Summary
In situ patch clamp opnamen worden gebruikt voor elektrofysiologische karakterisatie van neuronen in intacte circuits. In de Drosophila genetische model patch clamping is moeilijk omdat de CNS is klein en omgeven door een robuuste mantel. Dit artikel beschrijft de procedure om de schede en schoon neuronen voor latere patch clamp opnamen te verwijderen.
Abstract
Korte generatie tijden en gemakkelijke genetische technieken maken de fruitvlieg Drosophila melanogaster een uitstekend genetisch model in fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek. Ion-kanalen vormen de basis van alle gedrag, omdat zij bemiddelen neuronale prikkelbaarheid. De eerste spanningsgevoelige gekloonde ionkanalen was de Drosophila spanningsgevoelige kalium kanaal Shaker 1,2. Naar het begrijpen van de rol van ionenkanalen en membraan prikkelbaarheid voor functioneren van het zenuwstelsel is het nuttig om krachtige genetische tools beschikbaar te combineren in Drosophila met in situ patch clamp opnames. Jarenlang dergelijke opnamen werden gehinderd door de kleine omvang van de Drosophila CNS. Bovendien is een robuuste omhulling van glia en collageen vormden hindernissen voor patch pipet toegang tot centrale neuronen. Het verwijderen van deze mantel is een noodzakelijke voorwaarde voor patch clamp opnamen van elke neuron in de volwassen Drosophila CNS. In de afgelopen jarenwetenschappers in staat geweest om in situ patch clamp opnames te voeren van neuronen in de volwassen hersenen 3,4 en ventrale zenuw koord van embryonale 5,6, larvale 7,8,9,10, en volwassen Drosophila 11,12,13,14. Een stabiele giga-seal is de belangrijkste voorwaarde voor een goede patch en afhankelijk van schoon contact van de patch pipet met de celmembraan lekstromen te voorkomen. Daarom moet voor gehele cellen in situ patch clamp opnames van volwassen Drosophila neuronen grondig gereinigd. In de eerste stap, het ganglionische mantel moet enzymatisch behandeld en mechanisch verwijderd om de doelcellen bereiken. In de tweede stap het celmembraan zodanig worden gepolijst dat geen laag van glia, collageen of ander materiaal kan giga-seal vorming storen. In dit artikel wordt beschreven hoe u een geïdentificeerde centrale neuron te bereiden in de Drosophila ventrale zenuw koord, de vlucht motoneuron 5 (MN5 15), voor somatische hele cell patch clamp opnames. Identificatie en zichtbaarheid van het neuron wordt bereikt door gerichte expressie van GFP in MN5. We hebben niet tot doel om de patch-clamp techniek zelf uit te leggen.
Protocol
De volgende beschrijving is niet specifiek voor een motoneuron. Het kan worden gebruikt met elke neuron. In dit voorbeeld gebruiken we de vlucht motoneuron 5 (MN5) dat de twee dorsalmost vezels van de dorsolongitudinal vleugel depressor spier (DLM) innerveert. Te identificeren en te visualiseren MN5 gebruiken we de UAS/GAL4 systeem om GFP uit te drukken in de vlucht motoneuronen (en enkele andere neuronen).
1. Dissectie van Adult Drosophila aan het dorsale deel van de ventrale zenuw snoer (VNC) Toegang
- Ontleden volwassen Drosophila rugzijde langs de dorsale middellijn in een Sylgard beklede petrischaal (35 mm diameter) zoals beschreven in Ryglewski en Duch (2009 13). Een filmpje van deze dissectie is online beschikbaar via Jove (Boerner en Godenschwege 16. Hieronder vindt u een korte beschrijving van de dissectie.
- Volwassen vliegen verdoofd door afkoeling op ijs gedurende 1 minuut. Dit kan worden bereikt door voorkoelen een lege fly flacon (zonder voedsel)op ijs en het plaatsen van de vlieg in de al koud flesje. Vleugels en poten worden verwijderd met een schaar.
- De vlieg vervolgens vastgezet rugzijde in een Sylgard beklede petrischaal (we het deksel van een 35 mm petrischaal boordevol met Sylgard, fig. 1A, B) met een plastic ring (inwendige diameter 9 mm, 1,3 mm dik ) vastgelijmd aan de Sylgard met petrolatum.
