Summary
Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) toplamak ve embriyonik zebrafish beynin ventriküler sistemde BOS yoksun bir sistem oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu embriyonik beyin gelişimi sırasında BOS kompozisyonu ve onun ihtiyacının daha fazla inceleme için izin verir.
Abstract
Beyin omurilik sıvısı (BOS) beyin ventriküller içinde bulunan bir protein açısından zengin bir sıvıdır. Erken omurgalı embriyonik gelişim sırasında mevcuttur ve yaşam boyu devam eder. Yetişkin BOS, beyin yastık atık kaldırmak ve salgılanan moleküller 1,2 taşımak için düşünülmektedir. Yetişkin ve yaşlı embriyoda BOS çoğunluğu koroid pleksus, beyin ventriküller 3-5 bitişiğindedir çok kanlanan sekretuar bölgelerinde bir dizi yapılır. Zebra balığı olarak, koroid pleksus tam 144 saat sonrası fertilizasyon (HPF) 6 oluşur. Bundan önce, fare embriyonik BOS (eCSF) önemli bir kısmını içeren zebrafish ve diğer ikisi de omurgalı embriyolarının mevcuttur. Piliç Bu veriler ve çalışmalar nöroepitelyumda gelişiminde erken sekretuar ve öncesi koroid pleksus gelişimi 7 eCSF en önemli kaynağı olabileceğini düşündürmektedir.
eCSF yaklaşık üç kat daha fazla protein içerir tkalkınma 8,9 sırasında önemli bir rol oynayabileceğini han yetişkin BOS, düşündüren. Civciv ve fare yapılan çalışmalar eCSF, sıvı basınç, ya da bunların bir kombinasyonu olarak salgılanan faktörler epitele 10-20 nöron, gen ekspresyonu, hücre çoğalması ve hücre hayatta kalma için önemli olduğunu ortaya koymaktadır. Insan, sıçan, fare ve civciv eCSF proteinle ilgili analizler BOS fonksiyonu için gerekli olabilecek birçok protein belirledik. Bu hücre ölümü ve çoğalma 21-24 dahil hücre dışı matris bileşenleri, apolipoproteinler, ozmotik basıncı düzenleyen proteinleri, ve proteinleri içerir. Ancak, eCSF karmaşık işlevleri büyük ölçüde bilinmemektedir.
Dolayısıyla eCSF bileşenlerin tanımlanması ve geliştirilmesi sırasında eCSF ihtiyaç analizi için izin zebrafish beyin ventriküllerden eCSF uzaklaştırılması için bir yöntem geliştirmiştir. Daha eCSF diğer omurgalı sistemleri w tahsil edilebilmesine rağmenITH büyük embriyolar, eCSF zebrafish gelişiminin erken aşamalarında toplanan ve anormal beyin ventrikül hacim veya morfolojisi neden genetik veya çevresel koşullar altında yapılabilir. ECSF çıkarılması ve toplama tahlil etmek ventriküllerin içine belirli faktörler kütle spektrometrik analizi, eCSF fonksiyonu araştırmalar, yeniden yerleştirilmesi ve bunların fonksiyonları için olanak sağlar. Böylece erken zebrafish embriyo erişilebilirlik gelişimi sırasında eCSF fonksiyonunun ayrıntılı analizi için izin verir.
Protocol
1. Mikroenjeksiyon İğneleri ve Hücre Tramvay hazırlanması
- Üreticinin talimatlarına göre mineral yağ ile Eppendorf CellTram petrol mikroenjektör aparatı doldurun.
- Sutter araçlar iğne çektirmenin kullanarak kılcal tüpler çekerek mikroenjeksiyon iğneler hazırlayın.
- Eppendorf CellTram bağlı mikromanipülatör üzerine iğne takın.
- Dikkatlice iğne ucu bölünürler. Üniform uç boyutu için, bir mikrometre ile ölçümü veya referans iğne karşılaştırın.
- Kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, uzunluğu aşağı petrol itmek CellTram kullanarak, yağ ile iğnenin uzunluğu doldurun.
2. Embriyolar hazırlanması
- Bir 1-200 ul pipet ile% 1 agaroz kaplı çanak delikleri Poke ve agaroz tıpaları çıkarın. Embriyo medya (Westerfield 25'e göre yapılan) ile çanak doldurun.
- Stereomikroskop altında forseps, dechorionate embriyolar kullanma.
- Dechorionated embriyolar transferAgaroz kaplı çanak içine.
