Summary
私たちは、クリーンルームやソフトリソグラフィーを必要とせずに、複数の異なる株に類似した、動的な条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造するための簡単な方法を提示する。
Abstract
環境変化への細胞応答の研究は、多くの実験的な課題があります。セルは、比較の方法で、多くの場合、変化する条件の下で撮像する必要があります。マルチウェルプレートは、日常的に多くの異なる株または細胞株を比較するために使用されるが、環境動態の制御は制限付きで許可されています。マイクロ流体デバイスは、他の一方で、周囲の条件で絶妙な動的な制御を可能にするが、それはイメージに挑戦し、それらのいくつかの菌株よりも区別されています。ここでは、簡単かつ迅速に一つのチャンネルに複数の異なる酵母菌株に動的に変化する条件を適用することができるマイクロ流体デバイスを製造する方法について述べる。デバイスは、ソフトリソグラフィーを必要とせずに簡単な手段によって設計され、製造されています。それは、マイクロウェルを宿す第二層に付着したY字型の流路で構成されています。菌株は、独立したマイクロウェル内に置かれ、まったく同じ動的条件下で結像される。我々は、デモ異なる酵母菌株の栄養変化のパルスにタンパク質局在応答を測定するためのデバイスの使用をnstrate。
Introduction
細胞は絶えず新陳代謝、転写プロファイルと細胞機能を変化させることにより、動的に変化する環境に反応している。これらの現象を研究するために、そのような変化を定量化することができる方法が必要とされる。そのような応答のための読み出しの一つのタイプは、栄養ストレスに応答して、ストレスに関連する転写因子の局在の変化である。
マイクロ流体デバイス1は、動的にセル2-4環境条件を操作するために使用されてきた。細胞の環境を正確に制御し、動的に変更することができます。細胞は外部条件の操作時も含めて、常時、ライブ画像化することが可能であり、最小限の試薬の量が必要とされています：彼らは、ライブセルイメージングのためのいくつかの利点を提示する。マイクロ流体デバイスのための非常にシンプルなデザインは、2つの条件の間に交替できるように、Y字型装置2です。我々は日常的にできるようにY字型のマイクロ流体デバイスを使用チャンネル内のセルを動的に変更したアプリケーション。我々は、酵母細胞内で蛍光標識されたストレス関連転写因子の局在の変化に追従するために、このデバイスを使用します。私たちは、栄養条件を変更するの下でこれらの変更を行います。たとえば、我々は非常に細かい時間分解能では、no-グルコース培地の期間内に媒体をグルコース含有のパルス（または一連のパルス）を提供することができる。しばしば、このような実験では、1つは、異なる細胞株（例えば、別の変異体、または異なる野生分離株）の応答を比較することに興味を持っています。 Y字型チャネルは、各チャネルに1株に限られている - 複数の菌株を使用する場合は、系統を区別する簡単な方法はありません。これを克服するために、異なるチャンネルを使用することができます。我々は複数の系統に同じ力学条件を適用したい場合、我々は、複数のチャネルとYチャネルの概念を組み合わせるしたいと思います。このソリューションを実装するには2つの課題があります：それはtを適用することは難しいことができます彼はすべてのチャンネルに同時に同じ条件、一つのデバイスに取り付けることができ、Yチャネル数に幾何学的な限界がある。そこで我々は、動的条件下で一つのチャンネルに複数の系統を表示するための方法を探していました。
ここでは、同じ動的条件下で1チャンネルでの撮像複数の株を対象とし、二層マイクロ流体デバイスを記述します。最下層は、穴の列に薄いPDMSから構成されています。この層は、我々はガラスにコンカナバリンAでそれらを付着し、異なる菌株を配置先となるウェルを作成するカバーガラスに装着されている。第二層はスコッチテープ法5を使用して作成されたY字型のマイクロ流体デバイスです。ウェル内で株を配置した後第二層は、迅速に整列され、最初の1に取り付けられた、異なる株が含まれている複数のウェルを有する一つのチャネルを作成します。この最終的なデバイスは、一つのチャンネルで複数の株に続いて、ここですべてのことができます株はちょうど同じ時間に同じ条件にさらされています。全体の設計と製造プロセスがないソフトリソグラフィと、簡単な手段を用いて、ベンチトップで行うことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。スコッチテープマスターの作成5
- 紙の上で、拡大し、希望するマイクロチャネルのレイアウトを描画したり、プリントアウトする。我々のケースでは、設計は2つのY字型チャネル、ワイド各3ミリメートル（ 図2）から構成されています。
- スコッチテープの層を持つガラススライドをカバーしています。層の数は、チャネル（層当たり約60μm）の高さを決定します。私たちは3スコッチテープ層を使用していました。
