Summary
우리는 뇌척수 (CSF)를 수집하고 배아 zebrafish의 뇌 심실 시스템 내에서 CSF 부족 시스템을 구축 할 수있는 방법을 제시한다. 이 태아의 뇌 발달 동안 CSF 구성 및 요구 사항의 추가 검사를 할 수 있습니다.
Abstract
중추 신경계 (CSF)는 뇌 심실 내에 포함 된 단백질이 풍부한 액체이다. 이 초기 척추 동물의 배아 발달 동안 존재하며, 수명이 다할 때까지 지속된다. 성인 CSF는, 뇌를 쿠션 폐기물을 제거하고 분비 분자의 1,2를 운반 것으로 생각됩니다. 성인 세 이상 배아에서 CSF의 대부분은 맥락막 얼기, 뇌 심실 3-5에 인접 매우 vascularized의 분비 지역 일련의에 의해 이루어집니다. zebrafish에서 맥락막 얼기 완전히 144시간 게시물 수정을 (hpf) 6시 형성된다. 이전에, 마우스 배아 CSF (eCSF)의 상당한 금액 등 zebrafish 및 기타 모두 척추 동물의 배아에 존재합니다. 여자에서 이러한 데이터와 연구는 neuroepithelium 개발의 초기 분비하고 사전에 맥락막 얼기 개발 7 eCSF의 주요 원인 일 수 있습니다하는 것이 좋습니다.
eCSF는 약 세 배 더 많은 단백질 t을 포함가 개발 8,9 동안 중요한 역할을 할 수 있다는 한 성인 CSF를 제안. 여자와 마우스의 연구 eCSF, 유체 압력, 또는 이들의 조합에 분비 요소 neuroepithelium 10-20에서 neurogenesis, 유전자 발현, 세포 증식 및 세포 생존을 위해 중요하다는 것을 보여줍니다. 인간, 쥐, 마우스 및 여자 eCSF의 Proteomic 분석은 CSF 기능에 필요한 수 있습니다 많은 단백질을 확인했습니다. 이러한 세포 죽음과 확산 21-24에 참여 세포 외 기질 구성 요소, apolipoproteins, 삼투압 조절 단백질, 그리고 단백질이 포함되어 있습니다. 그러나, eCSF의 복잡한 기능은 대부분 알 수없는 수 있습니다.
우리는 따라서 eCSF 구성 요소의 식별 및 개발 중에 eCSF 요구 사항 분석을위한 수 있도록 zebrafish의 뇌 심실에서 eCSF을 제거하는 방법을 개발했습니다. 더 eCSF은 다른 척추 동물의 시스템 w에서 수집 할 수 있지만i 번째 큰 배아, eCSF은 zebrafish 개발의 초기 단계에서 수집하고, 이상 뇌 뇌실 볼륨이나 형태로 이어질 유전 또는 환경 조건 하에서 할 수 있습니다. eCSF의 제거 및 수집 분석에 심실에 선택 요소의 질량 spectrometric 분석, eCSF 기능의 조사, 그리고 재 도입의 기능을 할 수 있습니다. 따라서 초기 zebrafish의 배아의 접근성 개발 중 eCSF 기능의 상세 분석 할 수 있습니다.
Protocol
1. Microinjection의 바늘과 셀 트램 준비
- 제조업체의 지침에 따라 미네랄 오일과 함께 Eppendorf CellTram 오일 microinjector 장치를 입력합니다.
- 셔터 계기 바늘 풀러를 사용하여 모세관 튜브를 당겨 microinjection의 바늘을 준비합니다.
- Eppendorf CellTram에 연결 micromanipulator에 바늘을 탑재합니다.
- 조심스럽게 바늘의 끝을 부러. 균일 팁 크기를 들어, 마이크로 미터로 측정하거나, 참조 바늘을 비교할 수 있습니다.
- 모든 거품을 피하려면 조심하는 것 길이 아래로 기름을 밀어 CellTram을 사용하여 기름을 바늘의 길이를 입력합니다.
2. 태아 준비
- 1-200 μl 피펫 팁과 1 % 아가로 오스 코팅 접시에 구멍을 찌르지하고, 아가로 오스 플러그를 제거합니다. 배아 미디어 (Westerfield 25에 따라 제작)으로 요리를 채 웁니다.
- stereomicroscope에서 포셉, dechorionate 배아를 사용합니다.
- dechorionated 배아를 전송아가로 오스 코팅 접시에.