- Het gebruik van het deksel van een 35 mm petrischaal vergemakkelijkt de toegang tot de VNC een patch pipet onder visualisatie met water dompelen lens. Dit helpt om de pipet oppervlakkig te brengen zonder het aanraken van de wand van de schotel.
- De kunststof ring kan door het boren van een gat in een dunne (we gebruiken 1,3 mm dikte) kunststofplaat. We maken gebruik van een tang om de buitenomtrek van de ring te bepalen, zodat dit past bij het gerecht.
- Onderdompelen fly in normale zoutoplossing (Figuur 1C; samenstelling van zoutoplossing in mM: NaCl 128, KCl 2, CaCl2 1,8, MgCl2 4, 5 HEPES, sucrose ~ 35 depending van de osmolaliteit van de oplossing, pH tot 7,25 met 1 M NaOH wordt osmolaliteit bijgesteld tot 290 mOsM met sucrose).
- Het dier wordt doorsneden langs de dorsale middellijn, en de grote dorsale longitudinale vlucht spieren worden zijdelings uitgerekt en vastgemaakt aan darm, slokdarm, en de VNC onder bloot te leggen. Na verwijdering van de darm en de slokdarm, de VNC blootgesteld (Figuur 1D).
- Optioneel kan de vlieg worden onthoofd op deze stap (figuur 1E). Verwijderd wordt de toegang met het enzym en patch pipetten gemakkelijker en MN5 dendrieten niet verstoord tijdens het reinigen soma (dendrieten posterior de soma, figuren 2B, C). Echter kan de kop ook intact indien vereist door de proefopzet (bijvoorbeeld bestuderen van dalend ingang thoracale motoneuronen). In dit geval pipet worden gereduceerd door posterior of laterale (zijwaartse figuur 2A).
- Voor een snellesaline uitwisseling tijdens de experimenten volume van de opname kamer wordt geminimaliseerd door een kunststof ring (inwendige diameter 9 mm) om de uitgesneden dier en lijmen aan de schaal met petrolatum (Figuren 1A, B, volume van opname kamer is ~ 200 pi) .
- De bereiding wordt vervolgens gemonteerd op een verticale vaste fase fluorescentie microscoop (we gebruiken Zeiss Axioskop 2 FS plus, Zeiss, Duitsland) en bekeken met een hoge NA (> 0,75), lange werkafstand (> 2 mm), 40x water dompelen doelstelling. Het perfusiesysteem (saline-in, saline-out), wordt de aarddraad en het enzym pipet ingebracht in de opname kamer (figuren 1F - J, L).
2. Visualisatie van MN5 (zie figuur 2 en 3), Head Off
- Monteer de petrischaal op een rechte vaste fase epifluorescerende microscoop.
- Plaats de schaal met de vlieg in het zo dat het voorste deel van de kant waar de elektrode houder is geconfronteerd metopbouw (figuur 1).
- Gebruik een hoge vergroting (40x of hoger), hoge NA water dompelen lens (NA 0,75 of hoger) en een GFP-filter om de VNC te verlichten. Voor een goede visualisatie van de cel tijdens het reinigen we 40x water dompelen lenzen met een NA van ofwel 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW), of een NA van 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). Voor een goede verbinding met de patch pipet de werkafstand moet 2 mm of groter zijn.
- Beide MN5 liggen in het mesothoracic neuromere op het dorsale oppervlak van de ganglion dicht bij de middellijn tussen - en eventueel gedeeltelijk door - prominent trachea (figuren 2 en 3). MN5 met hun dendrieten worden weergegeven als een diffuse groene omgeving. De somata worden duidelijker na het reinigen. Echter de dendrieten niet scherp, maar blijven ze wazig is door nog onder weefsel (figuren 2A, B).
- In onze opstelling gebruiken we een HBO 100 fluorescentie lichtbron in wat we niet kunnen modify de lichtopbrengst intensiteit. We gebruiken grijsfilters om overbelichting van het weefsel te veel fluorescerend licht, met name blauw licht te vermijden. Dit kan beschadiging en foto uiteindelijk dood de cellen. We maken gebruik van neutrale dichtheid van 0,8. No bleken voordoet tijdens de reinigingsprocedure. Indien het bleken gebeurt, het meest waarschijnlijk de lichtopbrengst is te sterk. De cel is foto beschadigd.
