Summary
Presentiamo un metodo semplice per produrre dispositivi microfluidici capaci di applicare simili condizioni dinamiche a più ceppi distinti, senza la necessità di una stanza pulita o litografia morbida.
Abstract
Lo studio delle risposte delle cellule ai cambiamenti ambientali pone molte sfide sperimentali: cellule hanno bisogno di essere ripreso in condizioni mutevoli, spesso in modo comparativo. Piastre multipozzetto sono abitualmente utilizzati per confrontare molti diversi ceppi o linee cellulari, ma permettono un controllo limitato sulle dinamiche ambiente. Dispositivi microfluidici, invece, consentono squisito controllo dinamico delle condizioni ambientali, ma è difficile da immagine e distinguere più di pochi ceppi in loro. Qui si descrive un metodo per produrre facilmente e rapidamente un dispositivo microfluidico in grado di applicare condizioni mutevoli a più ceppi distinti in un canale. Il dispositivo è progettato e costruito in modo semplice senza la necessità di litografia soft. Esso è composto da un canale a forma di Y flusso attaccato ad un secondo strato harboring micropozzetti. I ceppi sono posti in pozzetti separati, e ripreso nelle esatte condizioni dinamiche. Abbiamo demonstrate l'uso del dispositivo per misurare le risposte di localizzazione della proteina di impulsi di cambiamenti nutrienti in differenti ceppi di lievito.
Introduction
Le cellule sono costantemente reagire ad un ambiente in perpetuo cambiamento, cambiando il loro metabolismo, profilo trascrizionale e funzioni cellulari. Per studiare questi fenomeni, metodi che possono quantificare tali cambiamenti sono necessari. Un tipo di lettura di queste risposte è il cambiamento di localizzazione di fattori di trascrizione riferiti sforzo in risposta a stress nutrizionale.
Dispositivi microfluidici 1 sono stati usati per manipolare dinamicamente condizioni ambientali alle cellule 2-4. Essi presentano diversi vantaggi per l'imaging cellulare dal vivo: l'ambiente delle cellule può essere controllato con precisione e dinamicamente cambiato, le cellule possono essere vivo con immagini in qualsiasi momento, anche durante la manipolazione delle condizioni esterne, e volumi di reagente minimi sono obbligatori. Un disegno molto semplice per un dispositivo microfluidico, consentendo alternanza tra due condizioni, è un dispositivo a forma di Y 2. Noi abitualmente uso dispositivi microfluidici a Y che consentonoapplicazione di variazioni dinamiche delle cellule nel canale. Usiamo questo dispositivo per seguire i cambiamenti di localizzazione di etichettati con colori fluorescenti fattori di trascrizione di stress correlati in cellule di lievito. Seguiamo questi cambiamenti nutrizionali in condizioni di instabilità. Per esempio, si può fornire un impulso (o una serie di impulsi) di glucosio contenente terreno entro un periodo di non-glucosio medio, ad una buona risoluzione temporale. Spesso in tali esperimenti, si è interessato a confrontare le risposte dei ceppi cellulari diversi (ad esempio, mutanti diversi, o diversi isolati selvatici). Il canale a forma di Y è limitata ad un ceppo in ogni canale - se più di un ceppo viene utilizzato, non esiste un modo semplice per distinguere tra i ceppi. Per ovviare a questo, i canali possono essere usati diversi. Se vogliamo applicare le stesse condizioni dinamiche a più ceppi, vorremmo combinare la Y-canale concetto con più canali. Ci sono due sfide di implementazione di questa soluzione: Può essere difficile da applicare tegli stesse condizioni contemporaneamente a tutti i canali, e vi è una limitazione geometrica al numero di Y canali che possono essere montati in un unico dispositivo. Abbiamo quindi cercando un modo per visualizzare diversi ceppi in un canale in condizioni dinamiche.
