En mikroflödessystem enheten för att studera flera olika stammar

Summary

Vi presenterar en enkel metod för att producera mikrofluidikanordningar kan tillämpa liknande dynamiska förhållanden till flera olika stammar, utan behov av ett rent rum eller mjuk litografi.

Abstract

Studien av cellsvar på miljöförändringar innebär många experimentella utmaningar: celler måste avbildas under föränderliga förhållanden, ofta i ett jämförande sätt. Flerbrunnsplattor används rutinmässigt för att jämföra många olika stammar eller cellinjer, men tillåter begränsad kontroll över miljön dynamik. Mikroflödessystem enheter, å andra sidan, att utsökt dynamisk kontroll över omgivningen, men det är en utmaning att bild och urskilja mer än några stammar i dem. Här beskriver vi en metod för att enkelt och snabbt tillverka en mikrofluidisk anordning som kan tillämpa dynamiskt föränderliga förhållanden till flera distinkta jäststammar i en kanal. Enheten är designad och tillverkad med enkla medel utan behov av mjuk litografi. Den består av en Y-formad flödeskanal fäst till ett andra skikt hyser mikrobrunnar. Stammarna placeras i separata mikrobrunnar, och avbildas under exakt samma dynamiska förhållanden. Vi demonstrate användningen av anordningen för mätning svar proteinlokalisering till pulser av näringsämnen förändringar i olika jäststammar.

Introduction

Celler ständigt reagera på ett dynamiskt föränderlig miljö, genom att ändra deras metabolism, transkriptionell profil och cellulära funktioner. För att studera dessa fenomen, metoder som kan kvantifiera sådana förändringar som behövs. En typ av avläsning för sådana svar är förändringen i lokaliseringen av stressrelaterade transkriptionsfaktorer som svar på näringsmässig stress.

Mikroflödessystem enheter ¹ har använts för att dynamiskt manipulera miljöförhållanden till celler ^2-4. De presenterar flera fördelar för levande cell imaging: miljön i cellerna kan kontrolleras exakt och dynamiskt förändrats, celler kan live-avbildas vid alla tillfällen, bland annat vid hantering av externa förhållanden, och minimala reagensvolymer krävs. En mycket enkel konstruktion för en mikrofluidikanordning, tillåter växling mellan två villkor, är en Y-formad anordning ^2. Vi använder rutinmässigt Y-formade mikroflödessystem enheter som tillåtertillämpning av dynamiska ändringar av cellerna i kanalen. Vi använder denna enhet för att följa lokalisering förändringar av fluorescerande taggade stressrelaterade transkriptionsfaktorer i jästceller. Vi följer dessa förändringar under föränderliga näringsmässiga förhållanden. Till exempel kan vi erbjuda en puls (eller serie av pulser) av glukos-medium inom en period av-glukos medium vid en mycket fin tidsupplösning. Ofta i sådana experiment, är en intresserad jämföra svaren från olika cellstammar (t.ex. olika mutanter, eller olika vilda isolat). Den Y-formade kanalen är begränsad till en stam i varje kanal - om mer än en stam används, finns det inget enkelt sätt att särskilja mellan stammarna. För att övervinna detta, kan olika kanaler kan användas. Om vi ​​vill använda samma dynamik villkor till flera stammar, vill vi kombinera Y-kanals koncept med flera kanaler. Det finns två utmaningar att genomföra denna lösning: Det kan vara svårt att tillämpa than samma förhållanden samtidigt till alla kanaler, och det finns en geometrisk begränsning av antalet Y-kanaler som kan monteras i en anordning. Vi blev därför söker efter ett sätt för visning flera stammar i en kanal under dynamiska förhållanden.

Här beskriver vi en tvåskiktad mikroflödessystem anordning avsedd för avbildning multipla stammar i en kanal under samma dynamiska förhållanden. Bottenskiktet består av tunt PDMS med en rad av hål. Detta lager är ansluten till täckglas skapa brunnar i vilka vi kommer att placera de olika stammarna, vidhäftande dem med Concanavalin A till glaset. Det andra skiktet är en Y-formad mikrofluidanordning skapas med hjälp av metoden tejp ^5. Efter placering av stammarna i brunnarna det andra skiktet snabbt linje och fäst till den första, skapar en kanal med flera brunnar som innehåller de olika stammarna. Denna sista enheten tillåter efter flera stammar i en kanal, där allastammar utsattes för samma förhållanden vid exakt samma tidpunkt. Hela konstruktionen och tillverkningsprocessen kan göras på bänken, med enkla medel, utan mjuk litografi.

Protocol

1. Skapa en Scotch-tejp Mästare ⁵

1. Rita eller skriva ut önskad mikrokanalen layout, att skala, på papper. I vårt fall utformningen består av två Y-formade kanaler, vardera 3 mm bred (figur 2).
2. Täck en glas-bild med lager av scotch tape. Antalet skikt avgör höjden av kanalen (ca 60 ^ m per skikt). Vi använde 3 lager tejp.
3. Placera layout på en plan yta. Rikta bilden över designmönster. Skär försiktigt tejpen på glasskivan med en skalpell enligt layouten.
4. Ta bort tejp från alla delar av glasskiva utom de i utformningen av mikrokanalen.
5. Placera bilden i en värmeugn vid 65 ° C under 2-3 min. Rengör försiktigt med etanol.

