En mikrofluid enhed for at studere flere forskellige stammer

Summary

Vi præsenterer en enkel fremgangsmåde til fremstilling mikrofluidenheder stand til at anvende lignende dynamiske betingelser til flere forskellige stammer, uden behov for et rent rum eller blød litografi.

Abstract

Studiet af celle-reaktioner på miljøforandringer rejser mange eksperimentelle udfordringer: celler skal afbildes under skiftende vilkår, ofte i en sammenlignende måde. Flerbrøndsplader anvendes rutinemæssigt til at sammenligne mange forskellige stammer eller cellelinier, men tillader begrænset kontrol over miljøet dynamik. Mikrofluidenheder, på den anden side giver udsøgt dynamisk kontrol over de omgivende betingelser, men det er udfordrende at billede og skelne mere end nogle få stammer i dem. Her beskriver vi en fremgangsmåde til let og hurtigt at fremstille en mikrofluid anordning, der kan anvende dynamisk skiftende betingelser til flere forskellige gærstammer i en kanal. Anordningen er designet og fremstillet med enkle midler uden behov for blød litografi. Den består af en Y-formet strømningskanal fastgjort til et andet lag, der huser mikrobrønde. Stammerne anbringes i separate mikrobrønde, og afbildet på nøjagtig samme dynamiske betingelser. Vi demonstrate brugen af ​​anordningen for måling af protein-lokalisering reaktioner på impulser af næringsstoffer ændringer i forskellige gærstammer.

Introduction

Celler er konstant at reagere på en dynamisk skiftende miljø, ved at ændre deres stofskifte, transkriptionelle profil og cellulære funktioner. For at undersøge disse fænomener, er metoder, der kan kvantificere sådanne ændringer er nødvendige. En type af udlæsning til sådanne reaktioner er ændringen i lokaliseringen af ​​stressrelaterede transkriptionsfaktorer som reaktion på ernæringsmæssig stress.

Mikrofluidenheder ¹ er blevet anvendt til dynamisk at manipulere miljømæssige betingelser til celler ^2-4. De præsenterer en række fordele for levende celler: miljøet af cellerne kan styres præcist og dynamisk ændret, celler kan være live-afbildes på alle tidspunkter, også under manipulation af eksterne forhold, og minimale reagens volumener er påkrævet. En meget enkel udformning for en mikrofluid anordning, der tillader veksling mellem to betingelser, er en Y-formet indretning ^2. Vi rutinemæssigt bruger Y-formede mikrofluidenheder enheder, der tilladerAnvendelsen af ​​dynamiske ændringer i cellerne i kanalen. Vi bruger denne enhed til at følge lokalisering ændringer i fluorescens mærkede stress relaterede transkriptionsfaktorer i gærceller. Vi følger disse ændringer under skiftende ernæringsmæssige forhold. For eksempel kan vi tilvejebringe en impuls (eller række af impulser) i glucose-holdigt medium i løbet af no-glucose medium ved en meget fin tidsmæssig opløsning. Ofte i sådanne forsøg, man er interesseret i at sammenligne responser af forskellige cellestammer (for eksempel forskellige mutanter eller forskellige vilde isolater). Den Y-formede kanal er begrænset til en stamme i hver kanal - hvis der er mere end en stamme der anvendes, er der ingen simpel måde at skelne mellem stammerne. For at overvinde dette, kan forskellige kanaler anvendes. Hvis vi ønsker at anvende de samme dynamik betingelser til flere stammer, vil vi gerne kombinere Y-kanal koncept med flere kanaler. Der er to udfordringer i gennemførelsen af ​​denne løsning: Det kan være svært at anvende tHan samme betingelser på samme tid til alle kanaler, og der er en geometrisk begrænsning af antallet af Y-kanaler, der kan monteres i en enkelt anordning. Vi var derfor på udkig efter en måde til visning adskillige stammer i en kanal under dynamiske forhold.