- Embriyolar (Westerfield 25'e göre yapılan) hareket durdurana kadar embriyo uyutmak için, agaroz çanak Tricaine (0.1 mg / ml) ekleyin.
3. ECSF boşaltılması
- Agaroz ve mikromanipülatör yakın kendi arka tarafın delikleri kendi kuyrukları ile Orient embriyolar, beynin dorsal yüzü görselleştirme için izin.
- Rhombomere 0/1 menteşe noktası veya arka beyin ventrikülü (Şekil 1A) en geniş noktada iğne yerleştirin.
- Sarısı içine beynin derinliği boyunca gitmek emin olmak arka beyin ventrikül dikkatlice pierce tavan plakası.
- CellTram kullanarak eCSF boşaltın ve mikroenjeksiyon iğne sıvı toplamak. Herhangi bir hücre önlemek için dikkatli olun.
4. Kompozisyon Analiz eCSF Toplama
- ECSF iğne içinde toplandıktan sonra, CellTram emme dikkatli bir şekilde durmaktadır.
- Moiğnenin altından çanak ettik ve dikkatlice istenilen tampon içeren bir tüp içine iğne yerleştirin.
- CellTram kullanarak, yağ ile çözüm kontamine olmasını önlemek için çalışıyoruz tampon içine iğne eCSF boşaltın.
- 10,000 x g'de eCSF, spin eCSF birlikte aspire olduğunu hücreleri çıkarmak için. Toplamak daha fazla analiz için -80 eCSF (süpernatant) ve mağaza ° C kadar hazır kirlenmemiş.
5. Seçilen Faktörler reintroduction
- Sıvı o süre içinde doldurulan olduğundan, istenen zaman aralığı boyunca eCSF her 2 saat boşaltın. Sıcaklık drenaj zaman noktalarında Arasında, iğne kaldırmak ve 28.5 ° C'de embriyolar saklamak veya arzu.
- Test faktörü ikinci mikropipet iğne yerleştirin.
- Mikromanipülatör içine yerleştirin iğne mikroenjektör bağlı.
- Petrol ve ayarlama enjeksiyon zamanı ve p damla boyutu ölçerek 1 nl enjeksiyon seviyesini ayarlamaressure.
- Daha önce 26 açıklandığı beyin ventriküller içine 1-2 nl enjekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir süzülmüş beyin ventrikül bir örneği Şekil 1B-C 'de gösterilmiştir. Onlar eCSF (Şekil 1B vs C) yoksun olarak beyin ventriküller yıkılmıştır. Olarak dorsal görüntüleri (Şekil 1B-C ve Şekil 2A-B) arka beyin nöroepitelyumda karakteristik morfolojisi korumak yapar ve sağlam menteşe noktaları olasılığı nedeniyle eCSF olmamasına rağmen açık görünüyor. Görülen Ancak, yan görünümleri (Şekil 2A'-D ') ventral daraltır ince esnek bir çatı plaka epitelin varlığı ile tutarlı, arka beyin ventrikülü drene edilmiş olduğunu göstermektedir. Vahşi tip embriyolarda, eCSF sürekli olarak üretilir ve beyin 2-3 saat sonrası (Şekil 2) drene karıncıklar yenilenir edilir. Bu nedenle, CSF sürekli olarak ilgi zaman içinde tükenmiş gerekmektedir.
24 hpf de sıvının çıkarılması uzun bir başı daha yukarı gros morfolojisi veya geliştirme, eCSF çıkarılması bozmaz iken kalkınma IOD tüm vücut gelişimine olumsuz etkileri olabilir. Beyin ventriküller içine enjekte faktörlerinin etkisini belirlemek bunun göz önüne alınması gerekmektedir. Ayrıca, gelişimsel kusurları eCSF kaybı veya beyin delinmesiyle iğne nedeniyle bir sonucu olup olmadığını belirlemek için, önemli bir kontrol eCSF çıkarmadan beyin içine bir iğne yerleştirilmesidir.
Bu eCSF protein saptanabilir bir miktar zebrafish eCSF (Şekil 3) toplanan edilebilir gösteren bir SDS-PAGE protein jel üzerinde farklı bir protein bütün embriyo özü daha profil, ve analiz sahip olduğunu göstermiştir. Bu durum, nöroepitelyal hücresel kirletici kütle spektrometri analizi için yeterli olduğu eCSF spesifik proteinler daha düşük seviyelerde, ve ayrıca bu proteinin önemli bir miktarda elde edilebileceğini göstermektedir.
