Summary
我们提出了一种简单的方法来施加类似的动态条件下，以多个不同的菌株，能够产生的微流体装置，而不需要一个干净的房间或软光刻。
Abstract
细胞的反应，环境变化的研究，提出了许多实验的挑战：细胞需要将被成像在变化的条件下，往往在一个比较的方式。多孔板经常使用的比较多的不同株或细胞系，但允许有限的环境动态控制。微流体装置，在另一方面，在周围条件允许精致的动态控制，但它是具有挑战性的图像和区分超过在其中少数菌株。在这里，我们描述了一种方法，容易且迅速地制造的微流体装置，其能够应用动态地改变的条件下，在一个通道中的多个不同的酵母菌株。通过简单的装置，该装置的设计和制造，而不需要为软光刻技术。它是由一个Y形的流路连接到的第二层窝藏微孔。该菌株中被放置在单独的微孔，并且确切的相同的动态条件下成像。我们试玩nstrate测量蛋白定位的反应在不同的酵母菌株的养分的变化的脉冲的移动设备的使用。
Introduction
细胞不断动态变化的环境的反应，通过改变他们的新陈代谢，基因表达谱和细胞功能。为了研究这些现象，可以量化这种变化的方法是必要的。一种类型的读出这样的回答是本地化的压力相关的转录因子中的营养应激反应的变化。
微流体装置1已被用来动态操作环境条件的细胞2-4。他们提出活细胞成像的几个优点：细胞的环境，可以精确地控制和动态地改变，细胞可以是活成像在所有时间，包括操纵外部条件期间;及需要最小的试剂量。一个非常简单的微流体设备的设计，允许两个条件之间的交替，是一个Y形的装置2。我们经常使用Y形微流体装置，让在通道中的细胞的动态变化的应用。我们使用该设备遵循荧光标记的压力相关的转录因子在酵母细胞中的定位变化。我们遵循这些变化在不断变化的营养条件下。例如，我们可以提供一个脉冲（或一系列脉冲）的期限内没有葡萄糖培养基含葡萄糖的介质，在一个非常良好的时间分辨率。通常在这样的实验中，一个是兴趣比较不同的细胞株（例如，不同的突变体，或不同的野生分离株）的响应。 Y形通道被限制在每个通道中的一个应变 - 如果使用不止一个应变，有没有简单的方法来区分菌株。为了克服这个问题，可以使用不同的渠道。如果我们要采用相同的动力条件下多株，我们希望与多渠道结合的Y-通道的概念。在实施这一解决方案有两个挑战：这是很难申请吨他相同的条件的所有信道在同一时间，并且有一个几何的，可以安装在一台设备中的Y通道的数目的限制。因此，我们在寻找一种方式来查看动态条件下几株在一个通道中。
在这里，我们描述的两层用于与多株成像动态条件下的相同的在一个通道中的微流体装置。底层由薄的PDMS与一排孔。这层附着的玻璃盖玻片创建的井到其中的将放置在不同的菌株，附着与伴刀豆球蛋白A至玻璃。第二层是一个Y形的微流体装置，使用透明胶带方法5。第二层的孔中放置的菌株后快速地对准并连接到第一个，建立一个信道与包含不同菌株的多口井。这最后的设备允许以下几个品系在一个通道中，所有的菌株被精确地在同一时间进行的相同的条件。在台式仪器上可以完成整个设计和生产过程中，使用简单的方法，没有软光刻技术。
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Protocol
1。创建苏格兰带硕士5
- 绘制或打印出所需的微布局，扩大规模，在纸面上。在我们的例子中，设计是由两个Y形通道，每个通道3毫米宽（ 图2）。
- 盖一个玻璃滑了一层层的透明胶带。层的数目，将确定的信道（每一层约60微米）的高度。我们用透明胶带层。
- 放置在平坦表面上的布局设计。将滑过的设计模式。小心地切割胶带在载玻片上，用解剖刀，根据该布局来。
- 从各地区的载玻片，但在布局的微取出透明胶带。
- 滑动，在65℃的加热烘箱中放置2-3分钟。与乙醇，轻轻地擦拭。