Her beskriver vi en to-lags mikrofluid anordning beregnet til afbildning af flere stammer i én kanal under de samme dynamiske betingelser. Det nederste lag består af tyndt PDMS med en række huller. Dette lag er fastgjort til dækglas skaber brønde, som vi vil placere de forskellige stammer, klæbe dem med concanavalin A til glasset. Det andet lag er en Y-formet mikrofluid enhed oprettet med tape metode ^5. Efter anbringelse af stammerne i brøndene det andet lag hurtigt justeret og fastgjort til den første, hvilket skaber en kanal med flere brønde, der indeholder de forskellige stammer. Denne endelige enhed giver efter flere stammer i én kanal, hvor allestammer underkastes de samme betingelser på samme tid. Hele design-og produktionsprocessen kan gøres på i laboratoriet, med enkle midler, med ingen blød litografi.

Protocol

1. Oprettelse af en Scotch-tape Master ⁵

1. Tegn eller udskrive den ønskede mikrokanalplade layout, at skalere, på papir. I vores tilfælde udformning består af to Y-formede kanaler, som hver 3 mm bred (fig. 2).
2. Dæk et glas-slide med lag af tape. Antallet af lag vil bestemme højden af ​​kanalen (ca. 60 um per lag). Vi brugte 3 tape lag.
3. Placer layout design på en flad overflade. Juster glider hen over design mønster. Skær forsigtigt tapen på objektglasset med en skalpel i henhold til layoutet.
4. Fjern Scotch tape fra alle regioner i objektglas undtagen dem i opstillingen af ​​mikrokanalplade.
5. Placér i en varmeovn ved 65 ° C i 2-3 min. Rengør forsigtigt med ethanol.

2. Opdigte en PDMS mikrofluid enhed

1. Bland basen og hærdende bestanddele af PDMS som anbefalet af fabrikanten. Vi anvender en 10:1mellem base til hærdemiddel. Hæld ca 30 ml PDMS blandingen i en petriskål til en højde på ~ 0,5 cm. Afgasse PDMS i vakuum hvis nødvendigt. Nedsænkes objektglas i PDMS med den mønstrede Scotch tape opad. Placering af mønsteret efter PDMS forhindrer dannelsen af ​​luftbobler mellem slæden og parabol bund. Cure i 48 timer ved 65 ° C, og sørg for fadet er vandret ved hjælp af et vaterpas.
2. I et nyt 90 mm petriskål hældes 3 ml PDMS blanding, hvilket resulterer i et lag omkring 0,5 mm dybe. (Hvis en spin coater er tilgængelig, kan den anvendes til dette trin).
3. Afgasses og hærde som i 2.1.
4. Forsigtigt skåret ud mikrofluid enhed til den ønskede størrelse med en skalpel. Dette lag vil blive betegnet som "flow lag".
5. Klip et tilsvarende størrelse stykke tyndt lag PDMS fra den anden petriskål. Dette vil blive betegnet som "brønde lag".
6. Brug en passende størrelse biopsi puncher (Vi bruger 1,2 mm ID) til huller til ind-og udløb i flow lag. Placer brøndene lag på en tyk glasplade over design layout og punch ud brønde, under anvendelse af 2 mm ID biopsi Hullemaskine, på linie med mikrokanaler på layoutet.
7. Rens begge PDMS lag og en 24 mm x 60 mm dækglas med ethanol. Lufttørre og holde rene.
8. Plasma behandle både dækglas og brøndene laget PDMS under anvendelse af enten standard plasma etcher (for ikke-reversibel binding) eller en håndholdt corona treater ⁶ til reversibel binding. Anbring forsigtigt brøndene lag oven på dækglasset at bevirke adhæsion (figur 3). Gnid forsigtigt ud eventuelle luftbobler (hvis nødvendigt).

