Summary
Nous présentons une méthode pour collecter le fluide céphalo-rachidien (LCR) et de créer un système qui manque de LCR dans le système ventriculaire du cerveau du poisson zèbre embryonnaire. Cela permet un examen plus approfondi de la composition du LCR et son exigence au cours du développement embryonnaire du cerveau.
Abstract
Liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide riche en protéine contenue dans les ventricules du cerveau. Il est présent pendant le développement embryonnaire précoce des vertébrés et persiste toute la vie. Adulte CSF est pensé pour amortir le cerveau, éliminer les déchets, et effectuer sécrétée 1,2 molécules. Dans l'embryon adultes et plus, la majorité des CSF est faite par la choroïde, du plexus une série de régions hautement vascularisées sécrétrices situées à côté du cerveau ventricules 3-5. Chez le poisson zèbre, le plexus choroïde est entièrement formé à 144 après la fécondation heures (hpf) 6. Avant cela, dans les deux embryons de vertébrés poisson zèbre et autres, y compris la souris, une quantité importante de CSF embryonnaire (FFPE) est présent. Ces données et d'études de poussin suggèrent que la neuro-épithélium sécrétoire est tôt dans le développement et peut-être la principale source de ECSF avant plexus choroïde développement 7.
ECSF contient environ trois fois plus de protéines than adulte CSF, suggérant qu'il peut jouer un rôle important au cours du développement 8,9. Studies in poussin et de la souris démontrent que les facteurs sécrétés dans la FFPE, la pression de fluide, ou une combinaison de ceux-ci, sont importantes pour la neurogenèse, la survie expression des gènes, la prolifération cellulaire et de cellules dans le neuroépithélium 10-20. Analyses protéomiques de l'homme, le rat, la souris et poussin FFPE ont identifié de nombreuses protéines qui peuvent être nécessaires pour la fonction LCR. Ils comprennent des composants de la matrice extracellulaire, les apolipoprotéines, des protéines de régulation de la pression osmotique, et des protéines impliquées dans la mort cellulaire et la prolifération 21-24. Cependant, les fonctions complexes de la FFPE sont largement inconnues.
Nous avons développé un procédé pour éliminer ECSF à partir des ventricules cérébraux poisson zèbre, permettant ainsi l'identification des composants ECSF et pour l'analyse de l'exigence ECSF au cours du développement. Bien que plus ECSF peuvent être collectées à partir d'autres systèmes avec des vertébrésvec embryons plus grands, ECSF peuvent être recueillies dès les premiers stades de développement du poisson zèbre, et dans des conditions génétiques ou environnementaux qui conduisent à volume cérébral anormal du ventricule ou de la morphologie. L'enlèvement et la collecte de ECSF permet d'analyse de masse, spectrométrie enquête de la fonction ECSF, et la réintroduction des facteurs de sélection dans les ventricules pour doser leur fonction. Ainsi, l'accessibilité de l'embryon du poisson zèbre précoce permet une analyse détaillée de la fonction ECSF au cours du développement.
Protocol
1. Préparation Aiguilles microinjection cellulaire et Tram
- Remplissez Eppendorf CellTram huile microinjecteur appareil avec de l'huile minérale selon les instructions du fabricant.
- Préparer aiguilles de microinjection en tirant des tubes capillaires en utilisant extracteur Sutter aiguille instruments.
- Monter l'aiguille sur micromanipulateur connecté à Eppendorf CellTram.
- Cassez délicatement la pointe de l'aiguille. Pour la taille de la pointe uniforme, mesurer avec un micromètre, ou comparer à une aiguille de référence.
- Remplissez la longueur de l'aiguille avec de l'huile, en utilisant le CellTram pour pousser l'huile sur toute la longueur, en prenant soin d'éviter les bulles.
2. Préparation des embryons
- Percez des trous dans un plat recouvert d'agarose 1% avec une pointe de pipette 1-200 pi, et enlever les bouchons d'agarose. Remplissez plat avec les médias embryon (faite selon Westerfield 25).
- En utilisant des pinces, des embryons dechorionate sous stéréomicroscope.
- Transfert d'embryons dechorionateden agarose plat couché.
