Summary
نقدم طريقة لجمع السائل النخاعي (CSF) وخلق نظام الذي يفتقر CSF داخل منظومة البطين الزرد الجنينية الدماغ. وهذا يسمح لمزيد من الدراسة من تكوين CSF ومتطلباتها خلال نمو المخ الجنينية.
Abstract
السائل النخاعي (CSF) هو السائل الغنية بالبروتين الواردة في البطينين الدماغ. كان موجودا خلال التنمية في وقت مبكر واستمرت الفقاريات الجنينية في جميع مراحل الحياة. ويعتقد الكبار CSF للتخفيف من الدماغ، وإزالة النفايات، وتحمل جزيئات يفرز 1،2. في الجنين الكبار وكبار السن، ويتم إجراء معظم CSF من قبل الضفيرة المشيمية، سلسلة من المناطق عالية إفرازية أوعية دموية تقع بالقرب من الدماغ البطينين 3-5. في الزرد، ويتكون بشكل كامل الضفيرة المشيمية صلت إلى 144 التسميد آخر ساعة (HPF) 6. وقبل ذلك، في كل من الفقاريات الأجنة الزرد وغيرها بما في ذلك الماوس، وكمية كبيرة من CSF الجنينية (eCSF) موجود. هذه البيانات والدراسات في فرخ تشير إلى أن الظهارة العصبية الإفرازية هو في وقت مبكر من التنمية، وقد تكون المصدر الرئيسي للeCSF قبل التنمية الضفيرة المشيمية 7.
eCSF يحتوي على حوالي ثلاث مرات أكثر بروتين تيهان الكبار CSF، مما يشير إلى أنه قد يكون لها دور هام أثناء تطوير 8،9. دراسات في الفرخ والفأر تثبت أن العوامل يفرز في eCSF، ضغط السائل، أو مزيج من هذه، مهمة لبقاء الخلايا العصبية التعبير الجيني، تكاثر الخلايا، والخلية، في الظهارة العصبية 10-20. وقد حددت التحليلات البروتين من الفئران والبشرية، والماوس، وeCSF فرخ العديد من البروتينات التي قد تكون ضرورية لوظيفة CSF. وتشمل هذه المكونات المصفوفة خارج الخلية، apolipoproteins والبروتينات التي تنظم الضغط التناضحي، والبروتينات المشاركة في موت الخلايا وانتشار 21-24. ومع ذلك، فإن الوظائف المعقدة للeCSF غير معروفة إلى حد كبير.
وقد وضعنا طريقة لإزالة eCSF من البطينين الدماغ الزرد، مما يسمح لتحديد مكونات وeCSF لتحليل متطلبات eCSF خلال التنمية. رغم أنه يمكن جمع أكثر من غيرها eCSF ث نظم الفقارياتإيث أكبر الأجنة، يمكن جمعها eCSF منذ المراحل الأولى للتنمية الزرد، وتحت ظروف جينية أو بيئية غير طبيعية التي تؤدي إلى الدماغ حجم البطين أو شكلها. إزالة وجمع eCSF يسمح لكتلة الطيفي التحقيق، وتحليل وظيفة eCSF، وإعادة تحديد العوامل إلى البطينين لفحص وظيفتها. وبالتالي الوصول إلى الجنين في وقت مبكر يسمح للالزرد تحليل مفصل وظيفة eCSF خلال التنمية.
Protocol
1. إعداد إبر حقن مكروي والترام الخليوي
- ملء إيبندورف CellTram جهاز microinjector النفط مع الزيوت المعدنية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إعداد الإبر حقن مكروي عن طريق سحب الأنابيب الشعرية باستخدام إبرة سوتر مجتذب الصكوك.
- تحميل الإبرة على مياداة مجهرية متصلة CellTram إيبندورف.
- كسر بعناية غيض من إبرة. تلميح لحجم موحد، مع قياس ميكرون، أو مقارنة لإبرة المرجعية.
- ملء طول الإبرة مع النفط، وذلك باستخدام CellTram لدفع النفط إلى أسفل طول، والحرص على تجنب أي فقاعات.
2. إعداد الأجنة
- كزة ثقوب في صحن الاغاروز 1٪ المغلفة مع طرف ماصة ميكرولتر 1-200، وإزالة شمعات الاغاروز. ملء الطبق مع وسائل الإعلام الجنين (مصنوعة وفقا لWesterfield 25).
- باستخدام ملقط، dechorionate الأجنة تحت stereomicroscope.
- نقل الأجنة dechorionatedفي الاغاروز طبق المغلفة.