- Als LED verlichting wordt de intensiteit instellingen moeten worden bepaald door de experimentator. Bleken is een teken van zonbeschadigde en moet worden vermeden.
3. Alternatieve methode voor visualisatie van MN5
Voor onze toepassing is het belangrijk om de cel gemerkt, bijvoorbeeld met gerichte expressie van GFP. Als alternatief kan DiI, een lipofiele kleurstof, gebruikt worden om labelen retrogradely deze neuron. In dit geval kleurstof kristallen worden in de vlucht spier met een insect minutien pin, en de wond wordt gesloten met UV uitharding lijm.
- Een DiI stock oplossing door oplossen van een paar DiI kristallen (geen specifieke hoeveelheid) in 100 pl 70% ethanol. Deze oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C tot gebruik op. Herhaald invriezen en ontdooien geen probleem.
- 5 pi van de oplossing worden vervolgens gepipetteerd op een onbehandeld dekglas. Wacht tot de ethanol verdampt. Dit duurt slechts een paar minuten.
- Plaats een vlieg in een vooraf gekoelde flacon (door aan het in ijs) en koelen gedurende een korte tijd (minder dan 1 min) op ijs. Leg de koude verdoofde vlieg op een koelplaat onder een dissectie stereomicroscoop.
- Center de vlieg en houd deze op zijn plaats zodat het niet kan worden opzij geduwd gemakkelijk wanneer zij worden gepord met een minutien pin.
- Gebruik twee tangen, een aan de minutien pin, de andere aan de vlieg ingedrukt te houden.
- Gebruik grof forceps een insect minutien pin bezit en enkele DiI krassen van het dekglaasje zodat er een DiI kristal op de punt van de pen minutien (met deDiezelfde dekglas en precies dezelfde plek op dat de dekking slip telkens helpt om meer kleurstof te krijgen op de pen telkens wanneer de procedure wordt gedaan). De pen moet niet te worden opgemerkt, kan het gemakkelijker buigen en vervolgens moeilijk te gebruiken.
- Dan prik een gat in het midden van dorsale van de vlieg thorax met de minutien pin met Dil op het puntje. De twee dorsalmost spiervezels van de dorsolongitudinal vlucht spier (DLM, spiervezels 5 en 6 aan elke kant) worden geïnnerveerd door MN5. Daarom, het plaatsen van kleurstof kristallen in het midden van de thorax verzekert dat beide MN5 zal worden geëtiketteerd, omdat beide spiervezels 6 van de DLM zal worden gekwetst en nog wat kleurstof.
- De kleurstof moet direct worden geplaatst onder de nagelriem. Als de kleurstof te diep geplaatst, kan de vlieg worden gestoken of andere neuronen (bijvoorbeeld MN1-4) krijgen ook.
- Dit wordt herhaald totdat voldoende kleurstof (dit is een kwestie van ervaring en praktijk) wordt in de thorax
- Dil is geen water soluble, daarom zal het niet oplossen in het cytosol van de spier en moet worden "gevuld" onder de cuticula.
- Dan nog een minutien pen wordt ondergedompeld in een druppel van UV-uithardende lijm (we een druppel lijm in een gewicht van boot).
- De lijm die nu op de punt van de pen minutien wordt gebruikt om de wond waar de kleurstof kristallen werden ingevoegd sluiten.
- Na het aanbrengen van lijm (iets op de wond, niet de gehele thorax sluiten) een UV pistool wordt gebruikt om de lijm te harden. We maken gebruik van twee 10 s intervallen van UV-blootstelling aan licht.
- De behandelde vliegen worden op verse levensmiddelen in een vlieg flacon. Zorg ervoor dat de lijm plek op de vliegen 'thorax niet kleeft aan de wanden van de flacon welke valkuilen de vlieg.
- De kleurstof heeft een paar uur worden benaderd neuron. Het reist langs het membraan, niet in het cytosol omdat het lipide oplosbaar. We behandelen de dieren in de middag en laat ze gedurende de nacht.
- Patch clamp experimenten worden uitgevoerd de volgende dag. De neuronen minder zichtbaar in vergelijking met het gebruik van genetische uitdrukking GFP.