3. Cell Imaging Experiment

1. Sørg for at du har det ønskede medie klar i passende sprøjter forbundet med fleksible plastrør med en indre diameter på 0,02 "(Tygon) i sprøjtepumpen.
2. Grow S. cerevisiae-stammer til den ønskede fase i flydende YPD. Vortex grundigt og anbringes 300 μl af hver stamme til et mikrocentrifugerør.
3. Blidt sted 1 ml af Concanavalin A (Sigma) 2 mg / ml i hver brønd. Vask ud overskydende Concanavalin A fra hver brønd to gange ved forsigtigt at pipettere vand.
4. Mens Concanavalin A tørrer, vaskes stammer to gange med 300 pi SC medium uden glucose. Vask restglucose fra cellevæggene hjælper ordentlig overholdelse af Concanavalin A.
5. Vortex celler grundigt. Pipette 0,75 pi eller mindre af hver cellesuspension til sin ret godt (figur 3). Vask forsigtigt ud resterende celler med rigt medium. De næste to trin skal udføres hurtigt for at forhindre celler i at tørre ud.
6. Plasma behandle chip og brøndene grundigt via den håndholdte corona treater, at man passer på ikke at ramme brøndene direkte. Placer forsigtigt chip på brøndene, meget opmærksom på tilpasningen mellem de to (dette trin kan gøres under et stereoskop). Tryk forsigtigt at klæbe de to lag af PDMS. Langsomt fyldes enheden helt med omkring 50 pi rigt medium, og sørg for ingen luftbobler efterlades inde i kanalen.
7. Tilslut enheden, indsætte rørene i de passende indløb og starte medier flow. Pas på, at ingen luftbobler introduceres i enheden, da disse kan være vanskelig at fjerne, hvilket kan opnås ved at afbryde et indløb eller udløb og forsigtigt banke på den enhed, hvor boblerne er, at man passer på ikke at bryde dækglas.
8. Placer under mikroskop og finde passende billeddiagnostisk point i hver brønd.
9. Holde cellerne i rigt medium flow i 1 time eller længere at kunne gendanne hvis nødvendigt.
10. Starte eksperimentet: vi bruger konstant strømning fra hvert af de to sprøjtepumper at forhindre tilbagestrømning af mediet, ændrer relative strømningshastigheder som ønsket. Indstilling pumpe A til 0,8 ml / time og pumpe B til 0,2 ml / time resulterer i medium A strømmer over 80% af bredden af kanalen (figur 4). Dette kan være dynamisk chængt ved at ændre de to strømningshastigheder. De nye stabiliserer inden for sekunder langs den fulde længde af kanalen ^2.

Representative Results

For at demonstrere adskillelsen mellem forskellige stammer vi afbildet to skelnelige gærstammer i skiftende brønde. Imaging hele brønde viser ingen celle lækage mellem brøndene (figur 5a, b). Begge stammer har transkriptionsfaktoren MSN2 mærket med YFP. For at teste den samtidige virkning af dynamisk skiftende betingelser, vi skiftet strømningshastighederne i de to indgangskanaler, hvilket skaber et trin no-glucose medium, hvilket resulterede i lokaliseringen af MSN2-YFP til kernen (fig. 5c, d). Responset målt ved alle brøndene skete samtidig, viser indretningen kan anvendes til påføring af samtidige dynamiske forhold til flere brønde.

Figur 1. Enheden design. Indretningen består af et dækglas, en tynd "Wells"-lag og et "Flow"-lag, hvortil slangen er ConneCTED.

Figur 2. Flow lag design. En scotch-tape støbeform er lavet til dette lag. Her har vi anvendt to Y-formede kanaler modsatte retninger.

Figur 3. Wells lag. Det tynde lag PDMS med udstansede huller er klæbet til et dækglas. Derefter ConA er anbragt i hver brønd og får lov at tørre. Celler derefter sat til de 10 brønde.