- 平らな面にレイアウト設計を置きます。デザインパターンオーバースライドの位置を合わせます。注意深くレイアウトに従ってメスでスライドガラス上にテープを切った。
- マイクロチャネルのレイアウトのものを除き、スライドガラスのすべての地域からセロハンテープを取り外します。
- 2〜3分間65℃で加熱オーブン中にスライドを入れます。エタノールで軽く清掃してください。
2。 PDMSマイクロ流体デバイスを作製
- メーカーが推奨するように、PDMSの塩基及び硬化成分を混合する。私たちは、午前10時01分を使用硬化剤ベースの比率。約0.5cmの高さにペトリ皿にPDMSの混合物の約30ミリリットルを注ぐ。真空中のドガのPDMS必要に応じて。上向きにパターン化されたスコッチテープとPDMSに沈めスライドガラス。 PDMSの後にパターンを配置すると、スライドと皿の底部との間に気泡が形成されるのを防ぎます。皿は水準器を使って水平になっていることを確認しながら、65℃で48時間硬化させます。
- 新しい90ミリメートルペトリ皿に深い約0.5mm層で、その結果、PDMSのミックスの3ミリリットルを注ぐ。 （スピンコーターが利用可能であれば、それはこのステージのために使用することができます）。
- ドガと2.1のように治す。
- そっとメスで希望のサイズにマイクロ流体デバイスを切り取る。この層は、 "フロー層"と呼ばれるでしょう。
- 第二ペトリ皿から薄層PDMSの同じようなサイズの部分を切り取ります。これは、 "井戸層"と呼ばれるでしょう。
- 流動層内の入口と出口のための穴を開けるために適切な大きさの生検パンチャーを（我々は、1.2 mmのIDを使用）を使用します。 レイアウト上のマイクロチャネルと整列して、2ミリメートル番号検パンチャーを使って、井戸のうち、設計レイアウトとパンチ以上厚いガラススライド上に井戸層を配置します。
- 両方PDMS層だけでなく、エタノールで24ミリメートル×60 mmのカバーガラスを清掃してください。空気乾燥して清潔に保つ。
- プラズマはリバーシブルボンディング用の標準プラズマエッチャー（非可逆的結合用）またはハンドヘルドコロナ処理機6のいずれかを使用してカバーガラスや井戸層のPDMSの両方を扱う。慎重に（ 図3）密着性を引き起こすためにカバースリップの上に井戸層を配置。ゆっくり気泡を（必要に応じて）外にこする。
3。細胞イメージング実験
- あなたはシリンジポンプで0.02の内径 "（タイゴン）と柔軟なプラスチックチューブに接続されている適切なシリンジに準備ができて目的のメディアを持っていることを確認してください。
- Sを育てる液体YPDで所望の位相にセレビシエ株。徹底的にボルテックスと場所300μマイクロ遠心チューブに各株のL。
- 優しくコンカナバリンA（シグマ）を各ウェルに2 mg / mlの1μlを置く。そっと水をピペッティングにより各ウェル倍から過剰コンカナバリンを洗い流す。
- コンカナバリン乾燥している間、SC培地欠けグルコース300μlの倍の株を洗ってください。細胞壁から残留グルコースを洗浄するコンカナバリンAに適切な遵守を支援します
- 徹底的にボルテックス細胞。ピペット0.75μlまたは独自のウェル（ 図3）にそれぞれの細胞懸濁液より少ない。優しく豊かな培地で残留細胞を洗い流す。次の2つの手順は、最大乾燥から細胞を防止するために、迅速に実行する必要があります。
- プラズマは直接井戸をぶつけないように注意しながら、徹底的に手持ちコロナ処理機を使用してチップや井戸を扱う。 2間のアライメントには細心の注意を払って、井戸にチップを慎重に置きます（このステップは、実体鏡下で行うことができます）。穏やかに、PDの2つの層を接着するために押すMS。徐々に気泡がチャネル内に残っていないことを確認しながら、約50μl豊富な培地でデバイスを完全に埋める。
- は、デバイスを接続し、適切な注入口にチューブを挿入し、メディアフローを開始します。これらは削除するのが難しいことができるように気泡がデバイスに導入されないように注意してください、これは入口または出口を切断することによって達成され、静かにカバーガラスを壊さないように注意しながら、気泡があるデバイスをタップすることができます。
- 顕微鏡下に置き、各ウェルに適切な撮像ポイントを見つける。
- 必要に応じて回復を可能にするために1時間以上のための豊富な培地流の下で細胞を維持。
- 実験を開始します、我々はメディアの逆流を防止するために、2つのシリンジポンプのそれぞれから一定の流量を使用し、必要に応じて相対的な流量を変化させる。メディアチャネルの幅（ 図4）の80％以上が流れる中で0.8ミリリットル/時とポンプB 0.2〜200ml /時間の結果、ポンプを設定します。これは、動的にCすることができます2流量を変えることによって絞首刑。新しい条件は、チャネル2の全長に沿って数秒以内に安定させる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
