Summary
현장 패치에 클램프 녹음은 그대로 회로의 뉴런의 electrophysiological 특성에 사용됩니다. CNS는 작고 강력한 피복에 둘러싸여 있기 때문에 Drosophila 유전자 모델 패치를 고정으로 어렵습니다. 이 문서는 이후의 패치 클램프 녹음의 집과 깨끗한 뉴런을 제거 할 수있는 절차에 대해 설명합니다.
Abstract
짧은 세대 시간 및 손쉬운 유전자 기술은 과일 파리 Drosophila melanogaster 기초 신경 과학 연구의 훌륭한 유전자 모델을 확인합니다. 그들은 neuronal 흥분을 중재 이후 이온 채널은 모든 행동의 기초입니다. 복제 제 1 전압 개폐 이온 채널은 Drosophila 전압 개폐 칼륨 채널 쉐이커 1,2했다. 신경계 기능에 대한 이온 채널과 막 흥분의 역할을 이해하는 방향으로는 현장 패치 클램프 녹음에서와 Drosophila에서 강력한 유전 도구를 사용할 수 결합 할 때 유용합니다. 수년 동안 이러한 녹음은 Drosophila의 CNS의 작은 크기에 방해되었습니다. 또한, glia 및 콜라겐으로 만든 강력한 집은 중앙 뉴런에 패치 피펫 액세스에 대한 장애물을 형성. 이 집의 제거는 성인 Drosophila의 CNS에서 뉴런의 패치 클램프 녹음에 필요한 전제 조건이다. 최근 몇 년과학자들은 성인 뇌 3,4 및 배아 5,6, 애벌레의 7,8,9,10, 그리고 성인 Drosophila 11,12,13,14의 복부 신경 코드를 뉴런에서 현장 패치 클램프 녹음에서 수행 할 수있었습니다. 안정적인 기가 - 씰은 좋은 패치의 주요 전제 조건이며, 누설 전류를 방지하기 위해 세포막과 패치 피펫의 깨끗한 접촉에 따라 달라집니다. 따라서 성인 Drosophila의 뉴런에서 현장 패치 클램프 녹음에서 전체 셀 철저하게 세척해야합니다. 첫 번째 단계에서, ganglionic 집은 효소 처리 할 수 있으며 기계적으로 대상 셀에 액세스 할 수 있도록하기 위해 제거. 두 번째 단계에서, 세포막은 glia, 콜라겐 또는 기타 자료의 어떤 항목은 기가 - 씰 형성을 방해하지 수 있도록 연마되어야한다. 이 문서는 체세포의 전체 C의 Drosophila 복부 신경 코드, 비행 motoneuron 5 (MN5 15)에서 확인 중앙 신경 세포를 준비하는 방법에 대해 설명합니다예쁜 패치 클램프 녹음. 신경 세포의 식별 및 가시성이 MN5에서 GFP의 대상 표현에 의해 달성된다. 우리는 패치 클램프 기술 자체를 설명하는 것을 목표로하지 않습니다.
Protocol
다음 설명은 하나 motoneuron에 대한 특정하지 않습니다. 그것은 모든 신경 세포와 함께 사용할 수 있습니다. 이 예제에서, 우리는 dorsolongitudinal 날개 억압자 근육 (DLM)의 두 dorsalmost 섬유를 innervates 비행 motoneuron 5 (MN5)을 사용합니다. 우리가 비행 motoneurons (그리고 다른 몇 뉴런)에 GFP를 표현 할 수있는 UAS/GAL4 시스템을 사용 MN5를 파악하고 시각화합니다.
1. 성인 Drosophila의 절개는 복부 신경 코드 (VNC)의 등 일부에 접근 할
- Ryglewski 및 Duch (2009 13)에 설명 된대로 sylgard 코팅 배양 접시에있는 그것의 등쪽 중간 선 (35mm 직경)을 따라 성인 Drosophila 등의 측면을 해부. 이 해부의 영화는 주피터 (Boerner와 Godenschwege 16를 통해 온라인으로 사용할 수 있습니다. 다음은 절개에 대한 간단한 설명입니다.
- 파리 성충은 1 분 동안 얼음에 냉각하여 anesthetized 있습니다. 이것은 사전 냉각 빈 플라이 유리 병 (식품 제외)에 의해 달성 될 수있다얼음에와 이미 차가운 병에 플라이를 배치. 날개와 다리가 가위로 제거됩니다.
- 플라스틱 링 (내경 9mm, 두께 1.3 mm로, 즉시 그 다음 (그림 1A, B 우리가 sylgard으로 가장자리에 가득 35mm 페트리 접시의 뚜껑을 사용) sylgard 코팅 배양 접시에있는 등쪽면을 고정합니다 ) 바셀린과 sylgard에 들었 구요.
