Summary
Se presenta un método para recoger líquido cefalorraquídeo (LCR) y para crear un sistema que carece de CSF dentro del sistema ventricular del cerebro embrionario de pez cebra. Esto permite un examen más detenido de la composición de CSF y sus requerimientos durante el desarrollo embrionario del cerebro.
Abstract
El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un líquido rico en proteínas contenidas dentro de los ventrículos cerebrales. Está presente durante el desarrollo embrionario temprano de vertebrados y persiste durante toda la vida. Adulto CSF se piensa para amortiguar el cerebro, eliminar los desechos, y llevar a 1,2 secretada moléculas. En el embrión y adulto mayor, la mayoría de los CSF se hace por el plexo coroideo, una serie de regiones altamente vascularizados secretoras situados adyacentes al cerebro ventrículos 3-5. En el pez cebra, el plexo coroideo está completamente formado a 144 horas después de la fertilización (hpf) 6. Antes de esto, en embriones de vertebrados tanto pez cebra y otros incluyendo el ratón, una cantidad significativa de embrionario CSF (ECSF) está presente. Estos datos y los estudios sugieren que el polluelo en el neuroepitelio es secretora temprana en el desarrollo y puede ser la fuente principal de ECSF antes de plexo coroideo desarrollo 7.
ECSF contiene aproximadamente tres veces más proteínas tHan adulto CSF, sugiriendo que podría tener un papel importante durante el desarrollo 8,9. Los estudios en pollo y ratón demuestran que los factores secretados en el ECSF, la presión del fluido, o una combinación de éstos, son importantes para la neurogénesis, la expresión de genes de supervivencia, la proliferación celular y de la célula en el neuroepitelio 10-20. Análisis proteómico de rata humana, el ratón y el pollo ECSF han identificado muchas proteínas que pueden ser necesarios para la función LCR. Estos incluyen componentes de la matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulan la presión osmótica, y proteínas implicadas en la muerte celular y la proliferación 21-24. Sin embargo, las funciones complejas de la ECSF son en gran medida desconocidos.
Hemos desarrollado un método para eliminar ECSF desde los ventrículos del cerebro del pez cebra, permitiendo así la identificación de los componentes ECSF y para el análisis de la exigencia ECSF durante el desarrollo. Aunque más ECSF se pueden obtener de otra w sistemas de vertebradosith embriones más grandes, ECSF se pueden recoger de las primeras etapas del desarrollo del pez cebra, y bajo condiciones genéticas o ambientales que conducen a volumen anormal ventrículo cerebral o en la morfología. La eliminación y recogida de ECSF permite el análisis de espectrometría de masas investigación, de la función ECSF, y la reintroducción de los factores seleccionados en los ventrículos para ensayar su función. Por lo tanto la accesibilidad del embrión de pez cebra temprana permite el análisis detallado de la función ECSF durante el desarrollo.
Protocol
1. Preparación de agujas de microinyección y tranvía Celular
- Llenar Eppendorf CellTram aceite aparato microinyector con aceite mineral de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Preparar agujas de microinyección tirando tubos capilares utilizando Sutter extractor aguja instrumentos.
- Montar la aguja en micromanipulador Eppendorf CellTram conectado a.
- Corte cuidadosamente la punta de la aguja. Para el tamaño de punta uniforme, medir con un micrómetro, o comparar a una aguja de referencia.
- Llene la longitud de la aguja con aceite, usando la CellTram para empujar el aceite hacia abajo de la longitud, teniendo cuidado de evitar cualquier burbuja.
2. Preparación de los embriones
- Hacer agujeros en un 1% de agarosa al plato cubierto con una punta de pipeta 1-200 l, y eliminar bloques de agarosa. Rellene plato con los medios de embriones (hechas de acuerdo con Westerfield 25).
- Utilizando pinzas, embriones dechorionate bajo microscopio estereoscópico.
- Transferencia de embriones dechorionateden la fuente de agarosa recubierta.