Figur 4. Kontrolleret kanaldækning. Ved at styre de relative strømningshastigheder af de to indgange på en Y-kanal, en særlig del af dens bredde er dækket med medium A vs medium B. (a) Venstre CHANN EL: Flowing på 0.8ml/hr (rød) og 0,2 ml / time (klar) resulterer i 80% / 20% dækning. Højre kanal: Flowing begge medier på 0,5 ml / time resulterer i 50% / 50% dækning. (B) Fotografier af indretningen med 10% / 90%, 50% / 50% og 90% / 10% strømningshastigheder.

Figur 5. Dynamisk eksperiment med flere gærstammer. (A, b) Hel-brønds billeder af brønde indeholdende gærceller med (b) eller uden (a) HTB2-Mcherry tagging, der viser ingen celle lækage mellem brønde. (C, d) reaktion af cellerne i to brønde i en ikke-glucose trin ved t = 0. MSN2-YFP lokaliserer til nucleus på samme tid efter trinet, hvilket viser samtidige udskiftning af medium i de to brønde. (E) Time-spor af nukleare MSN2-YFP trin i hele celler analyseret fra en af ​​brøndene i (c, d)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Discussion

I denne afhandling præsenterer vi en simpel benchtop metode til at skabe en mikrofluid enhed, som giver følgende adskillige gærstammer samtidigt under dynamiske forhold. Efter adskillige stammer i en kanal tilvejebringer et pålideligt værktøj til at sammenligne dynamik enkelt celle-responser i flere stammer. Én fordel ved vores metode er evnen til at fremstille enheden med enkle teknikker uden behov for et rent rum. Faktisk har vi også gennemført protokollen springe plasma behandling (i trin 2,9 og 3,6) og fik gode resultater, så labs uden plasma udstyr kan stadig udføre protokollen.

Ved at pode hver af de forskellige stammer i sig selv godt undgår vi celle blanding under samlingen af ​​indretningen, og stadig give mediumstrøm til at nå cellerne under eksperimentet. Et kritisk punkt i denne protokol er ikke at lade cellerne tørre ud før reflowing medium over dem (trin 3,4 til 3,6). Drying ud alvorligt påvirker cellernes levedygtighed, mens du prøver at lukke enheden med for meget medium på hver brønd resultater i vedhæftningsproblemer mellem de to PDMS lag. Disse begrænsninger tvinger os til at forlade brøndene lag i enheden, snarere end skræl det ud efter at cellerne har bosat sig i deres sted. Brøndene laget derfor skal være dyb nok til at indeholde den første dråbe af podede celler, men så tynde som muligt, således at billedformatet af brøndene tillader mediestrøm at nå deres bund, og cellerne får eksterne signaler via direkte strømning.

Anordningen, som er beskrevet her, er begrænset til omkring 5 stammer per kanal. Vi rutinemæssigt oprette enheder med to tilstødende Y kanaler på modstående directionalities (figur 2). Mens dette kan udvides til et par flere kanaler, eller et par mere brønde per kanal, er det stadig ikke så højt gennemløb som nogle af de VLSI stil enheder ^7, der hidtil ikke har været anvendt på levende celler.Vi bemærker dog, at eftersom hovedformålet med denne enhed er at underkaste forskellige stammer til præcis de samme vilkår, mens billeddannelse deres svar, er der begrænsninger for samtidig billeddannelse, der stammer fra antallet af stammer afbildet, uanset enhedens implementering: på stor forstørrelse, stammer skal afbildes sekventielt, således at flere stammer afbildes, jo større er de tidsforskelle for billeddannelse mellem den første og sidste stamme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS- SYLGARD 184	Dow Corning USA
Vacuum desiccator	Nalgene	5310-0250
Biopsy punchers	Ted Pella Inc.	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm)
Syringe pumps	Chemyx	Fusion 200
Corona treater	Electro-technic products	BD-20
Tygon tubing	Tygon	S-54-HL
Concanavalin-A	Sigma	C7275
Scotch tape	3M Scotch	Transparent Tape 1/2"