- 35mm 페트리 접시의 뚜껑의 사용은 물을 찍어 렌즈 시각화 아래 패치 피펫으로 VNC에 대한 액세스를 용이하게한다. 이 요리의 벽을 건드리지 않고도 shallowly 피펫을 소개하는 데 도움이됩니다.
- 플라스틱 링은 얇은 (우리는 1.3 mm의 두께를 사용) 플라스틱 시트에 구멍을 뚫는으로 만들 수 있습니다. 우리는 요리에 맞는 있도록 링의 바깥 경계를 정의하는 와이어 커터를 사용합니다.
- 잠수 정상적인 생리의 플라이 (그림 1C, MM의 생리의 구성 : NaCl 128, KCl 2, CaCl 2 1.8, MgCl 2 4, HEPES 5 ~ 35 depe 자당솔루션의 osmolality에 nding, 산도가 1 M NaOH를 7.25로 조정되며, osmolality)는 자당과 290 mOsM로 조정됩니다.
- 동물은 등쪽의 중간 선을 따라 해부를하고 있으며, 대형 등쪽 세로 방향 비행 근육이 옆으로 늘어와 창자, 식도, 그리고 VNC를 아래에를 노출 고정되어 있습니다. 창자와 식도의 제거 후, VNC는 (그림 1D) 노출됩니다.
- 선택적으로 즉시이 단계 (그림 1E)에서 목이 잘 렸나 할 수 있습니다. 머리를 제거하면 효소 및 패치 피펫으로 접근보다 편리하게, 그리고 (수석은 소마에 뒤 아르,도 2B, C) 소마 청소 때 MN5 수석이 방해되지 않습니다. 실험 설계 (예를 들면 가슴 motoneurons에 입력을 내림차순으로 공부)에 의해 필요한 경우에는 머리도 그대로 남아있을 수 있습니다. 이 경우 피펫은 뒤쪽 또는 측면 (측면, 그림 2A)에서 도입 할 수 있습니다.
- 빠른에 대한실험 기간 동안 생리 교환 녹음 챔버의 볼륨이있는 요리로 해부하는 동물과 접착 주위 플라스틱 링 (내경 9mm)를 배치하여 최소화 바셀린 (그림 1A, B, 녹음 챔버의 볼륨 ~ 200 μl입니다) .
- 준비 그러면 수직 고정 단계 형광 현미경에 장착 (우리는 Zeiss Axioskop이 FS 플러스, Zeiss을 사용하여, 독일)와 높은 NA (> 0.75), 긴 작동 거리 (> 2mm), 40x 물 찍어 목적으로 볼 수 있습니다. 재관류 시스템 (생리 기능, 생리 아웃)은 접지 와이어 및 효소 피펫은 기록 챔버 (- J, L도 1 층)에 삽입됩니다.
2. MN5의 시각화 (도 2 및도 3을 참조), 향
- 수직 고정 무대 epifluorescent 현미경에 페트리 접시를 탑재합니다.
- 앞 부분이 전극 홀더가 옆에 직면 수 있도록 거기에 플라이로 요리를 배치합니다마운트 (그림 1).
- VNC를 조명하기 위해 높은 배율 (40x 이상), 고 NA 물을 찍어 렌즈 (NA 0.75 이상) 및 GFP 필터를 사용합니다. 청소하는 동안 세포의 좋은 시각화를 위해 우리는 하나 0.8의 NA (올림푸스 LUMPlanFl 40xW) 또는 0.75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27)의 NA와 렌즈를 찍어 40x 물을 사용합니다. 패치 피펫 잘 접근의 작동 거리 2 mm 또는 커야합니다.
- 그리고 아마도 일부의 적용 - - 눈에 잘 띄는 기관 (도 2 및도 3) MN5 모두 사이의 중간 선에 가까운 신경절의 등 표면에 mesothoracic neuromere에 위치해 있습니다. 자신의 수석과 MN5이 확산 녹지로 표시됩니다. somata 청소 후에 더 뚜렷한된다. 그러나, 그들의 수석이 날카로운 나타나지만 인해 그는 여전히 조직 (인물 2A, B)의 적용을받는 것에 모호한 상태로 유지되지 않습니다.
- 우리 설정에서 우리는 우리가 MOD 할 수있는 HBO 100 형광 광원을 사용하여광 출력 강도를 ify. 우리는 너무 많은 형광등 빛에 조직의 과잉 노출, 특히 푸른 빛을 방지하기 위해 중립적 인 밀도 필터를 사용합니다. 이 사진 손상을 일으킬 수 있으며, 궁극적으로 세포를 죽일 것이다. 우리는 0.8 중성 밀도를 사용합니다. 어떤 표백은 청소 절차의 과정에서 발생 없습니다. 표백이 발생하면 가능성이 가장 높은 광 출력이 너무 강한 것입니다. 셀은 사진을 손상입니다.