- Para anestesiar embriones, añadir tricaína (0,1 mg / ml) a plato de agarosa hasta que dejan de moverse embriones (hecho de acuerdo con Westerfield 25).
3. Vaciado del ECSF
- Orientar los embriones con sus colas en los agujeros de la agarosa y sus lados posteriores más cercanos a la micromanipulador, permitiendo la visualización de la cara dorsal del cerebro.
- Colocar la aguja en el rhombomere 0/1 bisagra de punto o el punto más ancho de hindbrain ventrículo (Figura 1A).
- Con cuidado, perfore placa del techo del ventrículo cerebro posterior asegurándose de no pasar por la profundidad del cerebro en la yema.
- Vacíe el ECSF utilizando el CellTram y recoger el líquido en la aguja de microinyección. Tenga cuidado de evitar cualquier célula.
4. La recolección de la ECSF para el Análisis de Composición
- Una vez que el ECSF se recoge en la aguja, cuidadosamente detener la succión de la CellTram.
- MoVE el plato de debajo de la aguja y colocar la aguja cuidadosamente en un tubo que contiene el tampón deseado.
- Uso de la CellTram, drenar el ECSF de la aguja en el tampón tratando de evitar la contaminación de la solución con aceite.
- Con el fin de eliminar las células que se han aspirado junto con el ECSF ECSF, centrifugado a 10.000 x g. Recoger no contaminada ECSF (sobrenadante) y se almacena a -80 ° C hasta que esté listo para su posterior análisis.
5. La reintroducción de factores seleccionados
- Vacíe el ECSF cada 2 h durante el intervalo de tiempo deseado, ya que el líquido se repone dentro de ese período de tiempo. Entre los puntos temporales de drenaje, retire la aguja y almacenar los embriones a 28,5 ° C o temperatura deseada.
- Coloque la aguja micropipeta segundo factor de la prueba.
- Coloque la aguja en micromanipulador unido a microinyector.
- Ajustar el volumen de inyección de 1 nl midiendo el tamaño de gota en el tiempo de inyección de aceite y regulación y presión.
- Inyectar 1-2 nl en los ventrículos del cerebro como se ha descrito previamente 26.
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Representative Results
Un ejemplo de un ventrículo cerebral escurrido se muestra en la figura 1B-C. Ventrículos cerebrales se derrumbó ya que carecen de ECSF (Figura 1B vs C). Como se ve en las imágenes dorsales (Figura 1B-C, y la Figura 2A-D) del neuroepitelio hindbrain retiene su morfología característica y parece estar abierto a pesar de la falta de ECSF probable debido a las robustas de bisagras puntos. Sin embargo, las vistas laterales (Figura 2A'-D ') demuestran que el ventrículo hindbrain ha sido drenado, consistente con la presencia de un delgado epitelio flexible de la placa de techo que se derrumba ventralmente. En los embriones de tipo salvaje, ECSF se produce continuamente y rellena el cerebro ventrículos 2-3 h después de drenaje (Figura 2). Por lo tanto, CSF debe ser continuamente empobrecido sobre el tiempo de interés.
Mientras que la eliminación del fluido a las 24 HPF no interrumpa la morfología gruesa o el desarrollo, la eliminación de ECSF durante un largo per iod de desarrollo puede tener efectos adversos en el desarrollo de todo el cuerpo. Esto debe ser tenido en cuenta al determinar la eficacia de los factores inyectados en los ventrículos del cerebro. Además, para determinar si los defectos de desarrollo son un resultado de la pérdida de ECSF o debido a una aguja perfore el cerebro, un control importante es la inserción de una aguja en el cerebro sin quitar ECSF.
Hemos demostrado que ECSF tiene un perfil de proteína diferente de extracto de embrión de conjunto, y el análisis en un gel de proteína de SDS-PAGE demuestra que una cantidad detectable de proteína puede ser obtenida de pez cebra ECSF (Figura 3). Esto demuestra que neuroepiteliales contaminantes celulares son a niveles inferiores a proteínas específicas ECSF, y, además, que una cantidad sustancial de proteína puede ser recogido que es suficiente para el análisis de espectrometría de masas.