- 배아는 (Westerfield 25에 따라 변경) 이동 중지 할 때까지 배아를 마취시키기 위해서, 아가로 오스 요리에 Tricaine을 (0.1 밀리그램 / ML)를 추가합니다.
3. eCSF을 배수
- 아가로 오스와 micromanipulator에 가장 가까운 자신의 뒤쪽 측면의 구멍에 꼬리와 동양의 배아, 뇌의 등 쪽의 시각화를 위해 수 있도록합니다.
- rhombomere 0 / 1 힌지 지점 또는 hindbrain 뇌실 (그림 1A)의 가장 넓은 부분에 바늘을 배치합니다.
- 난황에 뇌의 깊이 통과하지 않도록 것 hindbrain의 심실의주의 깊게 관통 지붕 판.
- CellTram를 사용하여 eCSF을 배출하고 microinjection의 바늘에 유체를 수집합니다. 모든 세포를 방지 할주의하십시오.
4. 구성 분석에 대한 eCSF 수집
- eCSF이 바늘에 수집되면, CellTram의 흡입을주의 깊게 중지합니다.
- 모바늘 아래에서 음식을 같군 조심스럽게 원하는 버퍼를 포함하는 튜브에 바늘을 위치.
- CellTram 사용하여 기름 솔루션을 오염을 막기 위해 노력하고 버퍼에 바늘의 eCSF을 배수한다.
- 당신은 10,000 X g에서 eCSF, 스핀 eCSF와 함께 흡입 한 세포를 제거하기 위해. 수집 자세한 분석을 위해 -80에서 eCSF (표면에 뜨는) 및 저장 ° C까지 준비 오염.
5. 선택된 요소의 재 도입
- 유체가 그 기간 내에 보충되어 있기 때문에, 원하는 시간 간격 동안 eCSF마다 2 시간을 배수한다. 온도를 배수 시간 포인트 사이에, 바늘을 제거하고 28.5 ° C에서 배아를 저장하거나 원하는.
- 테스트 요소로 2 micropipette 바늘을로드합니다.
- micromanipulator에 자리 바늘이 microinjector에 부착.
- 오일과 조정 분사 시간 및 P의 방울 크기를 측정하여 한 NL로 사출 볼륨 조절ressure.
- 이전과 같이 26 설명 뇌 심실에 1-2 NL를 삽입.
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Representative Results
배수 뇌 뇌실의 예는 그림 1B-C에 표시됩니다. 그들은 eCSF (그림 1B 대 C) 부족으로 뇌 심실이 접혀 있습니다. 으로 등쪽 이미지 (그림 1B-C, 그리고 그림 2A-D) hindbrain의 neuroepithelium는 특성 형태를 유지하지하고 강력한 힌지 포인트에 가능성으로 인해 eCSF의 부족에도 불구하고 열려있는 것 같습니다.에서 볼 그러나, 측면 전망은 (그림 2A'-D ') ventrally 축소 가늘고 유연한 지붕 판 상피의 존재와 일치, hindbrain의 심실이 배출되었음을 보여줍니다. 야생 유형 배아에서 eCSF는 지속적으로 생산 뇌 2-3 시간 포스트 (그림 2) 배수를 심실 채우지 있습니다. 따라서, CSF는 지속적으로 관심을 시간이 지남에 따라 소진해야합니다.
24 hpf에서 유체의 제거 더 이상 당을 통해 총 형태 또는 개발, eCSF의 제거를 방해하지 않지만 개발 iod는 몸 전체 개발에 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 뇌 심실에 주입 요인의 효능을 결정할 때이를 고려해야합니다. 또한, 발달 결함이 eCSF의 손실이나 뇌를 펑 쳐링 바늘로 인한 결과인지 확인하기 위해 중요한 제어 eCSF을 제거하지 않고 뇌에 바늘의 삽입이다.
우리는 eCSF는 단백질의 검출 금액은 zebrafish eCSF (그림 3)에서 수집 할 수 있다는 설명 SDS-PAGE 단백질 젤에서 다른 단백질 전체 배아 추출물보다 프로필 및 분석을 가지고 보여 주었다. 이것은 neuroepithelial 세포 오염 물질 대량 분광 분석을위한 충분한 지 eCSF 특정 단백질보다 낮은 수준이며, 더되는 단백질의 상당한 양의를 수집 할 수 있습니다 보여줍니다.