- LED 조명을 사용하는 경우의 강도 설정은 실험에 의해 결정해야합니다. 표백은 photodamage의 징조이며 피해야합니다.
3. MN5의 시각화를위한 대체 방법
우리의 응용 프로그램에 대한 그 GFP의 대상 표현과 예를 들어, 셀에 표시하는 것이 중요합니다. 또는 DiI, lipophilic 염료는 retrogradely이 신경 세포에 라벨을 사용할 수 있습니다. 이 경우 염료 결정은 곤충 minutien 핀을 사용하여 비행 근육에 삽입되며, 상처가 U를 사용하여 문을 닫습니다V의 경화 접착제.
- 100 μl 70 % 에탄올에 몇 DiI 크리스탈보기 (특정 금액) 용해하여 DiI 주식 솔루션을합니다. 까지 사용할 때까지이 솔루션은 -20 ° C에서 보관 할 수 있습니다. 반복 동결 융해하는 것은 문제가되지 않습니다.
- 솔루션 5 μl 그 다음 치료 커버 슬립에 pipetted 있습니다. 에탄올이 증발 될 때까지 기다립니다. 이것은 몇 분 정도 소요됩니다.
- 미리 냉각 병에 플라이 (얼음로 넣기 만하면 되죠 의해)과 얼음에 짧은 시간 (아래 1 분)에 대한 시원한를 놓습니다. 분해 stereomicroscope에서 냉각 판에 차가운 anesthetized 플라이를 놓습니다.
- minutien 핀으로 찌르고 될 때 쉽게 안 밀려 수 있도록 센터는 파리와 장소에 고정.
- minutien 핀, 플라이를 누른 상태에서 할 수있는 다른 하나를 누른 두 집게 하나를 사용하십시오.
- minutien 핀 끝의 DiI 크리스탈 (를 사용하여가되도록 곤충 minutien 핀을 보유하고 커버 슬립에서 DiI의 일부를 긁어하기 위해 굵은 집게를 사용하여똑같은 커버 슬립하고 커버에 매우 동일한 곳마다) 절차가 완료 될 때마다 핀에 더 많은 염료를 얻을하는 데 도움이 나오십시오. 핀도 더 쉽게 구부리하고 사용하기 어려운 것, 지적해서는 안됩니다.
- 그런 다음 펑크 끝에서 DiI과 minutien 핀과 함께 파리의 등쪽 가슴의 중앙에 구멍. dorsolongitudinal 비행 근육 (DLM, 각 측면에 근육 섬유 5, 6)의 두 dorsalmost 근육 섬유는 MN5에 의해 innervated 있습니다. 따라서, 오른쪽 가슴의 중앙에 염료 결정을 배치하는 것은 MN5 모두 DLM의 두 근육 섬유 6 상처 때문에 표시 및 일부 염료를 얻을 수 있다는 보장합니다.
- 염료는 큐티클 바로 아래에 배치해야합니다. 염료 너무 깊이 삽입되어있는 경우, 즉시이 칼에 찔 될 수 있습니다 또는 다른 뉴런 (예 MN1-4)도 표시 될 수 있습니다.
- 충분한 염료 (이 연습과 경험의 문제입니다) 가슴에 삽입 될 때까지이 작업은 반복된다
- DiI 물 solub 없습니다르 따라서는 근육 세포 기질에 용해되지 않고 표피 아래에있는 '박제'해야합니다.
- 그런 다음 다른 minutien 핀은 UV 경화 접착제의 비말 (우리가 무게 배에 접착제의 비말을 넣어)에 담근있다.
- minutien 핀의 끝 부분에 지금 접착제는 염료 결정 삽입 된 상처를 종료하는 데 사용됩니다.
- 접착제 (만 상처가 아닌 전체 가슴을 닫을 작은)의 신청 후 UV 총 접착제를 치료하는 데 사용됩니다. 우리는 UV 빛에 노출의 두 열 님의 간격을 사용합니다.
- 치료 파리는 플라이 병에 신선한 음식에 부착 할것입니다. 파리 '가슴에 묻은 자리 어떤 함정 플라이를 유리 병의 벽에 충실하지 않는지 확인하십시오.
- 염료는 대상 뉴런에 도달하기 몇 시간이 필요합니다. 이 수용성 지질이기 때문에이 세포 기질에없는, 막 따라 이동한다. 우리는 오후에 동물을 치료 이상 밤을 둡니다.
- 패치 클램프 실험은 다음 날 실시. 유전자 표현 GFP의 사용에 비해 뉴런 덜 표시됩니다.
