Summary
Vi presenterar en metod för att samla cerebrospinalvätska (CSF) och att skapa ett system som saknar CSF inom den embryonala zebrafisk hjärnan ventrikulära systemet. Detta möjliggör ytterligare undersökning av CSF sammansättning och dess krav under embryonal hjärnans utveckling.
Abstract
Cerebrospinalvätska (CSF) är ett protein rik vätska som finns i hjärnan ventriklar. Det finns under tidig ryggradsdjur embryonal utveckling och kvarstår hela livet. Vuxen CSF tros dämpa hjärnan, ta bort avfall och bär utsöndrade molekyler 1,2. I vuxen och äldre embryot är majoriteten av CSF gjorts av koroidea plexus, en serie mycket vaskulariserade sekretoriska regioner belägna intill hjärnan kammare 3-5. I zebrafisk är koroidea plexus helt bildas vid 144 timmar efter befruktning (HPF) 6. Före detta, i både zebrafisk och andra ryggradsdjur embryon inklusive mus, en signifikant mängd av embryonal CSF (eCSF) är närvarande. Dessa uppgifter och studier inom chick tyder på att neuroepitelet är sekretoriska tidigt i utvecklingen och kan vara den största källan till eCSF före koroidea plexus utveckling 7.
eCSF innehåller ca tre gånger mer protein tHan vuxna CSF, vilket tyder på att det kan ha en viktig roll under utveckling 8,9. Studier på kyckling och mus visar att utsöndrade faktorer i eCSF, fluidtrycket, eller en kombination av dessa, är viktiga för neurogenes, genexpression, cellproliferation, och cellöverlevnad i neuroepitelet 10-20. Proteomik analyser av människa, råtta, mus och kyckling eCSF har identifierat många proteiner som kan vara nödvändiga för CSF-funktion. Dessa inkluderar extracellulära matriskomponenter, apolipoproteiner, osmotiska tryckreglerande proteiner, och proteiner involverade i celldöd och proliferation 21-24. Emellertid, de komplexa funktioner eCSF är till stor del okända.
Vi har utvecklat en metod för att ta bort eCSF från zebrafisk ventriklar i hjärnan, vilket möjliggör identifiering av eCSF komponenter och för analys av eCSF kravet under utveckling. Även om mer eCSF kan samlas in från andra ryggradsdjur system wed större embryon kan eCSF hämtas från de tidigaste stadierna av zebrafisk utveckling, och under genetiska eller miljömässiga förhållanden som leder till onormal hjärnans ventrikel volym eller morfologi. Rening och uppsamling av eCSF möjliggör masspektrometrisk analys, undersökning av eCSF funktion och återinförande av utvalda faktorer i ventriklarna att analysera deras funktion. Således tillgängligheten av den tidiga zebrafisk embryo möjliggör detaljerad analys av eCSF funktion under utveckling.
Protocol
1. Förbereda Mikroinjektion Stickor och Cell Tram
- Fyll Eppendorf CellTram olja microinjector apparat med mineralolja enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered mikroinjektion nålar genom att dra kapillärrör med Sutter instrument nål avdragare.
- Montera nålen mikromanipulator ansluten till Eppendorf CellTram.
- Bryt försiktigt spetsen på nålen. För jämn spets storlek, mäta med en mikrometer, eller jämföra med en referens nål.
- Fyll längden av nålen med olja, med hjälp av CellTram att pressa olja ner längden, var noga med att undvika bubblor.
2. Förbereda Embryon
- Peta hål i en 1% agaros belagd skålen med en 1-200 pl pipettspets, och avlägsna agaros pluggar. Fyll skålen med embryo media (tillverkad enligt Westerfield 25).
- Använd pincett, dechorionate embryon i stereomikroskop.
- Överför dechorionated embryonin agarosbelagda skålen.
- Att bedöva embryon, tillsätt Tricaine (0,1 mg / ml) till agaros skålen tills embryon slutar röra (tillverkad enligt Westerfield 25).
3. Tömning av eCSF
- Rikta in embryon med sina svansar i hålen i agaros och deras bakre sidor närmast mikromanipulator, vilket möjliggör visualisering av den dorsala sidan av hjärnan.
- Placera nålen på rhombomere 0/1 gångjärn-punkt eller den bredaste punkten bakhjäman kammare (Figur 1A).
- Försiktigt Pierce takplåt av bakhjäman kammare är säker på att inte gå igenom djupet av hjärnan i äggulan.
- Töm eCSF med CellTram och samla vätska i mikroinjektion nål. Var noga med att undvika celler.
4. Samla eCSF för komposition analys
- När eCSF samlas i nålen, försiktigt stoppa suget från CellTram.
- Move skålen ut från under nålen och försiktigt placera nålen i ett rör innehållande den önskade bufferten.
- Med hjälp av CellTram, dränera eCSF ut nålen i bufferten försöker undvika kontaminering av lösningen med olja.
- För att ta bort celler som du har aspirerade tillsammans med eCSF, spinn eCSF vid 10.000 x g.. Samla förorenat eCSF (supernatant) och förvara vid -80 ° C tills redo för vidare analys.
5. Återinförande av utvalda faktorer
- Töm eCSF var 2 timmar under önskad tidsintervall, eftersom fluiden fylls inom denna tidsperiod. Mellan dränering tidpunkter, ta ut nålen och lagra embryon vid 28,5 ° C eller önskad temperatur.
- Fyll 2:a mikropipett nål med test faktor.
- Placera nål i mikromanipulator bifogas microinjector.
- Justera injektionsvolym till 1 nl genom att mäta den minskade storleken på olja och justering insprutningstid och pressure.
