Framställning av Published: October 15, 2012 doi: 10.3791/4264

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stefanie Ryglewski¹, Carsten Duch¹

¹School of Life Sciences, Arizona State University

Summary

In situ patch clamp inspelningar används för elektrofysiologiska karakterisering av nervceller i intakt kretsar. I Drosophila genetisk modell patch fastspänning är svårt eftersom CNS är liten och omges av en robust hölje. I den här artikeln beskriver det förfarande för att ta bort hylsan och rena nervceller för efterföljande inspelningar patch clamp.

Abstract

Korta generationens tider och enkel genetiska tekniker gör bananfluga Drosophila melanogaster ett utmärkt genetisk modell i grundläggande neurovetenskap forskning. Jonkanaler är grunden för alla beteenden, eftersom de förmedlar neuronala retbarhet. Den första spänningen jonkanal klonat var Drosophila spänningsstyrda kaliumkanal Shaker ^1,2. Mot förstå den roll jonkanaler och membran upphetsning för nervsystemets funktion är det bra att kombinera kraftfulla genetiska verktyg som finns i Drosophila med in situ patch clamp inspelningar. Under många år sådana inspelningar har hämmats av den lilla storleken hos Drosophila CNS. Dessutom utgjorde en robust hölje av glia och kollagen hinder för patch pipett tillgång till centrala neuroner. Borttagning av denna hölje är en nödvändig förutsättning för inspelningar patch clamp från någon neuron i den vuxna Drosophila CNS. Under de senaste årenforskarna har kunnat föra in situ inspelningar patch clamp från nervceller i den vuxna hjärnan ^3,4 och ventrala nerv ur embryonala ^5,6, larver ^7,8,9,10 och vuxna Drosophila ^11,12,13,14. En stabil giga-tätning är den viktigaste förutsättningen för en god lapp och beror på ren kontakt av plåstret pipetten med cellmembranet för att undvika överslag. Därför måste för helcells in situ inspelningar patch clamp från vuxna Drosophila nervceller rengöras grundligt. I det första steget, har den ganglionisk manteln som skall behandlas enzymatiskt och mekaniskt bort för att göra målcellerna tillgängliga. I det andra steget, har cellmembranet kan poleras så att inget skikt av glia, kollagen eller annat material kan störa giga-tätning bildning. I denna artikel beskrivs hur du förbereder en identifierad centrala neuron i Drosophila ventrala nerv sladd, flygningen motoneuron 5 (MN5 ¹⁵⁾ för somatisk hela CELL patch clamp inspelningar. Identifiering och synlighet av neuron uppnås genom målinriktad uttryck av GFP i MN5. Vi syftar inte att förklara tekniken patch clamp själv.

Protocol

Den följande beskrivningen är inte specifik för en motoneuron. Den kan användas med alla neuron. I det här exemplet använder vi flygningen motoneuron 5 (MN5) som innerverar de två dorsalmost fibrerna i dorsolongitudinal flygeln depressor muskel (DLM). Att identifiera och visualisera MN5 vi använder UAS/GAL4 systemet att uttrycka GFP i flygningen motoneuroner (och några andra nervceller).

1. Dissektion av vuxna Drosophila till Access ryggstycket av den ventrala nerv sladd (VNC)

1. Dissekera en vuxen Drosophila ryggsidan upp längs sin dorsala mittlinjen i en Sylgard belagd Petriskål (35 mm diameter), såsom beskrivits i Ryglewski och Duch (2009 ^13). En film av denna dissektion är tillgänglig online via JUPITER (Boerner och Godenschwege ^16. Nedan följer en kort beskrivning av dissekering.
2. Vuxna flugor bedövas genom kylning på is under ca 1 min. Detta kan uppnås genom förkylning en tom flyga flaska (utan mat)på is och placera flugan i den redan kalla flaskan. Vingar och ben avlägsnas med en sax.
3. Flugan därefter nålas ryggsidan upp i en Sylgard belagd Petriskål (vi använder locket av en 35 mm petriskål fylld till kanten med Sylgard, fig. 1A, B) med en plastring (innerdiameter 9 mm, 1,3 mm tjock ) limmas på Sylgard med vaselin.
4. Användningen av locket på en 35 mm petriskål underlättar tillgången till VNC med en patch-pipett enligt visualisering med en vatten doppa lins. Detta bidrar till att införa pipetten grunt utan att vidröra väggen av skålen.
5. Plastringen kan göras genom att borra ett hål i en tunn (vi använder 1,3 mm tjocklek) plastark. Vi använder en avbitartång för att definiera den yttre omkretsen av ringen, så att den passar skålen.
6. Sänk flugan i normal saltlösning (Figur 1C, sammansättning av saltlösning i mM: NaCl 128, KCl 2, CaClj ₂ 1,8, MgCb ₂ 4, 5 HEPES, sackaros ~ 35 Depending på osmolaliteten av lösningen, pH-värdet justeras till 7,25 med 1 M NaOH, är osmolaliteten justeras till 290 mOsM med sackaros).
7. Djuret dissekeras längs ryggens mittlinje, och de stora rygg längsgående flyg muskler sträcks i sidled och fästs att exponera tarmen, matstrupe och VNC under. Efter avlägsnande av tarmen och matstrupen, är VNC exponerad (figur 1D).
8. Eventuellt kan flugan kan halshöggs vid detta steg (figur 1E). Ta bort huvudet gör åtkomst med enzymet och pipetter patch mer praktiskt, och MN5 dendriter inte störs vid rengöring av Soma (dendriter är posteriort om soma, figurer 2B, C). Emellertid kan huvudet också lämnas intakt om det krävs av experimentell design (t.ex. studier av fallande bidrag till bröstkorg motoneuroner). I detta fall pipetten kan införas från bakre eller laterala (lateral, figur 2A).
9. För snabbsaltlösning utbyte under experimenten volymen av inspelningen kammaren minimeras genom att placera en plastring (innerdiameter 9 mm) runt den dissekerade djuret och limning till skålen med vaselin (fig. 1A, B, volym inspelning kammare är ~ 200 | il) .
10. Beredningen är sedan monteras på en upprättstående fast fas fluorescensmikroskop (vi använder Zeiss Axioskop 2 FS Plus, Zeiss, Tyskland) och visade med en hög NA (> 0,75), långa arbetsavstånd (> 2 mm), 40x vatten doppa mål. Perfusionssystemet (saltlösning in, saltlösning ut), är jordledningen och enzymet pipetten införd i inspelningen kammaren (figurerna 1F - J, L).