4. 청소에 사용되는 효소 피펫의 준비
이 기록 챔버를 통해 생리의 지속적인 흐름을 보장하기 위해 중요합니다. 목욕 볼륨 상승과 가을을하는 것이 그 진동의 원인 및 실험 기간 동안 잠재적 인 변경 사항을 오프셋으로 피해야한다. 재관류와 흡입이 따라 설정해야합니다. 이는 다시 빠른은 실험 기간 동안 실험과 약리 대리인의 급속한 교환하기 전에 단백 분해 효소의 씻어 중요합니다있는 솔루션 교환이 훨씬 쉬워집니다.
- 기록 챔버 (분 당 약 2 ML의 유량)의 재관류를 보장합니다. 유량은 어느 물건을 사용하거나 특정 직경 tubings을 (큰 직경, 높은 유량)를 사용하여 조정할 수 있습니다. 일의 솔루션의 빠른 교환을 보장하기 위해 가능한 작게 챔버의 볼륨을 가지고전자 챔버. 이 단백 분해 효소와 녹음 챔버에서 차단기의 빠른 제거를 실현할 수 있습니다.
- 챔버의 볼륨이 재관류 시스템 (그림 1) 생리 아웃이 기록 챔버 (물 침적 목적은 목욕탕에 인하 된 경우)에 삽입하는 방법에 따라 달라집니다.
- 생리 아웃이 기록 챔버의 titer가 증가하고 (흡입, 상승, 흡입, 상승) 지속적으로 해당되지 않는 방식으로 위치하지만 일정하게 유지되어 있는지 확인합니다 (안정된 흡입). 우리는 지속적으로 욕실에서 염분을 빨아에서 생산되는 상수, 중단하지 않을 앙앙 소리 안정된하고 안정적인 세례를 결정합니다.
- 생리 기능과 아웃으로 우리는 구부러 좁고 tubings에 부착 plasticine를 (그림 1 층)를 사용하여 녹음 챔버 근처에 배치되어 피하 주사 바늘을 사용합니다.
- 패치 피펫을 당겨 약간의 시각적 인 통제하에 팁하다. 좋은 깨끗한 집게를 사용하십시오. 피펫 unde을 표시 할 때R 40x 물 침지 렌즈는 피펫 팁 직경은 세포의 소마 직경의 40 70 % 사이 약 여야합니다. 매우 큰 팁은 (약 직경 셀 또는 더 큰)도 사용할 수 있습니다,하지만, 전지 본체를 벗겨 먹을 가능성은 피펫의 모세관 힘에 의해 증가한다. 아주 작은 피펫은 (소마 직경 미만 10 %), 그것은 어떤의 청소 절차를 수행하는 동안 하나 이상의 신선한 피펫 (들)을 사용할 필요에 결과를 쉽게 나막신 있습니다.
- 을 막힘없이 PBS 버퍼 또는 생리의 2 %의 단백 분해 효소로 피펫을 입력합니다.
- 전극 홀더에 효소 피펫를 삽입합니다. 적용 압력의 적절한 통제를 보장하기 위해 홀더는 단단히 밀봉해야합니다.
- 피펫 홀더에있는 작은 콘센트에 튜브를 연결하고 튜브의 자유로운 끝에서 빼하면 피펫 홀더에 삽입되었다는 피펫에 영향을주지 않는 방식으로 프로그램을 보호합니다. 현미경으로 움직임을 확인합니다.
- 중 플라스틱 P를 삽입 ipette 팁 (자동 pipetter와 함께 사용되는 종류의, 우리는 푸른 천 μl 사람을 사용하지만이 환경 설정의 문제입니다. 기타 크기는 잘으로 사용할 수 있습니다) 또는 튜브의 자유 단부에 물건이있는 주사기 효소 / 패치 피펫에 긍정적이고 부정적인 압력을 적용 할 수 있습니다. 긍정적 인 압력이 어느 피펫 팁 (마우스 피스로 사용)으로 불어 나 주사기를 밀어 적용됩니다. 부정적인 압력 흡입 (마우스 피스를 사용하여 입 포함) 또는 주사기를 뽑아 적용됩니다.
- 긍정적이고 부정적인 압력 응용 프로그램의 목적은 세포와 조사중인 세포를 주변 부스러기를 풀어 제거하는 것입니다. 긍정적 인 압력 세척 피펫에서 효소를 추출하고 CNS의 표면에서 파편을 날려 것입니다. 부정적인 압력은 VNC (진공 청소기 등)에서 쓰레기를 빨아하는 데 사용됩니다.