2. Tillverka en PDMS mikrofluidikanordning

1. Blanda basen och härdning komponenter av PDMS som rekommenderas av tillverkaren. Vi använder en 10:01förhållande av bas till härdare. Häll ca 30 ml av PDMS blandningen i en petriskål till en höjd av ~ 0,5 cm. Avgasa PDMS i vakuum vid behov. Sänk ner glasskivan i PDMS med mönstrade tejp uppåt. Placering mönstret efter PDMS förhindrar bildningen av luftbubblor mellan sliden och skålen botten. Cure för 48 timmar vid 65 ° C, vilket gör att skålen är horisontell med ett vattenpass.
2. I en ny 90 mm petriskål häll 3 ml PDMS blandningen, vilket resulterar i ett skikt ca 0,5 mm djup. (Om ett spinnbeläggarens är tillgänglig kan den användas för detta steg).
3. Degas och bota som i 2,1.
4. Försiktigt skära ut mikroflödessystem enheten till den önskade storleken med en skalpell. Detta skikt kommer att benämnas "strömningsskiktet".
5. Klipp ut en liknande storlek bit tunt lager PDMS från andra petriskål. Detta kommer att benämnas "brunnar skikt".
6. Använd en lämplig storlek biopsi puncher (Vi använder 1,2 mm ID) för att stansa hål för inlopp och utlopp i flödet lagret. Placera brunnarna skiktet på en tjock glasskiva över layout och stansen ut brunnar, med användning av 2 mm ID biopsi hålslag, i linje med mikrokanaler i layouten.
7. Rengör båda PDMS skikten samt en 24 mm x 60 mm täckglas med etanol. Lufttorka och hålla ren.
8. Plasma behandla både täckglas och brunnarna skiktet PDMS användning av standard plasma etsare (för icke-reversibel bindning) eller en handhållen korona treater ⁶ för reversibel bindning. Lägg försiktigt brunnarna skiktet ovanpå täckglaset för att orsaka vidhäftning (figur 3). Försiktigt gnugga ut eventuella luftbubblor (om det behövs).

3. Cell imaging experiment

1. Kontrollera att du har önskat media färdiga i lämpliga sprutor anslutna till flexibla plaströr med innerdiameter 0,02 "(Tygon) i sprutpumpen.
2. Grow S. cerevisiae stammar till önskad fas i flytande YPD. Vortex noggrant och plats 300 μl varje stam i ett mikrocentrifugrör.
3. Placera försiktigt 1 ^ il av concanavalin A (Sigma) 2 mg / ml i varje brunn. Tvätta ur överskott konkanavalin A från varje brunn två gånger genom att försiktigt pipettera vatten.
4. Medan Concanavalin A torkar, tvätta stammar två gånger med 300 pl SC-medium utan glukos. Tvätt glukosresten från cellväggarna hjälper ordentlig anslutning till Concanavalin A.
5. Vortexcellerna noggrant. Pipettera 0,75 ul eller mindre av varje cellsuspension i sin egen brunn (Figur 3). Försiktigt tvätta återstående celler med rikt medium. De följande två steg måste utföras snabbt för att förhindra celler från att torka upp.
6. Plasma behandla chip och brunnarna noggrant med den handhållna korona treater, försiktigt så att inte träffa brunnarna direkt. Placera försiktigt chippet på brunnarna, mycket uppmärksam på inriktningen mellan de två (detta steg kan göras under en stereoskop). Tryck försiktigt för att fästa de två skikten av PDMS. Sakta fylla enheten helt med cirka 50 ul rikt medium, vilket gör att inga luftbubblor finns kvar inne i kanalen.
7. Anslut enheten, sätter rören i lämpliga vikar och starta media flöde. Se till att inga luftbubblor införs i produkten som dessa kan vara svårt att ta bort, vilket kan åstadkommas genom att koppla ett inlopp eller utlopp och försiktigt knacka på enheten där bubblorna är, försiktigt så att inte bryta täckglas.
8. Placera under mikroskop och hitta lämpliga avbildning poäng i varje brunn.
9. Håll cellerna under rikt medium flöde under 1 h eller längre för att tillåta återvinning om det behövs.
10. Starta experimentet: vi använder konstant flöde från vardera av de två sprutpumpar att förhindra återflöde av media, förändras relativa flödeshastigheter som önskas. Inställning pumpen A till 0,8 ml / h och pump B till 0,2 ml / h resulterar i medium A strömmar över 80% av bredden hos kanalen (fig. 4). Detta kan vara dynamiskt chängde genom att ändra de två flödena. De nya förhållandena stabiliseras inom några sekunder längs hela längden av kanalen ^2.