- لتخدير الأجنة، إضافة Tricaine (0.1 ملغ / مل) إلى طبق الاغاروز حتى الأجنة يتوقف عن الحركة (تقدم وفقا لWesterfield 25).
3. تجفيف eCSF
- توجيه الأجنة مع ذيولها في ثقوب من الاغاروز وجنوبهم الخلفي الأقرب إلى مياداة مجهرية، مما يسمح لرؤية الجانب الظهري من الدماغ.
- وضع الإبرة في قسيم معيني 0/1 المفصلي نقطة أو نقطة على أوسع نطاق للبطين الدماغ المؤخر (الشكل 1A).
- لوحة السقف بعناية بيرس للبطين الدماغ المؤخر لا يجري التأكد من خلال الذهاب الى عمق الدماغ إلى الصفار.
- استنزاف eCSF باستخدام CellTram وجمع السوائل في حقن مكروي إبرة. كن حذرا لتجنب أي الخلايا.
4. جمع eCSF لتحليل التركيب
- مرة واحدة يتم جمع eCSF في الإبرة، بعناية وقف السحب من CellTram.
- موهاء طبق من تحت الإبرة ووضع بعناية الإبرة في أنبوب يحتوي على المخزن المؤقت المطلوب.
- باستخدام CellTram، واستنزاف eCSF من الإبرة في المخزن المؤقت في محاولة لتجنب تلويث الحل مع النفط.
- من أجل إزالة الخلايا التي كنت قد يستنشق جنبا إلى جنب مع eCSF eCSF تدور، في ز X 10،000. جمع غير ملوثة eCSF (طاف) وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى على استعداد لمزيد من التحليل.
5. إعادة من العوامل المختارة
- استنزاف كل ساعة eCSF 2 خلال الفاصل الزمني المطلوب، حيث أن السائل ضمن تجديد تلك الفترة الزمنية. بين الصرف وقتا نقطة إزالة الإبرة وتخزين الأجنة في C ° 28،5 المطلوب أو درجة الحرارة.
- 2 تحميل إبرة micropipette مع عامل الاختبار.
- إبرة في مكان مياداة مجهرية المرفقة microinjector.
- ضبط مستوى الصوت إلى 1 NL حقن عن طريق قياس حجم انخفاض في الوقت حقن النفط والتركيب وعressure.
- حقن 1-2 NL في الدماغ البطينات كما هو موضح سابقا 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مثال على الدماغ البطين ينضب في الشكل 1B-C. وانهارت البطينين الدماغ كما أنها تفتقر eCSF (الشكل 1B مقابل C). كما رأينا في الصور الظهرية (الشكل 1B-C، والشكل 2A-D). والظهارة العصبية الدماغ المؤخر لا تحتفظ التشكل المميز له، ويبدو أن تكون مفتوحة على الرغم من عدم eCSF على الأرجح بسبب قوة نقاط المفصلي ومع ذلك، إطلالة جانبية (الشكل 2A'-D ') تثبت أنها قد استنزفت البطين الدماغ المؤخر، بما يتفق مع وجود سقف مرن رقيقة ظهارة وحة التي تنهار بطنيا. في الأجنة نوع البرية، وتنتج باستمرار eCSF والغيارات الدماغ البطينين 2-3 ساعة استنزاف آخر (الشكل 2). لذلك، يجب أن CSF المنضب باستمرار مع مرور الوقت في المصالح.
بينما إزالة السوائل في 24 HPF لا يعطل التشكل الإجمالي أو التنمية، وإزالة أكثر من eCSF يعد في قد IOD التنمية لها آثار ضارة على التنمية الجسم كله. ينبغي أن تؤخذ هذه في الاعتبار عند تحديد فعالية العوامل حقنها في الدماغ البطينين. علاوة على ذلك، لتحديد ما إذا العيوب التنموية هي نتيجة لفقدان eCSF أو بسبب ثقب إبرة الدماغ، المهم هو عنصر تحكم إدخال إبرة في الدماغ دون إزالة eCSF.
أثبتنا أن لديه ملف eCSF البروتين مختلفة من استخراج الجنين كله، وتحليل البروتين على هلام SDS-PAGE يدل على أن يمكن جمع كمية من البروتين للكشف عن eCSF الزرد (الشكل 3). هذا يدل على أن الملوثات الخلوية عصبية ظهارية هي في مستويات أدنى من البروتينات eCSF محددة، وكذلك التي يمكن جمعها على كمية كبيرة من البروتين الذي يكفي لتحليل الطيف الكتلي.