5. (그림 3 및 비디오) MN5 GFP 태그의 청소
독자가 내용은 "> 참고 : 청소 전후 MN5의 이미지는 그림 3에 구별하기 어렵 이것은 실제 생활에 들어가 무엇 그것은 청소 및 비 세척 사이의 미묘한 차이를 구별하는 법을 배워야 몇 가지 훈련을 취할 것입니다.. 뉴런이. 이러한 미묘한 차이는 이미지를 이동에서 더 볼 수 있습니다 양해 해 주시기 바랍니다. 따라서 영화는 정적 인 이미지 (그림 3)보다 인상을 제공합니다.- 효소가 (그림 3B, 흰색 화살표) 밝은 빛으로 40x 물 찍어 렌즈에서 피펫을 가득 시각화.
- 피펫 팁에 초점을 맞 춥니 다. 이 막힌 경우, 긍정적이거나 부정적인 압력을 적용하여 먼지를 데리고하려고합니다. 먼지가 나오지하지 않는 경우, 피펫을 채워 새로운 효소를 준비합니다.
- 형광등 (그림 3A)로 전환합니다.
- 조심스럽게 효소 피펫을 절감하고 전지 본체를 볼 수 있습니다 때까지 다시 초점을 맞 춥니 다.
- 효소 피펫은 가까운 경우전지 본체는 재관류를 전환 할 수 있습니다.
- 전지 본체 대한 짧은 폭발하기 때문에 셀에 대한 액세스를 hampering되는 모든 것이 풀어집니다 긍정적 인 압력을 적용합니다. 전지 본체를 둘러싸고있는 조직이 느슨 때까지이 수행되어야한다.
- 또한 VNC를 둘러싼 ganglionic 집에서 왼쪽 오버 될 수 있습니다 느슨한 파편을 잡아 dorsally 효소 피펫 이동합니다. 그것은 전에 현미경에 준비를 장착에 절개로 이미 제거되었을 수 있습니다 (이 항상 그런 것은 아닙니다).
- 긍정적이고 부정적인 압력의 응용 프로그램을 번갈아하여, 전지 본체 주위에 진공 청소기와 진공 청소기와 같은 효소 피펫을 사용합니다. 완전히 전체 셀 몸을 풀어 할 필요는 없습니다. 소마의 앞 부분을 청소하면 (또는 어떤 측면에서 피펫을에 따라 뒤쪽 또는 옆 부분이 소마 접근) 할 것입니다.
- 막 조각이 무료해질 때까지이 청소 절차는 완료됩니다.
- membra더 "그림자"또는 셀에만 형광 빛으로 볼 때 조직을 주변 사이의 확산 대비가 없을 때 NE는 깨끗합니다. 이것은 높은 강도 푸른 빛으로 가장 볼 수 있습니다. 따라서 (우리가 그를 달성 할 수 있도록 중립적 인 밀도 필터를 제거) 잠시 동안 빛 강도를 향상시킬 수 있습니다. 정기적 인 HBO 100 수은 전구에 의해 제공으로 광범위한 푸른 빛의 노출은 약 1 분 내 사진 손상을 줄 수 있습니다. 이것은 세포가 죽는으로 페이드 할 수있는 GFP 신호가 발생합니다.
- 밝은 빛으로 전환하고 형광 빛으로 볼 수 없습니다 세포와 파편을 제거합니다. 기관의 시각화 참고 및 청소 상태가 밝은 빛과 형광등 사이를 전환 혜택을 누릴 수 있습니다.
- 청소 절차가 완료 및 전지 본체를 깨끗하게 표시하는 경우에 다시 살포 시스템을 전환 (그렇게 청소 절차는 3-5 분 이상하고 안정적으로 세례를 청소 계속됩니다 너무 경우)와 라이트.
- 셀 구경 린스R ~ 식염수 또는 다음 응용 프로그램에 사용되는 솔루션을 15-20 분. 덜 40 ML은 단백 분해 효소가 씻겨되어 있는지 확인하기 위해 녹음 챔버 통과해야합니다. 세포 표면에 단백 분해 효소 유물는 달리 안정적인 패치 클램프 녹음 중에 갑자기 세포 사망의 원인이됩니다.
6. 전기 생리학
- 전압 클램프 및 전류 클램프 모드에서 현장 전체 세포 패치 클램프의 기존는 Axopatch 200B 앰프 (분자 장치, USA)를 사용하여 실시, 신호 Digidata 1320 (분자 장치, USA)를 사용하여 디지털화하고 pClamp 10.2 소프트웨어를 분석하고 있습니다.
- 패치 피펫은 수직 피펫 풀러 (Narishige, PC-10)와 붕규산 유리 모세 혈관에서 나온됩니다.
- 피펫 팁 저항 5.8 사이 MΩ 6.2 (현재 클램프 및 칼륨 현재 녹음)과 2.8 사이에 각각 MΩ 3.5 (칼슘 현재 레코딩을위한)입니다. 팁 저항에 따라 달라집니다내부 및 세포 솔루션 (자세한 내용은 13, 14를 참조 용) 사용됩니다.