4. Bereiding van het enzym pipet die gebruikt voor het reinigen
Het is belangrijk om een constante stroom van zoutoplossing door de opname kamer. Na het bad volume opkomst en ondergang moet worden vermeden, omdat het zorgt ervoor dat trillingen en offset potentiële veranderingen tijdens de experimenten. Perfusie en zuig moeten dienovereenkomstig worden vastgesteld. Hierdoor oplossing uitwisseling veel eenvoudiger, waardoor belangrijk is voor snelle uitspoelen van protease voor het experiment en snelle uitwisseling van farmacologische middelen tijdens het experiment.
- Verzekeren perfusie van de opname kamer (stroomsnelheid ongeveer 2 ml per min). Debiet kan worden geregeld door hetzij een haan of via specifieke diameter buizen (hoe groter de diameter, hoe hoger de stroomsnelheid). Het volume van de kamer zo klein mogelijk om snelle uitwisseling van de oplossing in th waarborgene kamer. Dit garandeert een snelle verwijdering van protease en blokkers van de opname kamer.
- Het volume van de kamer is afhankelijk van de saline (Afbeelding 1) van de perfusie wordt ingebracht in de opname kamer (wanneer het water immersie-objectief wordt neergelaten in het bad).
- Zorg ervoor dat de zoutoplossing-out is gepositioneerd op een manier die het de titer van de opname compartiment niet stijgen en dalen constant (zuiging, rijzen, afzuigen, rijzen), maar blijft constant (steady zuiging). Wij bepalen gestage en stabiele perfusie door de constante, nooit onderbroken gorgelend geluid dat wordt geproduceerd door voortdurend zuigen zoutoplossing uit het bad.
- Zoals zout-in en-out gebruiken we injectienaalden die zijn gebogen en bevestigd aan smalle buizen en dicht bij de opname kamer met behulp van plasticine (Figuur 1F).
- Trek een patch pipet en breek de punt een beetje onder visuele controle. Gebruik fijne schone tang. Wanneer het visualiseren van de pipet under de 40x water immersie lens van de pipet tip diameter moet ongeveer tussen de 40 en 70% van soma van de cel diameter. Zeer grote tips (ongeveer celdiameter of meer) kunnen ook worden gebruikt, echter de waarschijnlijkheid van scheuren het cellichaam toe door de capillaire krachten van de pipet. Wordt de pipet zeer gering (minder dan 10% van de diameter soma) verstopt het gemakkelijk waardoor met een of meer nieuwe pipet (s) tijdens de reinigingsprocedure.
- Vul de pipet met 2% protease in PBS buffer of zoutoplossing zonder verstopping is.
- Plaats het enzym pipet in de elektrodehouder. Voor een goede beheersing van de toegepaste druk, de houder moet worden lekvrij.
- Bevestig een slang aan de kleine uitlaat van de pipet houder en zet deze op een manier die trekken aan het vrije uiteinde van de slang niet de pipet die werd in de pipet houder beïnvloeden. Controleer voor beweging onder de microscoop.
- Plaats een plastic p ipette tip (het soort dat wordt gebruikt met een automatisch pipetteerapparaat gebruiken we blauw 1000 ul vlak, maar dit is een kwestie van voorkeur. Andere afmetingen kunnen eveneens worden gebruikt) of een injectiespuit met een pik in het vrije einde van de buis kunnen positieve en negatieve druk op het enzym / patch pipet. Positieve druk wordt uitgeoefend door een van beide te blazen in de pipetpunt (te gebruiken als een mondstuk) of door op de injectiespuit naar beneden. Negatieve druk wordt uitgeoefend door afzuiging (met de mond via het mondstuk) of door het uittrekken van de spuit.
- Het doel van de positieve en negatieve druk toepassingen is het losmaken en verwijderen van cellen en afval rondom de cellen in onderzoek. Overdruk wordt uitgeworpen enzym uit de pipet reinigen en blaas afval van het oppervlak van het CZS. Onderdruk wordt gebruikt om puin zuigen uit de VNC (zoals een stofzuiger).