- Pour anesthésier embryons, ajouter tricaïne (0,1 mg / ml) à plat agarose jusqu'à ce que les embryons s'immobilisent (faite en fonction Westerfield 25).
3. Vidange du ECSF
- Orienter les embryons dont la queue dans les trous de l'agarose et leurs faces postérieures les plus proches du micromanipulateur, permettant la visualisation de la face dorsale du cerveau.
- Placez l'aiguille à la rhombomère 0/1 charnière-point ou point le plus large du cerveau postérieur du ventricule (figure 1A).
- Soigneusement toit en tôle percer le cerveau postérieur du ventricule étant sûr de ne pas passer par la profondeur du cerveau dans le jaune.
- Égoutter la FFPE utilisant le CellTram et collecter le fluide dans l'aiguille de microinjection. Soyez prudent pour éviter toutes les cellules.
4. La collecte de la FFPE pour l'analyse de la composition
- Une fois la FFPE est recueillie dans l'aiguille, soigneusement arrêt d'aspiration du CellTram.
- Move le plat de dessous de l'aiguille et l'aiguille en y plaçant dans un tube contenant le tampon désiré.
- En utilisant la CellTram, vidanger le ECSF sur l'aiguille dans le tampon en essayant de ne pas contaminer la solution avec de l'huile.
- Afin d'éliminer les cellules que vous avez aspiré avec la FFPE FFPE, tournent à 10.000 x g. Recueillir non contaminée ECSF (surnageant) et conserver à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse.
5. Réintroduction de certains facteurs
- Égoutter la FFPE chaque h 2 pendant l'intervalle de temps souhaité, car le fluide est reconstitué dans ce délai. Entre temps les points de drainage, retirez l'aiguille et de stocker les embryons à 28,5 ° C ou la température désirée.
- Chargez aiguille micropipette deuxième facteur d'essai.
- Placez l 'aiguille dans micromanipulateur attaché à microinjecteur.
- Ajuster le volume d'injection de 1 nl par mesure de la taille des gouttes dans le temps d'injection d'huile et de réglage et pression.
- Injecter 1-2 nl dans les ventricules du cerveau, comme décrit précédemment 26.
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Representative Results
Un exemple d'un ventricule cérébral drainée est illustré à la figure 1B-C. Ventricules cérébraux sont effondrés car ils n'ont pas ECSF (figure 1B vs C). Comme on le voit dans les images dorsales (figure 1B-C et la Figure 2A-D) neuroépithélium rhombencéphale ne conserve sa morphologie caractéristique et semble être ouverte malgré l'absence de ECSF probablement en raison de robustes charnières points. Cependant, les vues latérales (Figure 2A'-D ') démontrent que le ventricule du cerveau postérieur a été vidangé, compatible avec la présence d'un épithélium mince plaque de toit souple qui s'effondre face ventrale. Dans les embryons de type sauvage, ECSF est produit en continu et remplit les ventricules du cerveau 2-3 h après vidange (Figure 2). Par conséquent, CSF doit être constamment épuisé au cours du temps d'intérêt.
Tandis que l'enlèvement du liquide à 24 HPF ne perturbe pas la morphologie ou de développement, enlèvement de ECSF sur une plus longue par iod de développement peuvent avoir des effets néfastes sur le développement du corps tout entier. Ceci doit être pris en considération lors de la détermination de l'efficacité des facteurs injectés dans les ventricules du cerveau. En outre, afin de déterminer si des anomalies du développement sont le résultat de la perte de ECSF ou en raison d'une aiguille perforant le cerveau, un contrôle important est l'insertion d'une aiguille dans le cerveau sans prélever ECSF.
Nous avons démontré que FFPE a un profil protéique différent de celui extrait d'embryon entier, et l'analyse sur un gel de protéine SDS-PAGE montre qu'une quantité détectable de la protéine peuvent être collectées à partir de poisson zèbre ECSF (figure 3). Cela démontre que neuroépithéliales contaminants cellulaires sont à des niveaux inférieurs protéines ECSF spécifiques, et qu'en outre une quantité importante de protéines peuvent être collectées qui est suffisant pour l'analyse par spectrométrie de masse.