7. 대표 결과
청소 절차 후 두 MN5는 현장 전체 세포 패치 클램프 (그림 3)에 대한 준비가되어 있습니다. 다음 절 대표 전압 클램프 등 설명 청소 절차를 사용 후 MN5 소마에서 녹화 한 현재의 클램프 흔적을 보여줍니다. MN5 전압 개폐 이온 채널 (도 13,14 참조) 다양한 표현합니다. 우리는 전압 개폐 칼슘 전류 (그림 4), 전압 개폐 칼륨 전류 (그림 5)과 행동 잠재적 인 트레이스 (그림 6)의 예를 보여줍니다. 전압 개폐 칼슘, 칼륨 전류는 유사한 전압 프로토콜에 의해 evoked하지만, 사용 된 솔루션은 조사중인 만 이온 채널 (자세한 내용은 13,14 참조) 전류를 통과 할 수 있도록하기 위해 다를되었습니다. 다른 모든 주요 전압 개폐 이온 채널재관류가 2 분 동안 중단되었습니다 - 500 μM의 cadmiumchloride과 칼슘 채널, 2 MM 4 aminopyridin (4 AP)와 30과 칼륨 채널, 목욕탕에 직접 pipetted - annels은 (100 나노 미터 tetrototoxin와 전압 개폐 나트륨 채널을 차단되었습니다 MM tetraethylammoniumchloride 패치 피펫에있는 세포 패치 솔루션 (자세한 내용은 13,14을 참조하십시오). 액션 잠재적 인 트레이스가 MN5 소마 (그림으로 현재의 주입에 의해 evoked 한을 통해 intracellularly extracellularly 및 0.5 MM 4 AP, 20 밀리미터 tetraethylammoniumbromide 및 144 밀리미터 cesiumchloride 6) 모든 이온 채널 차단제 (12)의 사용없이.
1 그림. 청소 설정. 플라이는 35mm 페트리 접시 sylgard 코팅 뚜껑 속에서 고정되어 우리가 w 플라스틱 링 (내경 9mm, 두께 1.3 mm)을 접착하는i 번째 바셀린 (A, B). 생리의 플라이를 잠수 후 (C) 그것은 등쪽의 중간 선을 따라 열립니다. 창자와 식도가 복부 신경 코드 (D)를 노출 제거됩니다. 가슴 neuromere의 더 나은 접근성를 들어 머리가 (E) 제거됩니다. 수직 epifluorescence 현미경에 준비를 장착 한 후 재관류 시스템 (F, G, 왼쪽의 생리 기능, 생리 아웃, 흰색 화살표)뿐만 아니라 접지 와이어는 (F, G, 흰색 화살표 위치로 이동합니다 오른쪽). 피펫을 세척 가득 효소는 물 침적 목적은 (NA 0.8 40x) 목욕탕 (H)로 인하 된 후 위치로 배달됩니다. 명확성을 위해 우리는 목표는 (F, G, 오른쪽에 흰색 화살표) 인하되기 전에 이미 보여줍니다. 피펫은 객관적이고 플라스틱 링을 모두 만지지해야하기 때문에 1 HL-U 전극 홀더 (J)에 의해 개최되는 효소 피펫은 녹음 챔버를 입력하는 시간 각도가 중요합니다. 이 각도를 설정에서 설정에 따라 다릅니다. 여기있다 약 30 ° (K에서 J, 화살표의 그림 참조). headstage에 첨부의 홀더에 피펫의 배열 (L)로 표시됩니다. headstage는 동력 micromanipulator에 부착되어 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 복부 신경 코드를 MN5. GFP는 유전자 motoneuron 특정 GAL4 드라이버 (A)의 사용에 의해 표현 될 때 MN5가 쉽게 Drosophila 복부 신경 코드 (VNC)의 위치로 식별 할 수 있습니다. 점선 사각형은 가슴 neuromere를 도시한다. 크기가 서로 관련된 방법에 대한 아이디어를 얻으려면, 우리는 dorsolongitudinal 비행 근육의 왼쪽에서 왼쪽 MN5에 접근 청소 패치 피펫을 보여줍니다. 더 나은 시각화를 들어, 패치 피펫은 붉은 염료 (dextran-tetramethylrhodamine, A)로 가득했다. contralaterally MN5을 투영은 중간 선 양쪽에있는 VNC의 mesothoracic neuromere의 등 표면 (B의 공 촛점 이미지 스택의 프로젝션보기)에 위치하고 있습니다. ipsilaterally MN1-4을 투영하는 것은 더 많은 측면에 위치하고 있으며 anteriorly MN5 (B의 화살표)과 관련이 있습니다. 두 MN5 사이의 점선 원은 MN5 (B)를 포함하여 neuropil의 비행 motoneurons의 수석를 도시한다. (B)에 GFP 레이블이 GFP에 대한 항체가있는 immunohistochemical 얼룩에 의해 향상되었습니다. MN5 형태에 대한 자세한 내용은 보이지 않는 추적 neurobiotin와 후속 공 촛점 이미지 수집 (C)와 신경 세포 intracellularly을 (iontophoretically) 작성하여 볼 이루어집니다. 착색은 형광에 커플 링 된 streptavidin과 표시되었다. 스케일 바는 30 μm이다.