2。 PDMS微流控芯片制造
- 混合基料和固化组件的PDMS，如制造商推荐的。我们用一个10:1的碱与固化剂的比率。倒入约30毫升的PDMS混合物倒入一个Petri培养皿〜0.5厘米的高度。脱气PDMS在真空中，如果需要的话。被淹没的载玻片上，在PDMS与图案的透明胶带朝上。名次后的图案的PDMS，防止形成气泡之间的滑动和培养皿底部。在65°C固化48小时，确保菜是使用气泡水平仪水平。
- 在一个新的90毫米陪替氏培养皿中倒入3毫升的PDMS混合，从而导致在约0.5mm深的层。 （如果旋涂机是可用的，它可以被用于这个阶段）。
- 德加和治疗为2.1。
- 轻轻切出的微流体装置，用手术刀到所需的大小。该层将被称为“流层”。
- 切出一个同样大小的一块薄薄的一层PDMS从第二培养皿。这将被称为“井层”。
- 使用适当大小的活检打孔器（我们使用1.2毫米ID）打孔流层的入口和出口的。 将井层很厚的玻璃滑动的设计布局和切出井，使用2毫米的ID活检冲床，对准与微通道的布局。
- 清洁都PDMS层以及24毫米×60毫米盖玻片乙醇。空气干燥，保持清洁。
- 等离子体治疗盖玻片和势阱层的PDMS可逆结合使用标准的等离子蚀刻机（非可逆结合）或手持式电晕6。小心地置于盖玻片上的势阱层，导致粘合性（ 图3）。轻轻揉搓出任何气泡（如果需要的话）。
3。细胞成像实验
- 请确保您有所需的媒体准备在适当灵活的塑料管连接到内部直径0.02“（聚乙烯），注射泵的注射器。
- 成长S.酵母菌株在液体YPD所需的相位。涡彻底和300μl的每种菌株到一个离心管中。
- 轻轻放置1μl的刀豆蛋白A（σ）2毫克/毫升到各孔中。洗出多余的伴刀豆球蛋白A每口井的两倍，，轻轻吹打水。
- 伴刀豆球蛋白A的干燥，洗株300μL的SC中缺乏葡萄糖的两倍。洗衣机从细胞壁中的残糖有助于正确地坚持刀豆A.
- 涡细胞彻底。移液器0.75μl以下到它自己的井（ 图3）的各细胞悬浮液。轻轻地洗出残留的细胞与营养丰富的培养基。接下来的两个步骤需要迅速地进行，以防止干燥的细胞。
- 等离子处理芯片和彻底的井使用的手持式电晕，小心不要直接打的井。小心地放置在芯片上井，密切关注两者之间的对齐方式（这一步可以做到立体镜）。轻轻按下坚持的两层PDMS。慢慢补装置完全与约50微升丰富的介质，确保没有气泡留在车内的通道。
- 将设备连接到适当的进气口，插入管，并开始媒体流。护理，没有气泡被引入到该装置，因为这些可能会非常棘手中删除，这可以通过断开入口或出口，并轻轻拍打在设备上的气泡，小心，不要破坏盖玻片。
- 将在显微镜下找到合适的成像点在每口井。
- 丰富的介质流动下保持细胞为1小时或更长的时间，以允许恢复，如果需要的话。
- 开始实验：我们使用从每个的两个注射器泵的恒定流量，以防止逆流的媒体，作为所需的改变相对流速。设置泵A到0.8毫升/小时，泵B，以0.2毫升/小时的查询结果的一种可流动的通道（ 图4）的宽度的80％以上的培养基中。这可以是动态Ç忌用改变流速。在新的条件稳定在几秒钟内，沿其整个长度的信道2。
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Representative Results
为了说明不同菌株之间的分离，我们拍摄了两个区分的酵母菌株在备用井。成像的完整井没有显示出细胞的孔中（ 图5a，b）之间的泄漏。这两种菌株有的转录因子MSN2标记与YFP。要测试的同时动态地改变的条件的影响，我们在两个输入信道切换的流 率，创建无葡萄糖培养基，导致本地化MSN2-YFP的核（ 图5c，四 ）的步骤。在所有的孔测量的响应发生在相同的时间，示出的移动设备可用于并发动态条件应用到多个井。