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Figura 1. Manualmente drenados ventrículos cerebrales. (A) Diseño Experimental. Lateral (izquierda) y dorsal (derecha) ve de dónde insertar la aguja de microinyección. Aguja (triángulo negro) se inserta en la placa de techo del ventrículo cerebro posterior en el punto más ancho de la parte posterior del cerebro. La aguja se inserta más en el cerebro medio y ventrículos del cerebro anterior según lo señalado por las flechas rojas. (BC) Ejemplos de 24 HPF manualmente drena embrión. El embrión misma imagen antes de drenaje (B) o después de desagüe (C). (B 'C') Trazos de BC. Línea gris indica la morfología presente pero no visible. F = cerebro anterior, cerebro medio = M, H = rombencéfalo. Las barras de escala = 50 micras.
Figura 2. ECSF recargas de los ventrículos cerebrales con el tiempo. (A) 24 hpf embrión antes de drenar (B) inmediatamente después de t = 0 (C) 15, (D) 60, (E) 120, (F) 180, (G) 240, y (h) 300 min (m) después de drenar. (AH) y dorsal (A'-H ') imágenes laterales luminoso con anterior a la izquierda. F = cerebro anterior, cerebro medio = M, H = rombencéfalo. Las barras de escala = 50 micras.
Perfil de la figura 3. Proteína varía entre 24 hpf todo embrión de pez cebra (WE) extracto (0,5 g de proteína total) y 24 hpf ECSF de 50 embriones. Tampón de carga SDS añadido al recogieron ECSF para desnaturalizar las proteínas de la muestra, se ejecutan en un gel PAGE 8% de Tris-HCl, y se detectaron con Sypro Ruby. * Indican bandas únicas para ECSF.
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Discussion
El uso de esta técnica para drenar manualmente ECSF desde los ventrículos del cerebro del pez cebra será útil para determinar el requisito de ECSF durante el desarrollo. Además, esta técnica permitirá descripción del perfil de proteínas ECSF en el curso del desarrollo embrionario. Identificación de proteínas diferentes durante este tiempo permitirá una mayor investigación en la función del CSF y su posible papel en el desarrollo cerebral. En amniotas, algunos factores identificados en ECSF (IGF2, FGF2, ácido retinoico, y apolipoproteínas) tienen un papel en la supervivencia demostró neuroepitelial celular, la proliferación y la neurogénesis 13,17,20,23,27,28. Sin embargo, parece que hay cientos de proteínas no caracterizadas en la ECSF, que se obtuvo después de la formación del plexo coroideo, más tarde que los puntos de tiempo se ha demostrado aquí. Además, nuestro laboratorio y otros han identificado mutantes de pez cebra con el tamaño anormal del ventrículo cerebral o defectos cerebrales 29-31, y VHA puedeanormalidades en la composición e ECSF y función. Este método permite fácilmente para aislar y probar ECSF anormal putativo de mutantes o bajo diferentes condiciones ambientales.
Una ventaja importante que el sistema de pez cebra es reemplazar factores seleccionados a través de la inyección en los ventrículos del cerebro después de la eliminación de ECSF, con lo que prueba su función durante el desarrollo del cerebro. Las pequeñas moléculas, proteínas y ECSF obtenidos después de la perturbación genética o química pueden ser probados. Reintroducción de ECSF de otras especies permitirá la comparación de factores y funciones entre especies y en diferentes condiciones patológicas, como la hidrocefalia, que complementa y su interconexión con los estudios de mamíferos. En resumen, el uso del pez cebra para eliminar ECSF, analizar su composición y reintroducir ECSF o factores específicos en los ventrículos cerebrales, aumentará significativamente la comprensión de la función y la regulación de la función ECSF y la del sistema ventricular del cerebro.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental, y la National Science Foundation. Un agradecimiento especial a la Dra. Jen Gutzman, la Dra. Amanda Dickinson y otros miembros del laboratorio Sive para muchas discusiones útiles y críticas constructivas, y Olivier Paugois para la cría de peces experto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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