5. Reiniging van GFP-gelabeld MN5 (Figuur 3 en Video)
inhoud "> Bericht aan de lezer: Beelden van MN5 voor en na reiniging zijn moeilijk te onderscheiden in figuur 3 Dit is wat je krijgt in het echte leven Het zal nog enige training om te leren om de subtiele verschillen tussen gereinigd en ongereinigd te onderscheiden.. neuronen. Houd er rekening mee dat deze subtiele verschillen beter te zien in bewegende beelden. Daarom de film geeft een betere indruk dan de statische beelden (Figuur 3).- Visualiseer het enzym gevuld pipet onder de 40x water dompelen lens met helder licht (Figuur 3B, witte pijl).
- Focus op de pipet tip. Als het verstopt is, probeer dan om het vuil eruit te komen door het toepassen van positieve of negatieve druk. Als het vuil niet naar buiten komen, bereiden een nieuw enzym gevulde pipet.
- Schakel over naar TL-licht (Figuur 3A).
- Kantel het enzym pipet en opnieuw concentreren tot het cellichaam te zien.
- Wanneer het enzym pipet dicht bij decellichaam, schakel de perfusie uitgeschakeld.
- Breng positieve druk in korte uitbarstingen in de richting van het cellichaam, zodat alles wat belemmert de toegang tot de cel zal worden losgemaakt. Dit moet worden gedaan totdat het weefsel rondom het cellichaam loskomt.
- Ook dorsaal verplaatst het enzym pipet om losse vuil dat een overblijfsel zijn van het ganglionisch omhulsel dat de VNC omringt te vangen. Het kan reeds zijn verwijderd door de ontleding vóór de montage van de bereiding op de microscoop (dit is niet altijd het geval).
- Met afwisselende toepassing van positieve en negatieve druk, gebruiken het enzym pipet als een stofzuiger en vacuüm rond het cellichaam. Het is niet nodig de hele cellichaam geheel los. Reinigen van het voorste deel van het soma zal doen (of het achterste of laterale deel afhankelijk van uit welke kant de pipet benadert de soma).
- Deze reiniging procedure wordt gedaan totdat het membraan ziet er vrij van vuil.
- De membrane schoon als er geen "schaduw" of diffuse contrast tussen cel en het omringende weefsel wanneer bekeken met fluorescente licht alleen. Dit kan het best worden gezien met hoge intensiteit blauw licht. Daarom verhogen lichtintensiteit voor een moment (verwijderen we de grijsfilters om dat te bereiken). Merk op dat een uitgebreide blauw blootstelling aan licht, zoals bepaald door een reguliere HBO 100 kwik lamp kan foto schade in ongeveer een minuut veroorzaken. Hierdoor zal het GFP-signaal te vervagen als afsterven.
- Schakel over naar helder licht en te verwijderen cellen en puin die niet konden worden gezien met TL-licht. Merk op dat visualisatie van luchtpijp en reinigen de status kunnen profiteren van het schakelen tussen fel licht en tl-licht.
- Wanneer het reinigen is voltooid en de cel lichaam lijkt schoon, zet dan de perfusie-systeem op (doe dat ook als de reinigingsprocedure duurt langer dan 3 tot 5 minuten verder schoon met vaste perfusie) en het licht uit.
- Spoel de cel for ~ 15 tot 20 minuten met zoutoplossing of de oplossing die wordt gebruikt voor de volgende toepassing. Niet minder dan 40 ml moet gaan door middel van de opname kamer om zeker te zijn dat de protease wordt uitgewassen. Protease resten op het celoppervlak zal plotselinge celdood in anderszins stabiele patch clamp opnamen.
6. Elektrofysiologie
- Conventionele in situ whole cell patch clamp in spanningsklem en stroomtang modus wordt met behulp van een Axopatch 200B versterker (Molecular Devices, USA); signalen worden gedigitaliseerd met een Digidata 1320 (Molecular Devices, USA) en geanalyseerd met pClamp 10.2 software.
- Patch pipetten worden getrokken van borosilicaatglas capillairen met een verticale pipet trekker (Narishige, PC-10).
- Pipetpunt weerstanden liggen tussen 5,8 en 6,2 MQ (stroomtang en kalium huidige opnamen) en tussen 2,8 en 3,5 MQ (voor calcium huidige opnames) respectievelijk. Tip weerstand hangtintra-en extracellulaire oplossing (voor details 13, 14 te zien).