3/4243fig1.jpg "/>
Şekil 1. Manuel drene beyin ventriküller. (A) Deney tasarımı. Yanal (solda) ve dorsal (sağda) mikroenjeksiyon iğne eklemek için nerede görüyor. İğne (siyah üçgen) arka beyin en geniş noktasında arka beyin ventrikül çatı levhası içine yerleştirilir. Iğne sonra daha fazla gibi kırmızı oklarla belirlenmiş orta beyin ve ön beyin ventriküller içine sokulur. (BC) 24 hpf örnekleri el embriyo boşaltılır. Aynı embriyo (B) boşaltmadan önce veya boşaltma (C) sonra görüntülenmiş. M.Ö. (B'-C ') kayıtlarında. Gri çizgi görünür morfolojisi mevcut değil gösterir. F = önbeyin, M = orta beyin, H = arka beyin. Ölçek bar = 50 mikron.
Şekil 2. ECSF zamanla beyin ventriküller yenilenir. Boşaltmadan önce, (A) 24 HPF embriyo (B) hemen sonra t = 0 (C) 15, (D) 60, (e) 120 (F), 180, (G) 240, ve (H) su boşaltıldıktan sonra 300 dakika (m). (AH) Dorsal ve (A'-H ') sol anterior ile yanal aydınlık görüntüler. F = önbeyin, M = orta beyin, H = arka beyin. Ölçek bar = 50 mikron.
Şekil 3. Protein profili 24 hpf bütün zebrafish embriyo (WE) ekstraktı (0.5 mikrogram total protein) ve 50 embriyolardan 24 hpf eCSF arasında değişmektedir. SDS yükleme tamponu,% 8 Tris-HCI PAGE jel üzerinde çalışan proteinleri denatüre numune için, elde edilen eCSF ilave edildi ve SYPRO Ruby ile tespit edildi. * ECSF özgü gruplarını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El ile zebrafish beyin ventriküllerden eCSF boşaltmak için bu tekniğin kullanılması, gelişme sırasında eCSF için ihtiyaç belirlenmesi için yararlı olacaktır. Buna ek olarak, bu teknik embriyonik gelişme boyunca eCSF protein profili açıklamasına izin verir. Bu süre boyunca farklı proteinin tanımlanması BOS ve beyin gelişimi sırasında potansiyel rolünün işlevinin içine daha fazla araştırma sağlayacaktır. Amniotları yılında eCSF (IGF2 FGF2, retinoik asit ve apolipoproteinler) belirlenen bazı faktörler nöroepitelyal hücre canlılığı, proliferasyon ve nöron 13,17,20,23,27,28 bir gösterdi role sahiptir. Ancak, zaman noktaları burada gösterdi daha sonra, koroid pleksus oluşumundan sonra elde edildi eCSF içinde uncharacterized yüzlerce proteinin, olduğu görülmektedir. Ayrıca, bizim laboratuar ve diğerleri anormal beyin ventrikül boyutu veya beyin kusurları 29-31, ve olabilir hav ile zebrafish mutant belirledikeCSF bileşimi ve işlevini e anormallikler. Bu yöntem kolaylıkla mutantlar veya farklı çevresel koşullar altında olası anormal eCSF yalıtma ve test etmek için izin verir.
Zebrafish sisteminin bir güçlü kullanım böylece beyin gelişme sırasında fonksiyon testleri, eCSF çıkarılmasından sonra beyin ventriküller içine enjeksiyon yolu ile seçilmiş olan ve değiştirmektir. Genetik ya da kimyasal pertürbasyon sonra elde edilen küçük moleküller, proteinler ve eCSF test edilebilir. Diğer türlerden eCSF tekrar kullanımında ortaya türler arasında ve tamamlayıcı ve memeli çalışmalar ile arabirim örneğin hidrosefali gibi çeşitli patolojik koşullar altında faktörleri ve işlevleri karşılaştırma izin verir. Özetle, eCSF kaldırmak kompozisyon analiz ve beyin ventriküller içine eCSF veya belirli faktörler reintroduce, önemli ölçüde rol ve eCSF fonksiyonunun regülasyonu anlaşılması artacak ve beynin ventriküler sistemin buna zebrafish kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Dr Jen Gutzman, Dr Amanda Dickinson ve birçok faydalı tartışmalar ve yapıcı eleştirileri için diğer Sive laboratuvar üyeleri ve uzman balık yetiştiriciliği için Olivier Paugois özel teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