图1。移动设备设计，该装置是由一个盖玻片，薄的“井”层和“流”层管是conne反恐执行局。
图2。流层设计。苏格兰磁带模具的这一层。在这里，我们用了两个相反方向的Y形通道。
图3。韦尔斯层。PDMS与冲压出的井的薄层粘附到玻璃盖玻片。然后，刀豆蛋白A被放置在各孔中，并使其干燥。的细胞，然后加载到10口井。
图4。控制通道覆盖覆盖的Y通道，其宽度的一个特定的部分的两个输入端的相对流速，通过控制与培养基A与介质B（一）左陈荫罴 EL：流动0.8ml/hr（红色）和0.2毫升/小时（清除）的结果在80％/ 20％的覆盖率。右声道：流动两种介质在0.5毫升/小时50％/ 50％的覆盖率。 （二）10％/ 90％，50％/ 50％和90％/ 10％的流速的设备与摄影。
图5。动态与多个酵母菌株的实验 （一，二）全井井的图像含有酵母细胞与（b）或没有（一）HTB2 Mcherry标记，表示没有细胞井之间的泄漏。 （C，D）响应两口井的细胞中，在t = 0到无葡萄糖步骤。 MSN2-YFP的工序后，在同一时间，定位于细胞核展示两口井的同时媒体的变化。 （e）时间轨迹核MSN2-YFP的在单细胞水平分析从一个势阱（C，D）中。/ ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
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Discussion
在本文中，我们提出了一个简单的台式的方法创建一个微流体装置，同时允许以下几个酵母菌株，在动态条件下。经过数株在一个通道中，提供了一个可靠的工具比较多株的单细胞反应的动力学。我们的方法的一个优点是能够用简单的技术来制造的移动设备，而不需要一个干净的房间。事实上，我们也进行了协议跳绳等离子处理操作（步骤2.9和3.6），并取得了良好的效果，所以没有任何等离子设备的实验室仍然可以执行协议。
通过播种每个在其自己的不同菌株以及我们避免细胞的移动设备的组装过程中的混合，同时仍然允许介质的流动，在实验过程中达到的细胞。在该协议中的一个关键点是不是让细胞变干，再回流介质对他们（步骤3.4 - 3.6）。 Dryin克了严重影响细胞的生存能力，而试图关闭的设备太多介质两者之间的PDMS层粘连问题在每一个较好的结果。这些约束迫使我们离开井层的设备，而不是把它剥开后的细胞定居在他们的斑点。井层，因此，具有足够深，包含最初的液滴接种细胞，但尽可能地薄，因此，各孔的纵横比允许介质的流动，以达到它们的底部和细胞得到通过直接流动的外部信号。
的装置，在这里，我们将描述被限制到约5株每通道。我们经常在创建设备与反对方向性的两个相邻的Y通道（ 图2）。虽然这可以扩展到更多的频道，或更多的井，每通道，它仍然是不高通量的VLSI（超大规模集成电路）式的装置7，到目前为止还没有被应用到活细胞。，但是，我们注意到，因为此设备的主要目的是要受到不同的菌株相同的条件下成像的反应，有限制的同时成像，从数株茎成像，无论设备实现：菌株有高倍率，要成像的顺序，因此，更多的菌株成像，较大的时间差之间的第一个和最后一个应变成像。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
将YG支持IDB的奖学金。 IN是一种的阿龙研究员和教员的爱德蒙Ĵ。 萨夫拉在特拉维夫大学生物信息学中心这项研究是支持的通过ISF授予1499年至1410年。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
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