7. Representatieve resultaten
Na de reinigingsprocedure beide MN5 klaar voor in situ volledige cel patch clamp (figuur 3). De volgende sectie toont representatieve spanning klem en stroomtang sporen zoals opgetekend uit MN5 soma na het gebruik van de beschreven reinigingsprocedure. MN5 drukt een verscheidenheid van spanningsgevoelige ionenkanalen (zie ook 13,14). We tonen een voorbeeld van voltage gated calciumstromen (figuur 4), voltage gated kalium stromen (figuur 5) en actiepotentiaal sporen (figuur 6). Spanningsgevoelige calcium en kalium stromen werden opgewekt door dergelijke protocollen voltage, maar de oplossingen die zijn gebruikt verschillen zodat alleen de ionkanalen onderzochte bij lopende gaan (voor details zie 13,14). Alle andere grote spanningsgevoelige ion channels geblokkeerd werden (spanningsgevoelige natriumkanalen met 100 nM tetrototoxin - direct gepipetteerd in het bad, de perfusie werd stopgezet gedurende twee minuten - calciumkanalen met 500 uM cadmiumchloride, kalium kanalen met 2 mM 4-aminopyridine (4-AP) en 30 mM tetraethylammoniumchloride extracellulair en 0,5 mM 4-AP, 20 mM tetraethylammoniumbromide en 144 mM cesiumchloride intracellulair via de intracellulaire patch oplossing in de patch pipet (voor details zie 13,14). Actie mogelijke sporen werden opgeroepen door de huidige injectie in de MN5 soma (Figuur 6) zonder gebruik van een ionkanaal blokkers 12.
Figuur 1. De reiniging setup. De vlieg wordt vastgepind op een Sylgard gecoate deksel van een 35 mm petrischaal waarin we gelijmd een plastic ring (binnendiameter 9 mm, 1,3 mm dik) wi petrolatum (A, B). Na onderdompeling in de vlieg zoutoplossing (C) wordt geopend langs de dorsale middenlijn. Darm en slokdarm verwijderd om de ventrale zenuwkoord (D) blootstellen. Voor een betere toegankelijkheid van de thoracale neuromere de kop is verwijderd (E). Na montage van de bereiding op een opstaande epifluorescentiemicroscoop worden de perfusiesysteem (F, G, saline-in, saline-out, witte pijlen links) en de aarddraad in positie gebracht (F, G, witte pijl op rechts). Ingevulde het enzym reinigen pipet wordt in positie gebracht nadat het water immersie-objectief (40x NA 0,8) is neergelaten in het bad (H). Voor de duidelijkheid hebben we laten zien dat het al voor de doelstelling is verlaagd (F, G, witte pijl aan de rechterkant). De hoek waaronder het enzym pipet die gebonden is aan een 1-HL-U elektrodehouder (J) gaat de opname kamer is belangrijk omdat de pipet niet aanraken zowel het doel als de plastic ring. Deze hoek varieert van installatie tot installatie. Hier is ongeveer 30 ° (zie tekening in J, pijl in K). De opstelling van de pipet in de houder die is bevestigd aan een headstage getoond in (L). De headstage is bevestigd aan een gemotoriseerde micromanipulator. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. MN5 in het ventrale zenuw koord. MN5 gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door zijn ligging in het Drosophila ventrale zenuw koord (VNC) wanneer GFP is genetisch uitgedrukt door het gebruik van motoneuron specifieke GAL4 drivers (A). De gestippelde rechthoek geeft de thoracale neuromere. Om een idee te krijgen hoe de maten zich tot elkaar verhouden krijgen, laten we een reiniging patch pipet het naderen van de linker MN5 vanaf de linkerkant van de dorsolongitudinal vlucht spier. Voor een betere visualisatie werd de patch pipet gevuld met een rode kleurstof (dextran-tetramethylrhodamine, A). De contralatmeen uitstekende MN5 bevinden zich aan de rugzijde van de mesothoracic neuromere van de VNC aan weerszijden van de middellijn (projectie gezien een confocaal beeld stack in B). De ipsilateraal uitstekende MN1-4 zijn meer lateraal gelegen en naar voren over MN5 (pijlen in B). De gestippelde cirkel tussen beide MN5 toont de dendrieten van de vlucht motoneuronen in de neuropil inbegrip MN5 (B). GFP label in (B) werd versterkt door immunohistochemische kleuring met een antilichaam tegen GFP. Details van MN5 morfologie worden zichtbaar gemaakt door het vullen van de neuron intracellulair (iontoforetisch) met de onzichtbare tracer neurobiotin en vervolgens confocale beeldacquisitie (C). Kleuring werd zichtbaar gemaakt met streptavidine gekoppeld aan een fluorofoor. Scale bar is 30 um.