- Injicera 1-2 nl i hjärnan ventriklar som beskrivits tidigare 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på en dränerad hjärna ventrikel visas i figur 1B-C. Brain ventriklarna ihop eftersom de saknar eCSF (Figur 1B mot C). Som framgår av dorsala bilder (Figur 1B-C och figur 2A-D) bakhjäman neuroepitelet behåller sin karakteristiska morfologi och verkar vara öppen trots brist på eCSF sannolikt på grund av robusta gångjärn-poäng. Men sidovyer (Figur 2A'-D) visar att bakhjäman kammare har tömts, i enlighet med närvaron av en tunn böjlig takplåt epitel som kollapsar ventralt. I vildtyp embryon är eCSF kontinuerligt produceras och fyller hjärnan ventriklar 2-3 timmar efter tömning (figur 2). Därför måste CSF att kontinuerligt utarmas med tiden av intresse.
Även avlägsnande av vätska vid 24 HPF inte stör grov morfologi eller utveckling, borttagning av eCSF under en längre per IOD utveckling kan ha negativa effekter på hela kroppen utveckling. Detta bör beaktas vid fastställandet av effekten av faktorer som injiceras i hjärnan ventriklar. Vidare, för att avgöra huruvida utvecklingsdefekter är ett resultat av förlust av eCSF eller på grund av en nål punktering hjärnan, är en viktig kontroll insättning av en nål in i hjärnan utan att ta bort eCSF.
Vi visade att eCSF har ett annat protein profil än hela embryo extrakt och analys på en SDS-PAGE proteingel visar att en detekterbar mängd protein kan hämtas från zebrafisk eCSF (Figur 3). Detta visar att neuroepiteliala cellulära föroreningar är på en lägre nivå än eCSF specifika proteiner, och vidare att en väsentlig mängd protein kan uppsamlas som är tillräcklig för masspektrometrianalys.
3/4243fig1.jpg "/>
Figur 1. Manuellt dränerade ventriklar i hjärnan. (A) Experimentell design. Lateral (vänster) och dorsal (höger) ser om var att sätta mikroinjektion nål. Nål (svart triangel) är insatt i takplåten för bakhjäman ventrikeln vid den bredaste punkten av bakhjäman. Nålen sedan vidare in i mellanhjärnan och ventriklarna framhjärnan som utsetts av de röda pilarna. (BC) Exempel på 24 HPF dräneras manuellt embryo. Samma embryo avbildas före tömning (B) eller efter avloppet (C). (B'-C) kurvor i BC. Grå linje anger morfologi närvarande men inte syns. F = framhjärna, M = mitthjärnan, H = bakhjäman. Skala barer = 50 pm.
Figur 2. ECSF fyller hjärnan kammare över tiden. (A) 24 HPF embryo innan tömning (B) omedelbart efter t = 0 (C) 15, (D) 60, (E) 120, (F) 180, (g) 240, och (H) 300 minuter (m) efter avrinning. (AH) Dorsal och (A'-H ') laterala bilder ljusfält med främre till vänster. F = framhjärna, M = mitthjärnan, H = bakhjäman. Skala barer = 50 pm.
Figur 3. Protein profil skiljer mellan 24 HPF hela zebrafisk embryo (WE) extrakt (0,5 g totalt protein) och 24 HPF eCSF från 50 embryon. SDS-laddningsbuffert tillsattes till insamlade eCSF att denaturera proteiner, prov körs på en 8% Tris-HCl-PAGE-gel, och detekterades med SYPRO Ruby. * Indikerar band unika för eCSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användning av denna teknik för att manuellt tömma eCSF från zebrafisk ventriklar i hjärnan kommer att vara användbart för att fastställa krav på eCSF under utveckling. Dessutom kommer denna teknik tillåter beskrivning av eCSF proteinprofilen under loppet av embryonal utveckling. Identifiering av olika proteiner under denna tid kommer att möjliggöra ytterligare utredning funktion av GSR och dess potentiella roll under hjärnans utveckling. I amnioternas, några faktorer som identifierats i eCSF (IGF2, FGF2, retinsyra och apolipoproteiner) har en påvisad roll i neuroepiteliala cellöverlevnad, spridning och neurogenes 13,17,20,23,27,28. Men det verkar vara hundratals okarakteriserade proteiner i eCSF, som erhölls efter koroidea plexus bildning, senare än tidpunkter visas här. Dessutom har vårt labb och andra identifierade zebrafisk mutanter med onormal hjärnans ventrikel storlek eller fel i hjärnan 29-31, och kan HAVe avvikelser i eCSF sammansättning och funktion. Denna metod gör lätt för att isolera och testa förmodade onormal eCSF från mutanter eller under olika miljöförhållanden.
En kraftfull användning av zebrafisk är att ersätta utvalda faktorer via injektion i hjärnan ventriklar efter avlägsnande av eCSF därmed testa deras funktion under hjärnans utveckling. Små molekyler, proteiner och eCSF erhållna efter genetisk eller kemisk störning kan testas. Återinförande av eCSF från andra arter kommer att tillåta jämförelse av faktorer och funktioner över arter och under olika sjukdomstillstånd, såsom hydrocefalus, kompletterar och samverkar med däggdjur studier. Sammanfattningsvis användning av zebrafisk att ta bort eCSF, analysera dess sammansättning och återinföra eCSF eller specifika faktorer i hjärnan ventriklar, kommer att avsevärt öka förståelsen roll och reglering av eCSF funktion och att i hjärnan ventrikulära systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det nationella institutet för mental hälsa, och National Science Foundation. Särskilt tack till Dr Jen Gutzman, Dr Amanda Dickinson och andra SIVE medlemmar lab för många nyttiga diskussioner och konstruktiv kritik, och Olivier Paugois för sakkunnig fisk djurhållning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