異なる系統間の分離が可能であることを示すために、我々は代替ウェルで2つの区別酵母株をイメージした。イメージングフル井戸は井戸（ 図5a、b）の間には、セルのリークを示していない。両株はYFPでタグ付けされた転写因子MSN2を持っています。動的に条件を変えての同時効果をテストするために、我々は核 （ 図5c、d）へMsn2-YFPの局在をもたらし無グルコース培地のステップを作成し、2入力チャンネルに流量を切り替えた。すべての井戸で測定された応答は、デバイスが複数のウェルへの同時動的条件の適用のために使用することができる示し、同時に発生した。
図1。デバイスの設計は。デバイスはカバーガラス、薄い"ウェルズ"層とチューブが接されている"フロー"の層で構成されているCTED。
図2。流動層設計。スコッチテープモールドがこの層のために作られます。ここでは、反対方向の二つのY字型のチャネルを使用していました。
図3。ウェルズ層。打ち抜き井戸を有するPDMSの薄い層をガラスカバースリップに接着されている。その後のConAを各ウェルに入れて、乾燥させる。次いで、細胞を10ウェルにロードされます。
図4。制御チャネルカバレッジ。Yチャネルの2つの入力の相対的な流量を制御することにより、その幅の具体的な画分を培地に覆われている対媒体B（）がchann左エル：80％/ 20％のカバレッジに0.8ml/hr（赤）と0.2ミリリットル/時（クリア）の結果で流れる。右チャンネル：50％/ 50％のカバー率で0.5ミリリットル/時の結果で両方のメディアを流れる。 （b）の10％/ 90％、50％/ 50％、90％/ 10％の流量で装置の写真。
図5。複数の酵母株を使用した動的実験。（b）または（a）のHTB2-Mcherryタギングなしに酵母細胞を含むウェルの（a、b）は全ウェル画像、ウェル間にセル漏れを見せていない。 t = 0での無グルコースステップに2ウェル中の細胞の（c、d）の応答。 Msn2-YFPは、2つの井戸で同時メディアの変化を示す、工程に続いて、同時に核に局在する。 （e）にウェルの1つ（C、D）から分析し、単一細胞内の核Msn2-YFPレベルの時間は、トラック。/ ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本稿では、動的な条件の下で、次のいくつかの酵母菌株を同時に可能にするマイクロ流体デバイスを作成するためのシンプルな卓上法を提案する。一つのチャンネルに複数の系統に従うことにより、複数の系統で単一細胞応答の動態を比較するための信頼性の高いツールを提供しています。我々のアプローチの利点の一つは、クリーンルームを必要とせずに簡単なテクニックを使用してデバイスを製造する能力である。実際には、我々はまた、プラズマ処理操作（手順2.9と3.6で）スキッププロトコルを実施し、良好な結果を得たので、どのようなプラズマ装置なしのラボではまだプロトコルを実行することができました。
まだ媒体流は実験中に細胞に到達することを可能にしながら、独自のウェル中に異なる株のそれぞれを播種することにより、我々は、デバイスの組み立て中に混合セルを避ける。このプロトコルの臨界点は、細胞はそれらの（ - 3.6ステップ3.4）の上に培地をリフロー前に完全に乾かすことを許可しないさ。 Dryin2 PDMS層の間の接着の問題で各ウェル結果にあまりにも多くのメディアを使用してデバイスをクローズしようとしたときにgが出厳しく、細胞の生存率に影響を与えます。これらの制約は、細胞がその場所に定住した後、私たちはそれピールというし、デバイスの井戸層をやめるように強制します。井戸層は、そのため、播種細胞の初期液滴を含むのに十分な深さでなければなりませんが、できるだけ薄いので、井戸のアスペクト比は、その底部に到達するメディアの流れを可能にし、細胞が直接の流れを介して外部信号を得る。
私たちがここで説明するようなデバイスは、チャネル当たり約5株に限定されています。我々は日常的に反対方向性（ 図2）の2つの隣接するYチャネルを使用してデバイスを作成します。これは少数のより多くのチャネル、またはチャネルごとにさらにいくつかのウェルに拡張することができますが、それはこれまでの生きている細胞に適用されていないのVLSIスタイルの装置7の一部、などの高スループットなど、まだありません。に：私たちは、このデバイスの主な目的は、イメージング、その応答をしながらまったく同じ条件に異なる菌株を施すことであるので、関係なく、デバイスの実装、撮像された株の数から幹その同時イメージングには限界があること、しかし、注意してください高倍率では、株は、したがって、より株が大きく、最初と最後のひずみと、撮像時の違いは、撮像され、連続して画像化されなければならない。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
YGは、IDBからフェローシップでサポートされています。 INはアロンの仲間とエドモンドJの教員仲間です。テルアビブ大学のバイオインフォマティクスのためのサフラセンター。この研究は、ISF助成金1499から1410によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
