluorescerende bilder i Photoshop som tidligere beskrevet av Gutzman og Sive ^10.
2. Mål avstanden fargestoffet foran beveger seg i Bilde J programvare tilgjengelig på http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
3. Åpne sammenslåtte filen i Image J og bruke linjen til å tegne en linje fra forebrain hengsel-punkt å farge foran på en 10-20 ° vinkel fra neuroepithelium (figur 1A). Denne regionen ble valgt fordi det er den første og mest merkbare området av fargestoff lekker ut av villtype neuroepithelium.
4. Velg måleverktøy for å beregne lengden på linjen.
5. Gjenta for hver gang-punkt.
6. Beregn netto avstand fargestoff foran flyttet over tid ved å trekke avstand ved t = 0 fra andre tidspunkter.
7. Tomt pågraf.

6. Representant Resultater

Et eksempel på resultatene oppnådd i en neuroepithelial permeabilitet ved anvendelse villtype embryoer er vist i Figur 1B-D. Å nøyaktig skille permeabilitet, er det nyttig å teste fargestoffer med annen molekylær weightsto identifisere en størrelse som bare er litt lekk i villtype eller kontroll embryoer (figur 2). Dette gjør det mulig for identifisering av genetiske mutanter eller miljøforhold som enten økning eller reduksjon permeabilitet (figur 1D, grønne og røde linjer henholdsvis). For 24 HPF sebrafisk neuroepithelium, 70 kDa FITC Dextran lekkasjer sakte over 2 timer, mens 2000 kDa ikke og 10 kDa nesten umiddelbart lekker ut. Derfor 70 kDa er den ideelle molekylvekt å identifisere forhold som både øke og redusere neuroepithelial permeabilitet.

Hvis nålen savner den ventrikulære lumen, fluorescens will vises utenfor hjernen ved t = 0 (for eksempel se Gutzman og Sive, 2009 ^10). Disse embryoer bør kasseres siden injisert fargestoff ikke ble opprinnelig inneholdt i hjernen og ingen klar konklusjon vedrørende bevegelse av fargestoff og permeabilitet av neuropeithelium kan gjøres.

Til slutt, hvis embryoer har små ventriklene eller un-oppblåste hjernen ventriklene, pre-injeksjon av ventriklene med en saltoppløsning kan gjøres før injeksjon av det fluorescerende fargestoff. Dette utløses ventriklene gjør påfølgende visualisering av ventriklene enklere når injisere med fluorescerende fargestoff. Forsvarlig kontroll må utføres for å finne ut om injeksjon av saltvann forstyrrer normal nevralrøret utvikling.

Figur 1. Tidsforløpet for forskjellige molekylvekt fargestoffer. (A) Eksperimentell Diagram. Første, Er fluorescerende fargestoff injiseres inn i ventriklene. X = posisjon nål for injeksjon. Neste dorsal bildene er tatt over tid. Endelig flyttet avstanden av fargestoffet fronten fra forebrain hengsel-punktet måles (representert ved en rød linje). (BC) Fusjonert lysfelt og fluorescerende dorsal bilder ved 22 HPF (t = 0 min, B) og 24 HPF (t = 120 min, C). Hvit linje indikerer avstanden av fargestoff foran fra forhjernen ventrikkel. (D) Hypotetiske eksempeldata permeabilitet data. Blå = villtype eller kontroller, rød = prøven med redusert permeabilitet i forhold til kontroll, og grønn = prøven med økt permeabilitet i forhold til å kontrollere.

Figur 2. Måling av neuroepithelial permeabilitet til forskjellige molekylvekt fargestoffer. (AE) Dorsal fusjonerte lysfelt og fluorescerende bilder av 22 HPF villtype embryoer på t = 0 min etter injeksjon med FITC-dExtran av følgende molekylvekter: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) og 2000 kDa (E). (A'-E ') Samme embryo som i (AE) ved t = 120 min ved 24 HPF. Anterior mot venstre. F = forhjernen, M = midthjernen, H = hindbrain. Asterisk = øre.

Discussion

Vi demonstrerer evnen til å kvantifisere permeabilitet av den levende embryonale sebrafisk hjernen som bestemmes for en injisert fargestoff av en gitt molekylvekt. Vår observasjon at embryonale sebrafisk neuroepithelium er forskjellig gjennomtrengelig for fargestoffer av ulike molekylære vekter tyder på at fargestoffet beveger via paracellular permeabilitet. Men vi kan ikke utelukke muligheten for en transcellular bidrag til den observerte permeabilitet. Denne teknikken kan brukes til enhver annen rørformet struktur så lenge både innsiden og utsiden av røret kan sees og lumen kan injiseres. Imidlertid vil identifikasjon av den ideelle molekylvekt for andre organer må være bestemt, da dette kan variere mellom vev og utviklingsstadier.

Denne analysen vil gjøre videre etterforskning i rollen som epithelial permeabilitet under lumen inflasjon og regulering av lumen størrelse. I tillegg har denne teknikken vil hanlp karakterisere endringer i epithelial permeabilitet assosiert med lidelser som hydrocephalus og polycystisk nyresykdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Tricaine powder	Sigma	A5040
Capillary Tubes	FHC Inc.	30-30-1