Representative Results

För att visa separationen mellan olika stammar vi avbildas två urskiljbara jäststammar i alternativa brunnar. Imaging hela brunnarna uppvisar ingen cell läckage mellan brunnar (figur 5a, b). Båda stammarna har MSN2 transkriptionsfaktorn taggade med YFP. För att testa den samtidiga effekten av dynamiskt ändrade förhållanden, bytte vi flödeshastigheterna i de två ingångskanalerna, skapar ett steg utan glukos-medium, vilket resulterade i lokalisering av MSN2-YFP till kärnan (fig 5c, d). Svaret mäts vid alla brunnarna inträffade samtidigt, visar anordningen kan användas för applicering av samtidiga dynamiska förhållanden till flera brunnar.

Figur 1. Enheten design. Anordningen är sammansatt av ett täckglas, ett tunt "Wells" skikt och en "Flow" skikt till vilket slangen är connected.

Figur 2. Flöde lager design. En Scotch-tejp form är gjord för detta skikt. Här har vi använt två Y-formade kanaler motsatta riktningar.

Figur 3. Brunnar skikt. Det tunna skiktet av PDMS med utstansade brunnar vidhäftad till ett täckglas. Därefter ConA placeras i varje brunn och fick torka. Celler sedan lastas de 10 brunnarna.

Figur 4. Kontrollerad kanaltäckning. Genom att styra de relativa flödeshastigheterna för de två ingångarna hos en Y-kanal, en specifik fraktion av dess bredd är täckt med medium A mot mediet B (a) Vänster chann el: flytande vid 0.8ml/hr (röd) och 0,2 ml / h (klar) resulterar i 80% / 20% täckning. Höger kanal: Flowing båda medierna på 0,5 ml / h resulterar i 50% / 50% täckning. (B) Fotografier av anordningen med 10% / 90%, 50% / 50% och 90% / 10% flödeshastigheter.

Figur 5. Dynamisk experiment med flera jäststammar. (A, b) Hela brunnar bilder av brunnar innehållande jästceller med (b) eller utan (a) HTB2-Mcherry märkning, som visar ingen cell läckage mellan brunnar. (C, d) cellernas respons i två brunnar på en nej-glukos steg vid t = 0. MSN2-YFP lokaliseras till kärnan vid samma tidpunkt efter steget, visar samtidiga medier förändringar i två brunnar. (E) Tid-spår av nukleära MSN2-YFP nivåer i enstaka celler analyseras från ett av brunnarna i (c, d)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se större bild.

Discussion

I detta papper presenterar vi en enkel bänk metod för att skapa en mikroflödessystem enhet som gör efter flera jäststammar samtidigt under dynamiska förhållanden. Efter flera stammar i en kanal ger ett pålitligt verktyg för att jämföra dynamik encelliga svar i flera stammar. En fördel med vår strategi är förmågan att tillverka anordningen med enkla tekniker utan behov av ett rent rum. I själva verket har vi också genomfört protokollet hoppa verksamheten plasmabehandling (i steg 2,9 och 3,6) och fick bra resultat, så laboratorier utan plasma utrustning kan fortfarande utföra protokollet.

Genom ympning av de olika stammarna i sin egen väl vi undviker cell blandning under monteringen av enheten, samtidigt tillåta medelflöde att nå cellerna under experimentet. En kritisk punkt i detta protokoll inte låta cellerna torka ut innan Omforma medel över dem (steg från 3,4 till 3,6). Drying ut påverkar allvarligt livskraften hos cellerna, samtidigt som man försöker stänga enheten med för mycket medel på varje brunn resultat i vidhäftningsproblem mellan de två PDMS lager. Dessa begränsningar tvingar oss att lämna brunnarna skiktet i enheten, snarare än dra bort det efter att cellerna har bosatt sig i sin plats. Brunnarna lagret, därför måste vara tillräckligt djup för att innehålla den första droppen av sådda celler, men så tunn som möjligt, så bildförhållande av brunnarna ger medieflödet att nå sin botten och cellerna får externa signaler genom direkt flöde.

Anordningen som vi beskriver här är begränsad till omkring 5 stammar per kanal. Vi skapar rutinmässigt enheter med två angränsande Y kanaler motsatta directionalities (Figur 2). Även om detta kan utökas till några fler kanaler, eller några fler brunnar per kanal, är det fortfarande inte så hög genomströmning som några av de VLSI stil enheterna ^7, som hittills inte har tillämpats på levande celler.Vi noterar dock att eftersom det huvudsakliga syftet med denna enhet är att utsätta olika stammar till exakt samma villkor, medan imaging sina svar, det finns begränsningar för samtidig avbildning som härrör från antalet stammar avbildas, oavsett enhetens genomförande: at hög förstoring, stammar måste avbildas sekventiellt, därför flera stammar avbildas, desto större är tidsskillnaderna av avbildning mellan den första och sista stammen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS- SYLGARD 184	Dow Corning USA
Vacuum desiccator	Nalgene	5310-0250
Biopsy punchers	Ted Pella Inc.	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm)
Syringe pumps	Chemyx	Fusion 200
Corona treater	Electro-technic products	BD-20
Tygon tubing	Tygon	S-54-HL
Concanavalin-A	Sigma	C7275
Scotch tape	3M Scotch	Transparent Tape 1/2"