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Figure 1. Ventricules cérébraux manuellement drainés. (A) la conception expérimentale. Latérale (à gauche) et dorsale (à droite) considère d'où insérer l'aiguille de microinjection. Aiguille (triangle noir) est inséré dans la plaque de toit du ventricule du cerveau postérieur au point le plus large du cerveau postérieur. L'aiguille est ensuite insérée dans le mésencéphale et les ventricules du cerveau antérieur tel que désigné par les flèches rouges. (Colombie-Britannique) Exemples de 24 hpf manuellement vidé embryon. L'embryon même capteur que le drainage (B) ou après vidange (C). (B'-C ') Pour contacter le webmaster de la Colombie-Britannique. Ligne gris indique morphologie actuelle, mais pas visible. F = prosencéphale, mésencéphale M = H = rhombencéphale. Barres d'échelle = 50 um.
Figure 2. ECSF recharges des ventricules cérébraux au fil du temps. (A) 24 HPF embryon avant la vidange (B) immédiatement après t = 0 (C) 15 (D) 60, (E) 120, (F) 180, (G) 240, et (H) 300 min (m) après la vidange. (AH) et dorsale (A'-H ') des images en fond clair latérales avec avant à gauche. F = prosencéphale, mésencéphale M = H = rhombencéphale. Barres d'échelle = 50 um.
Le profil des protéines Figure 3. Diffère entre 24 embryon du poisson zèbre hpf ensemble (WE) extrait (0,5 ug de protéine totale) et 24 hpf ECSF de 50 embryons. SDS tampon de charge ajoutée à recueillir ECSF pour dénaturer les protéines, l'échantillon sur un gel PAGE 8% Tris-HCl, et détecté avec Sypro Ruby. * Indiquent des bandes uniques à ECSF.
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Discussion
L'utilisation de cette technique pour purger manuellement ECSF à partir des ventricules cérébraux poisson zèbre sera utile pour déterminer l'exigence de ECSF au cours du développement. En outre, cette technique permettra description du profil protéique ECSF au cours du développement embryonnaire. L'identification des différentes protéines au cours de cette période permettra enquête plus approfondie sur la fonction de la LCR et son rôle potentiel au cours du développement du cerveau. En amniotes, certains facteurs identifiés dans ECSF (IGF2, le FGF2, l'acide rétinoïque, et d'apolipoprotéines) ont démontré un rôle dans la survie cellulaire neuroépithéliale, la prolifération et la neurogenèse 13,17,20,23,27,28. Cependant, il semble y avoir des centaines de protéines non caractérisées dans la FFPE, qui a été obtenu après la formation du plexus choroïde, au plus tard les points temporels démontré ici. De plus, notre laboratoire et d'autres ont identifié des mutants poisson-zèbre avec la taille du cerveau ventricule anormale ou des anomalies cérébrales 29-31, et peut have anomalies dans la composition et la fonction ECSF. Cette méthode permet d'isoler facilement et tester putatif ECSF anormale de mutants ou dans différentes conditions environnementales.
Une utilisation efficace du système de poisson-zèbre est de remplacer les facteurs sélectionnés par injection dans les ventricules du cerveau après le retrait de ECSF, testant ainsi leur fonction au cours du développement du cerveau. Les petites molécules, protéines et ECSF obtenus après une perturbation génétique ou chimique peuvent être testés. Réintroduction de ECSF à partir d'autres espèces de permettre la comparaison des facteurs et des fonctions entre les espèces et sous différentes conditions pathologiques telles que l'hydrocéphalie, en complément et l'interfaçage avec les études des mammifères. En résumé, l'utilisation du poisson zèbre pour enlever ECSF, d'analyser sa composition et de réintroduire ECSF ou des facteurs spécifiques dans les ventricules du cerveau, permettra d'accroître considérablement la compréhension du rôle et de la régulation de la fonction ECSF et celle du système ventriculaire du cerveau.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Institut national pour la santé mentale, et la National Science Foundation. Un merci spécial à Dr. Jen Gutzman, le Dr Amanda Dickinson et d'autres membres du laboratoire Sive pour de nombreuses discussions utiles et des critiques constructives, et à Olivier Paugois pour l'élevage de poissons d'experts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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