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그림 1. 수동으로 배수 뇌 심실이 수축하지. (A) 실험 설계. 측면 (왼쪽)와 등쪽은 (오른쪽) microinjection의 바늘을 삽입 할 수있는 곳의 전망을 제공합니다. 니들 (검은 색 삼각형)은 hindbrain의 가장 넓은 부분에서 hindbrain의 뇌실의 지붕 판에 삽입됩니다. 주사 바늘을 더와 빨간색 화살표가 지정한 midbrain 및 forebrain의 심실에 삽입됩니다. (BC) 24 hpf의 예는 수동으로 배아를 배수. 같은 배 (B) 배수 전이나 배수 (C) 후 이미징. BC의 (B'-C ') Tracings. 그레이 라인은 보이는 형태 존재하지만 나타냅니다. F = forebrain, M = midbrain, H = hindbrain. 스케일 바 = 50 μm.
그림 2. eCSF는 시간이 지남에 따라 뇌 심실를 채우지. 배수 전에 (A) 24 hpf의 배아 (B) 바로 뒤에 t = 0 (C) 15 (D) 60 (E) 120 (F) 180, (G) 240, 및 (H) 배수 후 300 분 (m). (AH) 등쪽과 (A'-H ') 왼쪽에있는 앞과 측면 brightfield 이미지. F = forebrain, M = midbrain, H = hindbrain. 스케일 바 = 50 μm.
그림 3. 단백질 프로파일은 24 hpf 전체 zebrafish의 배아 (WE) 추출물 (0.5 μg 총 단백질) 50 배아에서 24 hpf eCSF 사이에 다릅니다. SDS 로딩 버퍼 8% 트리스 - HCL 페이지 젤에서 실행 단백질, 샘플을 변성으로 수집 eCSF에 추가하고, Sypro 루비와 함께 발견했습니다. * eCSF 고유 밴드를 나타냅니다.
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Discussion
수동으로 zebrafish의 뇌 심실에서 eCSF을 배수하기 위해이 기술의 사용은 개발 중에 eCSF에 대한 요구 사항을 결정하는 데 유용합니다. 또한이 기술은 배아 발달의 과정을 통해 eCSF 단백질 프로파일의 설명을 할 수 있습니다. 이 시간 동안 다른 단백질의 식별은 CSF와 뇌 개발하는 동안 잠재적 인 역할의 기능에 추가로 조사를하게됩니다. amniotes에서 eCSF (IGF2, FGF2, retinoic 산, 그리고 apolipoproteins)에서 확인 일부 요소가 neuroepithelial 세포 생존, 증식과 neurogenesis 13,17,20,23,27,28에서 보여준 역할을합니다. 그러나, 시간 포인트는 여기에 시연 이후, 맥락막 얼기 형성 한 후 얻은 eCSF에 uncharacterized 단백질의 수백이있을 나타납니다. 또한, 우리 실험실과 다른 비정상적인 뇌 뇌실 크기 또는 뇌 결함 29-31, 5 월 근래에 zebrafish 돌연변이가 확인되었습니다eCSF 구성 및 기능의 전자 이상. 이 방법은 쉽게 돌연변이이나 다른 환경 조건 하에서 putative 이상 eCSF를 분리하고 테스트 할 수 있습니다.
zebrafish 시스템의 강력한 사용함으로써 뇌 개발 중에 기능을 테스트 eCSF 제거 후 뇌 심실로 분사를 통해 선택한 요소를 대체하는 것입니다. 유전자 또는 화학 물질 섭동 후 얻은 작은 분자, 단백질, 그리고 eCSF을 테스트 할 수 있습니다. 다른 종의 eCSF의 재 도입은 종을 가로 질러 보완 및 포유류의 연구와 인터페이스 등 뇌수종 등 다양한 병적 인 조건, 아래의 요소 및 기능의 비교를 할 수 있습니다. 요약, eCSF을 제거의 성분을 분석하고 뇌 심실로 eCSF 또는 특정 요소를 다시 소개, 크게 역할과 eCSF 기능의 조절을 이해 증가하고 뇌 심실 시스템의 그것과 zebrafish 중 하나를 사용합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 정신 건강 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원되었습니다. 박사 젠 Gutzman 박사 아만다 디킨스 많은 유용한 토론과 건설적인 비판에 대한 다른 Sive 연구소 회원, 전문 생선 축산을위한 올리비에 Paugois에 특별 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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