Qui si descrive un doppio strato dispositivo microfluidico destinato ceppi di imaging diversi canali alle stesse condizioni dinamiche. Lo strato inferiore è costituito da sottili PDMS con una fila di fori. Questo strato è attaccato al coprioggetti creando pozzi in cui si collocano i diversi ceppi, aderendo con concanavalina A al vetro. Il secondo strato è una forma di Y dispositivo microfluidico creato utilizzando il metodo scotch 5. Dopo aver posizionato i ceppi nei pozzetti secondo strato è rapidamente allineato e collegato alla prima, creando un canale con diversi pozzi che contengono i diversi ceppi. Questo dispositivo permette finale dopo diversi ceppi in un canale, dove tutticeppi sono sottoposti alle stesse condizioni al tempo stesso esatto. Tutta la progettazione e processo di produzione può essere fatto sul piano del banco, con mezzi semplici, senza litografia morbida.
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Protocol
1. Creazione di un nastro Scotch-Master 5
- Disegna o stampare il layout desiderato microcanali, in scala, su carta. Nel nostro caso il disegno consiste di due canali a forma di Y, larghe 3 mm ciascuna (Figura 2).
- Coprire un vetro scorrevole con strati di nastro adesivo. Il numero di strati determinerà l'altezza del canale (circa 60 micron per strato). Abbiamo usato 3 strati di nastro scotch.
- Posizionare la progettazione del layout su una superficie piana. Allineare il cursore sopra il modello di progettazione. Tagliare con cautela il nastro sul vetrino con un bisturi in base al layout.
- Rimuovere il nastro Scotch da tutte le regioni del vetrino eccetto quelle del layout del microcanale.
- Posizionare il vetrino in un forno di riscaldamento a 65 ° C per 2-3 min. Pulire delicatamente con etanolo.
2. Realizzazione di un dispositivo PDMS Microfluidic
- Miscelare la base ed indurimento componenti di PDMS come raccomandato dal produttore. Usiamo un 10:01rapporto della base e catalizzatore. Versare circa 30 ml di miscela PDMS in una piastra di Petri ad un'altezza di ~ 0,5 cm. Degassarla PDMS nel vuoto, se necessario. Immergere il vetrino nel PDMS con il nastro adesivo fantasia rivolto verso l'alto. Posizionare il modello dopo il PDMS impedisce la formazione di bolle d'aria tra la slitta e il fondo piatto. Cure per 48 ore a 65 ° C, assicurandosi che il piatto sia orizzontale con una livella a bolla.
- In un piatto nuovo 90 millimetri Petri pour 3 ml di miscela PDMS, risultante in uno strato di circa 0,5 mm di profondità. (Se un rivestitore a rotazione è disponibile, può essere utilizzata per questa fase).
- Degas e cura come in 2.1.
- Delicatamente tagliare il dispositivo microfluidico alla dimensione desiderata con un bisturi. Questo strato viene definito il "livello di flusso".
- Tagliare un pezzo di dimensioni simili di sottile strato di PDMS dal secondo piatto Petri. Questo sarà definito il "livello pozzi".
- Utilizzare un puncher di dimensioni adeguate biopsia (Usiamo 1.2 ID mm) a fori di perforazione per le entrate e le uscite nel livello di flusso. Posizionare il livello pozzetti su un vetrino di spessore sul layout design e punch out pozzetti, utilizzando 2 mm ID perforatore biopsia, in allineamento con i microcanali sul formato.
- Pulire entrambi gli strati PDMS nonché coprioggetto da 24 mm x 60 mm con etanolo. Asciugare e pulire.
- Plasma trattare sia il coprioggetto di vetro e dei pozzi strato PDMS utilizzando incisore standard di plasma (per non reversibile legame) o un portatile corona treater 6 per incollaggio reversibile. Appoggiare delicatamente lo strato pozzetti sopra il vetrino per provocare adesione (Figura 3). Strofinare delicatamente le eventuali bolle d'aria (se necessario).
3. Cella Imaging Experiment
- Assicurarsi di avere il supporto desiderato pronto in siringhe adeguate collegati a tubi flessibili di plastica con diametro interno da 0,02 "(Tygon) nella pompa a siringa.
- Grow S. cerevisiae alla fase desiderata in YPD liquido. Vortex accuratamente e posto 300 μl di ciascun ceppo in una provetta da microcentrifuga.