그림 3. MN5 전후 청소. MN5의 시각화는 UAS/GAL4를 사용하여 GFP의 표현에 의해 달성된다시스템 (A, C, 라벨 참조). MN5 청소 절차 전에 (A, B)과 후 (C, D). 각 사진의 왼쪽은 앞 대표, 오른쪽은 뒤쪽 나타냅니다. 에서 기록 할 수 뉴런은 깨진 팁과 단백 분해 효소 가득 패치 피펫으로 청소됩니다. 효소 피펫은 (A, B, 라벨 참조) 만 희미하게 볼 수 있습니다. 의 삽입은 셀에 접근 효소 피펫으로 바닥 MN5의 확대를 보여줍니다. MN5은 청소 절차 (B) 전에 밝은 빛에서 볼 수 없습니다. 그들이 조사중인 셀을 포함하는 경우 기관을 제거해야합니다. 청소 절차 후, 셀 및 주변 조직 사이의 대비 (C, 하단 MN5) 더 선명하고 있으며, 세포는 지금 밝은 빛 (D)에서 볼 수 있습니다. 피펫 팁은 좀 더 명확하게 밝은 빛을 사용하는 경우 볼 수 있습니다. 확대는 MN5 전지 본체 테두리 더 나은 식별 점선으로 둘러싸고있는 점선 사각형의 영역을 묘사합니다. 밝은 빛의 시각화는 종종 청결의 판단을하는 데 도움이됩니다.
4 그림. 칼슘 MN5의 현재. MN5에서 기록으로 전체 셀 칼슘 전류의 예 녹음. 적어도 두 개의 서로 다른 칼슘 전류는 낮은 전압 활성화 과도 칼슘과 현재 지속적인 높은 전압 칼슘 표시됩니다. 요즘은 -90 mV의 개최 가능성에서 evoked했다. -90 뮤직 비디오에서 20 뮤직 비디오에 전압 단계가 적용되었습니다. 차단기는 대부분의 다른 이온 채널을 차단하는 데 사용되었습니다. 유물은 (MN5 칼슘 전류 특성에 대한 Ryglewski 외., 2012 참조) 명확성을 위해 생략되었다.
그림 5. MN5의 칼륨 전류. 등 MN5에서 녹화 한 전체 세포의 칼륨 전류의 예 녹음. 표시 전류는 칼슘 채널 차단제가 적용되지 않았습니다으로 칼슘 활성화 칼륨 전류가 포함되어 있습니다. 요즘은 지주에서 evoked되었습니다현재 총 칼륨 (A) 또는 과도 칼륨 전류를 비활성화하고 현재는 지속적인 칼륨을 (B) 표시 할 -20 mV의 개최 가능성에서 -90 mV의 가능성. -90 뮤직 비디오에서 20 뮤직 비디오에 전압 단계는 10 MV 단위로 적용되었습니다. -90 MV (A)와 -20 뮤직 비디오 (B) 순수 과도 칼륨 전류 (C)를 보여의 개최 가능성에서 evoked으로 칼륨 전류 오프라인 빼기. 전압 개폐 나트륨 채널을 차단되었습니다. 유물은 (MN5 전압과 칼슘 칼륨 전류의 특성에 대한 Ryglewski 및 Duch, 2009 참조) 명확성을 위해 생략되었다.
6 그림. 패턴을 쏘면 MN5으로 전시. 패턴을 발사의 예 녹음 된 200 밀리 초 기간의 체세포 현재 주사 (0.4 NA, 검정, 0.5 NA, 회색)으로 MN5에 elicited. 휴식 막 잠재력은 -59 MV했다. 더 이온 채널 차단제가 사용되지 않았습니다. (MN5 사격 현재의 클램프 분석을위한패턴은 Duch 외를 참조하십시오., 2008).
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Discussion
GFP 같은 형광 단백질과 세포를 시각화 할 때, 너무 많은 빛에 준비를 과잉 노출하지 않는 것이 중요합니다. 이 사진 손상 될 수 있습니다. 우리는 조명을위한 100W HBO 짧은 아크 수은 전구를 사용하며, 우리는 또한 0.8 (채도 ND 필터 0.3과 0.5)의 중간 밀도 (ND)을 사용합니다. 청소 좋은 가시성의 품질을 판단 할 수 있도록하는 것은 매우 중요합니다. 따라서, ND 필터는 여러 번에 20 s의 짧은 기간 동안 삭제 될 수 있습니다.