3/4243fig1.jpg "/>
الشكل 1. البطينين الدماغ ينضب يدويا. (A) تصميم التجارب. الجانبي (يسار) والظهرية (يمين) وجهات نظر حيث لإدراج إبرة حقن مكروي. يتم إدراج إبرة (المثلث الأسود) في لوحة سقف البطين الدماغ المؤخر على أوسع نقطة من الدماغ المؤخر. ثم يتم إدخال الإبرة إلى مزيد من المخ الأوسط والبطينين الدماغ الأمامي وفقا لما تقرره السهام الحمراء. (BC) أمثلة من 24 HPF ينضب يدويا الجنين. تصوير الجنين نفسه قبل تجفيف (B) أو بعد هجرة (C). (B 'C') الإقتفاء من BC. رمادي يشير الخط الحالي التشكل ولكن غير مرئية. F = الدماغ الأمامي، M = الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر = H. على نطاق والحانات = 50 ميكرومتر.
الشكل 2. eCSF الغيارات البطينين الدماغ مع مرور الوقت. (A) الجنين HPF 24 قبل تجفيف (B) مباشرة بعد ر = 0 (C) 15، (D) 60، (E) 120، (F) 180، (G) 240، و (H) 300 دقيقة (م) بعد افراغ. (ه) والظهرية (A'-H ') الصور brightfield الجانبية الأمامية مع إلى اليسار. F = الدماغ الأمامي، M = الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر = H. على نطاق والحانات = 50 ميكرومتر.
الشكل 3. الملف البروتين يختلف بين 24 HPF الجنين الزرد كله (WE) استخراج (0.5 ميكروغرام البروتين الكلي) و 24 HPF eCSF من 50 الأجنة. وأضاف SDS تحميل العازلة لeCSF التي تم جمعها لتفسد البروتينات، عينة تشغيل على هلام 8٪ PAGE تريس، حمض الهيدروكلوريك، والكشف عن روبي مع Sypro. * تشير إلى نطاقات فريدة لeCSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سوف تستخدم هذه التقنية لاستنزاف يدويا eCSF من البطينين الدماغ الزرد أن تكون مفيدة لتحديد متطلبات eCSF خلال التنمية. وبالإضافة إلى ذلك، سوف تسمح هذه التقنية وصف الملف البروتين eCSF على مدى التطور الجنيني. وتحديد البروتينات المختلفة خلال هذا الوقت تمكن إجراء مزيد من التحقيق في وظيفة CSF ودورها المحتمل خلال نمو المخ. في amniotes، بعض العوامل التي تم تحديدها في eCSF (IGF2، FGF2، حمض الريتينويك، وapolipoproteins) لها دور تظاهروا في انتشار الخلايا الظهارية العصبية والبقاء وتكوين الخلايا العصبية 13،17،20،23،27،28. ومع ذلك، يبدو أن هناك المئات من البروتينات في uncharacterized eCSF، الذي حصلت بعد تشكيل الضفيرة المشيمية، في وقت لاحق من الوقت نقاط تظاهر هنا. بالإضافة إلى ذلك، حددت مختبرنا وغيرها المسوخ الزرد مع حجم غير طبيعي في المخ أو عيوب الدماغ البطين 29-31، وهف مايوتشوهات في تكوين ه eCSF وظيفة. هذا الأسلوب يسمح بسهولة لعزل واختبار eCSF غير طبيعي من المفترض المسوخ أو تحت ظروف بيئية مختلفة.
A استخدام قوية للنظام الزرد هو استبدال العوامل المحددة عن طريق الحقن في المخ البطينين بعد إزالة eCSF، وبالتالي اختبار وظيفتها أثناء نمو المخ. ويمكن اختبار الجزيئات الصغيرة، والبروتينات، وeCSF تم الحصول عليها بعد اضطراب وراثي أو الكيميائية. وإعادة العمل eCSF من الأنواع الأخرى من العوامل تسمح بالمقارنة وظائف عبر الأنواع وتحت ظروف مرضية مختلفة، مثل استسقاء الرأس، واستكمال التواصل مع دراسات الثدييات. وباختصار، استخدم من الزرد لإزالة eCSF وتحليل وإعادة تكوينها eCSF أو عوامل محددة في الدماغ البطينين، وزيادة كبيرة في فهم دور وظيفة تنظيم eCSF والتي من الدماغ نظام البطين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية، والمؤسسة الوطنية للعلوم. شكر خاص للدكتور جين Gutzman الدكتور ديكنسون أماندا وغيرها من أعضاء المختبر لإجراء مناقشات SIVE كثيرة مفيدة والنقد البناء، وأوليفييه لتربية الأسماك Paugois الخبراء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