- Posizionare delicatamente 1 ml di Concanavalina A (Sigma) 2 mg / ml in ciascun pozzetto. Lavare Concanavalina eccesso A di ogni ben due volte pipettando gentilmente acqua.
- Mentre il Concanavalina A sta asciugando, lavare i ceppi volte con 300 ml di mezzo privo di glucosio SC. Lavaggio glucosio residuo dalle pareti cellulari aiuta l'adesione adeguata alla Concanavalina A.
- Cellule Vortex accuratamente. Pipettare 0,75 microlitri o meno di ciascuna sospensione cellulare in proprio pozzo (Figura 3). Lavare delicatamente le cellule residue con terreno ricco. I due passaggi successivi devono essere eseguiti rapidamente per impedire alle cellule di essiccazione.
- Plasma trattare il chip e i pozzi accuratamente con l'hand-held trattamento corona, facendo attenzione a non colpire i pozzi direttamente. Cura il chip sulla pozzi, prestando particolare attenzione all'allineamento tra i due (questo passaggio può essere fatto sotto uno stereoscopio). Premere delicatamente per aderire i due strati di PDMS. Lentamente riempire completamente il dispositivo con circa 50 microlitri media ricca, prestando attenzione a non bolle d'aria rimangono all'interno del canale.
- Collegare il dispositivo, inserire i tubi negli ingressi appropriati e avviare il flusso dei media. Evitare che le bolle d'aria vengono introdotti nel dispositivo come questi possono essere difficili da rimuovere, che può essere compiuta da scollegare un ingresso o di uscita e picchiettando leggermente sul dispositivo in cui le bolle sono, facendo attenzione a non rompere il vetrino coprioggetti.
- Mettere al microscopio e trovare punti di imaging appropriate in ciascun pozzetto.
- Conservare le cellule sotto ricco flusso medio per 1 ora o più a lungo per consentire il ripristino in caso di necessità.
- Iniziare l'esperimento: usiamo flusso costante da ciascuna delle due pompe a siringa per impedire il riflusso dei media, cambiando portate relativi come desiderato. Impostazione pompa A e 0,8 ml / hr e B pompa a 0,2 ml / hr risultati in medium A scorre oltre l'80% della larghezza del canale (Figura 4). Questo può essere dinamicamente cimpiccato modificando le due portate. Le nuove condizioni stabilizzare pochi secondi lungo l'intera lunghezza del canale 2.
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Representative Results
Per dimostrare la separazione tra i vari ceppi abbiamo ripreso due ceppi di lievito distinguibili in pozzi alternativi. Imaging pieno pozzetti mostra alcuna perdita cellulare tra pozzetti (Figura 5a, b). Entrambi i ceppi hanno il fattore di trascrizione MSN2 etichettato con YFP. Per verificare l'effetto simultaneo di modificare dinamicamente condizioni, abbiamo cambiato le portate nei due canali di ingresso, creando una fase di mezzo di no-glucosio, che ha portato localizzazione di MSN2-YFP al nucleo (Figura 5c, d). La risposta misurato in tutti i pozzetti verificato contemporaneamente, che mostra il dispositivo può essere usato per l'applicazione di concomitanti condizioni dinamiche a pozzetti multipli.
Figura 1. Design del dispositivo. Il dispositivo è composto da un vetrino, un sottile strato di "Wells" ed uno strato di "Flow" alla quale tubo è conneCTED.
Figura 2. Livello di progettazione del flusso. A scotch-tape stampo è fatto per questo strato. Qui abbiamo usato due canali a forma di Y di opposte direzioni.
Figura 3. Strato di Wells. Il sottile strato di PDMS con punch-out pozzi viene fatto aderire ad un vetrino coprioggetti. Poi ConA è posto in ciascun pozzetto e lasciata asciugare. Le cellule vengono poi caricati ai 10 pozzetti.