일부 긍정적 인 압력을 적용, 전지 본체는 "날개"조금. 이 청결의 질을 판단하는 데 도움이됩니다. 복부 신경 코드 대조적으로 매우 낮은이며, 운동은 세포를 시각화하기가 매우 도움이 될 수 있습니다. (또한 패치 고정 용) 청소 절차에 사용되는 전극 홀더 (Holder)는 단단히 밀봉 할 필요가, 그렇지 않으면 제어 압력 응용 프로그램은 할 수 없습니다. 압력을 잃어버린 건 성공적인 조직의 제거 및 뎁 방해합니다RIS는과 기가 - 씰 형성을 방지 할 수
셀을 청소 한 후 수행되어야한다 원위치 패치 클램프 녹음의 경우, 전체 복부 신경 코드를 둘러싸는 피복 (성인 파리의 중앙 신경 세포의 패치 클램프 녹음을 제거해야 할 필요가있는뿐만 아니라이 있다는 인식 ),하지만, 전지 자체뿐만 아니라 피복에 둘러싸여 할 수 있습니다. MN5는 예를 들어, 만 간단한 고휘도 조명과 함께 볼 수있는 비 세포 드레스로 둘러싸여 있습니다. 또한, 세포 기관 아래에있을 수 있습니다. 셀이 액세스 할 수 없습니다 경우에는, 기관의 청소 절차 (떨어지게 된 것으로 이후) 동안 피펫으로 찢어하지 않을 경우 떨어지게해야합니다. 전체 청소 절차는 너무 많은 조직을 당겨없이 수행해야합니다. 이 절차는 교육을해야합니다. 더 나은 청소, 이상은 즉시 기가 - 바다 표범 (1 초 이내에 셀을 만진 후에는하고 상대의 주파수 될 것입니다) 긍정적 인 압력을 완화.
청소 프로토콜에 따라 및 휴식 -에 다음과 같은 시나리오가 가능 첫째, 셀이 충분히 세척되지 않은 경우, 기가 - 물개는 불가능하고 실험이 종료해야합니다. 둘째, 경우에 청소 기가 - 인감 형성을위한 충분하지만 집의 얇은 거의 볼 잔여은 소마 주변에 남아 있습니다. 이 파열에 막 원인이 다양한 진폭의 누설 전류를 발생합니다. 부족 세포 클리닝 덜 심각한 결과는 칼집 원인의 일부 잔해는 액세스 저항에 증가한다는 것입니다. 패치에 대한 실험 설계 서로 다른 품질 기준에 따라 적용 할 수 있습니다. 현재 클램프에 액션 잠재적 인 패턴을 모니터링하기위한 세포의 막 잠재력 (-55 뮤직 비디오 또는 MN5의 경우에 더 hyperpolarized) 건강해야하지만 액세스 저항은 중요한 문제가 아닙니다. 그러나, 현재 분사 액세스 재에서 작업 잠재력을 evoking 때sistance이 문제가된다. 누출 작은이어야합니다 (MΩ 80보다 높은 의한 MN5 입력 저항해야의 경우) 및 액세스 저항 MΩ 15보다 클 수 없습니다 기록 부근에 발생한 큰 진폭 칼륨 전류를 evoking하십시오. 더 누출이 도입 할 수 없습니다 (MN5 입력 저항 MΩ 120 이상이어야합니다 용) 및 액세스 저항이 12보다 높을 수 없습니다 소마에서 꽤 거리에서 보낸 작은 진폭 수지상의 칼슘 전류 전압 클램프 레코딩에 필요한 공간 클램프에 대한 MΩ. 대부분의 녹음에서 우리는 8 MΩ 10 (같은 시리즈 저항과 전체 셀 용량 보상 후 axopatch 200B 앰프의 다이얼에서 읽기) 사이 액세스 저항과 칼슘 전류를 측정합니다. 기록 할 각 셀 타입 들어, 품질 기준은 개별적으로 결정해야합니다.
여기에서 설명한 청소 절차를 사용하여, 우리는 approxima에 대한 안정적인 레코딩을 보유 할 수tely 90분. 우리는 (특히 Cav2 및 Cav3 칼슘 전류와 쉐이커, 샬 및 지연 정류기의 칼륨 전류에 대한 테스트)를 실행 다운 상당한 준수하지 않습니다. 그러나, 우리는 더 이상 패치를 개최 할 시도하지 않은, 따라서 더 이상 녹음이 가능 여부를 명시 할 수 없습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
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