Figuur 3. MN5 voor en na reiniging. Visualisatie van MN5 wordt bereikt door expressie van GFP met de UAS/GAL4systeem (A, C, zie etiket). MN5 voor (A, B) en na (C, D) de reinigingsprocedure. Linkerkant van elke foto anterior vertegenwoordigt, rechterkant vertegenwoordigt posterior. Neuronen op te nemen van zijn gereinigd met een protease gevuld patch pipet met een gebroken tip. Het enzym pipet slechts vaag zichtbaar (A, B, zie etiket). Inzet in A toont een vergroting van het onderste MN5 met het enzym pipet bijna de cel. MN5 niet zichtbaar in fel licht voordat de reinigingsprocedure (B). Luchtpijp moet worden verwijderd als zij betrekking hebben op de cellen in onderzoek. Na de reinigingsprocedure het contrast tussen cel en omliggende weefsel is scherper (C, onder MN5), en de cel kan nu worden gezien in helder licht (D). De pipet tip kan duidelijker wanneer fel licht wordt gebruikt te zien. De uitbreiding toont het gebied in de gestippelde vierkant met MN5 cellichaam grenzen omringd met een stippellijn voor betere identificatie. Visualisatie in helder licht helpt vaak oordeel van hygiëne.
Figuur 4. Calciumstroom in MN5. Voorbeeld opnemen van het volledige cel calcium stromingen opgenomen van MN5. Ten minste twee verschillende calciumstromen getoond, een lage spanning geactiveerde transient calcium en aanhoudend hoge voltage calciumstroom. Stromingen werden opgeroepen van een bedrijf dat potentieel van -90 mV. Spanningsverschillen van -90 mV tot +20 mV toegepast. Blokkers werden gebruikt om de meeste andere ionkanalen blokkeren. Artefacten werden weggelaten voor de duidelijkheid (voor de karakterisering van MN5 calciumstromen zie Ryglewski et al.., 2012).
Figuur 5. Kalium stromen in MN5. Voorbeeld opname van gehele cellen kalium stromingen opgenomen van MN5. Getoond stromen omvatten calcium geactiveerd kalium stromen als er geen calciumantagonisten werden toegepast. Stromingen werden opgeroepen van een bedrijfpotentieel van -90 mV voor de totale kaliumstroom (A) of van een bedrijf potentiaal van -20 mV tot voorbijgaande stromen kalium inactiveren en alleen de aanhoudende kaliumstroom (B). Spanningsverschillen van -90 mV tot +20 mV toegepast in 10 mV stappen. Offline aftrekken van kalium stromingen opgeroepen uit een die potentieel van -90 mV (A) en -20 mV (B) laten stromen pure transient kalium (C). Spanningsgevoelige natriumkanalen werden geblokkeerd. Artefacten werden weggelaten voor de duidelijkheid (voor de karakterisering van MN5 spanning en calcium kalium stromingen zien Ryglewski en Duch, 2009).
Figuur 6. Firing patroon tentoongesteld door MN5. Voorbeeld opname van het afvuren patronen zoals opgewekt in MN5 door somatische huidige injecties (0,4 nA, zwart, 0,5 nA, grijs) van 200 ms duur. Rust membraanpotentiaal was -59 mV. Geen ion kanaal blokkers werden gebruikt. (Voor stroomtang analyse van MN5 vurenpatronen te zien Duch et al.., 2008).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het visualiseren van de cellen met fluorescerende eiwitten zoals GFP, is het belangrijk om niet de bereiding overbelichte te veel licht. Dit kan resulteren in schade foto. We maken gebruik van 100W HBO korte boog kwik lampen voor verlichting, en we hebben ook ND (neutrale dichtheid) het gebruik van 0,8 (Chroma ND filters 0,3 en 0,5). Om te kunnen beoordelen van de kwaliteit van de reiniging goed zicht is cruciaal. Derhalve kan ND filters worden verwijderd voor een korte periode van ongeveer 20 seconden voor meerdere keren.