Figura 4. Copertura canali controllato. Controllando le portate relative dei due ingressi di un canale Y, una frazione specifica della sua larghezza è coperto dal prodotto B. Un mezzo vs (a) sinistro chann el: scorre a 0.8ml/hr (rosso) e 0,2 ml / ora (chiaro) si traduce in 80% / 20% di copertura. Canale destro: entrambi i mezzi di comunicazione che scorre a 0,5 ml / h si traduce in 50% / di copertura del 50%. (B) Le fotografie del dispositivo con 10% / 90%, 50% / 50% e 90% / 10% portate.
Figura 5. Esperimento dinamico con ceppi di lievito più. (A, b) intero e immagini di pozzetti contenenti cellule di lievito con (b) o senza (a) HTB2 Mcherry-tagging, che mostrano nessuna perdita delle cellule tra i pozzetti. (C, d) Reazione delle celle in due pozzetti ad una no-glucosio step at = 0. MSN2-YFP localizza al nucleo contemporaneamente seguendo passo, dimostrando simultanei cambiamenti di media in due pozzetti. (E) Time-tracce nucleari MSN2-YFP livelli in singole cellule analizzate da uno dei pozzi in (c, d)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
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Discussion
In questo articolo presentiamo un metodo semplice da banco per la creazione di un dispositivo a microfluidi che consente i seguenti ceppi di lievito contemporaneamente in condizioni dinamiche. Seguendo diversi ceppi in un canale fornisce uno strumento affidabile per il confronto dinamica di risposte di cellule singole in più ceppi. Un vantaggio del nostro approccio è la capacità di fabbricare il dispositivo con tecniche semplici senza la necessità di una camera pulita. In realtà, abbiamo anche svolto il protocollo saltando le operazioni di trattamento al plasma (in passi di 2.9 e 3.6) e ha ottenuto buoni risultati, così i laboratori senza alcuna apparecchiatura al plasma comunque possibile eseguire il protocollo.
Mediante inseminazione di ciascuno dei ceppi diversi proprio pozzo evitiamo cella miscelazione durante il montaggio del dispositivo, pur consentendo il flusso medio per raggiungere le cellule durante l'esperimento. Un punto critico, in questo protocollo non è lasciare le pile a secco prima di reflow media su di loro (Piazza di 3,4-3,6). Drying out colpisce gravemente la vitalità delle cellule, il tentativo di chiusura del dispositivo con terreno troppo in ciascuna risultati così a problemi di adesione tra i due strati di PDMS. Questi vincoli ci costringono a lasciare il livello di pozzi nel dispositivo, piuttosto che staccatelo dopo che le cellule si sono stabiliti nel loro posto. Lo strato pozzi, pertanto, deve essere sufficientemente profonda per contenere la gocciolina iniziale di cellule seminate, ma il più sottile possibile, in modo che il rapporto di aspetto dei pozzetti consente flusso medio per raggiungere il loro fondo e le cellule ricevono segnali esterni attraverso il flusso diretto.
Il dispositivo come descritto qui è limitata a circa 5 ceppi per canale. Noi abitualmente creare un dispositivo con due canali adiacenti a Y directionalities contrapposte (figura 2). Mentre questo può essere esteso a pochi canali più, o alcuni pozzi più per canale, non è ancora così elevato throughput alcuni dei dispositivi di stile di VLSI 7, che finora non sono stati applicati a cellule viventi.Si nota, tuttavia, che, poiché lo scopo principale di questo dispositivo è quello di sottoporre ceppi differenti alle stesse identiche condizioni di imaging mentre loro risposte, vi sono limitazioni per l'imaging simultanea che derivano dal numero di ceppi ripreso, indipendentemente dal dispositivo di attuazione: a elevato ingrandimento, ceppi devono essere esposte in sequenza, quindi i ceppi più fotografato, maggiori sono le differenze di tempo di imaging tra il primo e l'ultimo ceppo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
YG è sostenuto da una borsa di studio IDB. IN è un tipo Alon e membro della facoltà del J Edmond . Safra Centro di Bioinformatica dell'Università di Tel Aviv . Questa ricerca è stata sostenuta da ISF sovvenzione 1499-1410.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
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- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
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- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