Bij de toepassing van een aantal positieve druk, het cellichaam "flappen" een beetje. Dit helpt het beoordelen van de kwaliteit van de netheid. In het ventrale zenuw snoer contrast erg laag is, en beweging kan zeer nuttig zijn om cellen te visualiseren. De elektrode houder die wordt gebruikt voor het reinigen procedure (ook voor patch clamping) moet goed afgesloten, anders geregeld druktoepassing niet mogelijk. Verlies van druk zal verstoren succesvolle verwijdering van weefsel en debris en wordt voorkomen dat giga-seal vorming
In het geval dat in situ patch clamp opnames worden uitgevoerd na het schoonmaken van de cel, zich ervan bewust dat er niet alleen een omhulsel rond de ventrale zenuw snoer als geheel (die moet worden verwijderd voor elke patch-clamp-opname van een centrale neuron van volwassen vliegen ), maar cellen zelf kunnen worden omgeven door een mantel en. MN5 bijvoorbeeld is omgeven door een niet-cellulaire omhulsel dat kan worden gezien alleen korte hoge intensiteit verlichting. Bovendien kunnen cellen zich onder de trachea. Indien de cel niet toegankelijk, de luchtpijp te worden getrokken vernietigd wanneer niet opgelicht met de pipet tijdens de reiniging (nadat opzij getrokken). De gehele reinigingsprocedure moet worden gedaan zonder het trekken van de weefsels te veel. Deze procedure vereist training. Hoe beter de reiniging, hoe hoger de frequentie van directe giga-afdichtingen (binnen 1 s na het aanraken van de cel en relhet verlichten van positieve druk).
Afhankelijk van de reiniging protocol en het uiteenvallen in de volgende scenario mogelijk: Ten eerste, als de cellen niet goed genoeg schoongemaakt, een giga-seal niet mogelijk en het experiment worden afgesloten. Tweede, in sommige gevallen reiniging voldoende is voor giga-seal vorming, maar een dunne, moeilijk zichtbare rest van de mantel blijft rond de soma. Hierdoor zal het membraan openbarst en lekstromen veroorzaken verschillende amplitudes. Een minder ernstig gevolg van onvoldoende reiniging cel is dat sommige resten van de mantel oorzaak verhogingen toegang weerstand. Afhankelijk van de proefopzet verschillende kwaliteitscriteria voor de patch van toepassing kunnen zijn. Voor het monitoren van de actiepotentiaal patronen in stroomtang de membraanpotentiaal van de cel moeten gezond (-55 mV of meer gehyperpolariseerde in het geval van MN5), maar de toegang weerstand is niet zo'n belangrijk onderwerp. Echter, wanneer het oproepen van actiepotentialen door de huidige injectie toegang reweerstand wordt een probleem. Voor het oproepen grote amplitude kalium stromen die afkomstig zijn dicht bij de opname onderzocht het lek moet klein (bij MN5 ingangsweerstand most meer dan 80 MQ) en toegang weerstand mag niet groter zijn dan 15 MQ. Voor de ruimte klem die nodig is spanningsklem opnamen van kleine amplitude dendritische calciumstromen die beginnen op geruime afstand van de soma geen lek kan worden ingebracht (bij MN5 ingangsweerstand MQ moet boven 120) en toegang weerstand mag niet meer dan 12 MQ. In de meeste opnames meten we calciumstromen met toegang weerstanden tussen de 8 en 10 MQ (zoals lezen van de draaiknop op de axopatch 200B versterker na serieweerstand en volledige cel capaciteit compensatie). Voor elk celtype worden opgenomen, moeten deze kwaliteitscriteria individueel bepaald.
Met behulp van de reinigingsprocedure hier beschreven, kunnen wij houden de opnames stabiel ongetely 90 minuten. Wij niet in acht grote run-down (speciaal getest voor CAV2 en Cav3 calcium stromen en voor Shaker, Shal, en vertraagde gelijkrichter kalium stromen). We hebben echter niet getracht de patch langer vasthouden en daarom niet of meer opnamen mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