2. Visualisering av MN5 (se figur 2 och 3), Head Off

1. Montera petriskål en upprätt fast fas epifluorescensmikroskop.
2. Placera skålen med flugan i den så att den främre delen sidoytorna där elektrodhållaren ärmonterad (figur 1).
3. Använd en hög förstoring (40x eller högre), hög NA vatten doppa lins (NA 0,75 eller högre) och en GFP-filter för att belysa VNC. För god visualisering av cellen vid rengöring använder vi 40x vatten doppa objektiv med en NA av antingen 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW) eller en NA på 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). För god åtkomst med fläckpipetten arbetsavståndet bör vara 2 mm eller större.
4. Båda MN5 är belägna i mesothoracic neuromere på den dorsala ytan av ganglion nära mittlinjen mellan - och möjligen delvis täcks av - framträdande luftstrupe (figurerna 2 och 3). MN5 med sina dendriter visas som en diffus grönområde. Den somata blir tydligare efter rengöring. Men kommer deras dendriter visas inte skarpa men förblir suddiga på grund av dem fortfarande omfattas av vävnad (fig. 2A, B).
5. I vår inställning använder vi en HBO 100 fluorescens ljuskälla där vi inte kan modify ljusstyrkan intensitet. Vi använder neutrala täthetsfilter att undvika överexponering av vävnaden till för mycket fluorescerande ljus, speciellt blått ljus. Detta kan orsaka foto skador och i slutändan kommer att döda cellerna. Vi använder neutral densitet av 0,8. Ingen blekning bör ske under rengöringsproceduren. Om blekning inträffar troligen ljusstyrkan är för stark. Cellen är foto skadad.
6. Om LED-belysning används för intensitet inställningarna måste bestämmas av försöksledaren. Blekning är ett tecken på fotoskador och måste undvikas.

3. Alternativ metod för visualisering av MN5

För vår ansökan är det viktigt att ha i cellen märkt, exempelvis med riktad uttryck av GFP. Alternativt, kan Dil, en lipofil färgämne, kan användas för att märka retrograd denna neuron. I detta fall dye kristaller in i flygningen muskeln med en insekt minutien stift, och såret stängs med UV-härdning lim.

1. Gör en Dil stamlösning genom upplösning några Dil kristaller (ingen specifik belopp) i 100 pl 70% etanol. Denna lösning kan förvaras vid -20 ° C tills de användes upp. Upprepad frysning och upptining är inte ett problem.
2. 5 pl av lösningen därefter pipetteras på en obehandlad täckglas. Vänta tills etanolen har avdunstat. Detta tar bara några minuter.
3. Placera en fluga i en i förväg kyld flaska (genom att hålla den i is) och kyl under en kort tid (under 1 minut) på is. Placera den kalla bedövade fluga på en kylplatta under dissektion stereomikroskop.
4. Centrera farten och hålla den på plats så att den inte kan tryckas undan lätt när de petade med en minutien stift.
5. Använd två tänger, en för att hålla minutien stift, den andra en att hålla farten nere.
6. Använd grova pincett för att hålla en insekt minutien stift och repa del av Dil från täckremsan så att det finns en Dil kristall på spetsen av minutien pinnen (medSamma täckglas och mycket samma plats på den täckglas varje gång hjälper till att få mer färg på tappen varje gång proceduren görs). Stiftet bör inte alltför spetsig, kan det böjas lättare och är sedan svår att använda.
7. Sedan punktera ett hål i mitten av flugans rygg bröstkorg med minutien tappen med Dil på spetsen. De två dorsalmost muskelfibrer av dorsolongitudinal flygningen muskeln (DLM, muskelfibrer 5 och 6 på varje sida) är innerveras av MN5. Därför placerar dye kristaller rätt i mitten av bröstkorgen försäkrar att både MN5 kommer att märkas eftersom båda muskelfibrer 6 av DLM kommer bli sårad och få lite färg.
8. Färgen ska placeras direkt under nagelbanden. Om färgämnet sätts in för djupt, kan flugan vara knivhögg eller andra neuroner (t.ex. MN1-4) kunde märkas också.
9. Detta upprepas tills tillräckligt färgämne (detta är en fråga om metoder och erfarenheter) införes i bröstkorgen
10. Dil är inte vatten soluble, därför kommer det inte att lösas upp i cytosolen av muskler och måste "fyllda" under nagelbanden.
11. Sedan en annan minutien stift doppas i en droppe av UV-härdande lim (vi sätta en droppe av lim i en vägning båt).
12. Limmet som nu är på spetsen av minutien pin används för att tillsluta såret där färgämnet kristallerna infördes.
13. Efter applicering av vissa lim (endast lite att stänga såret, inte hela bröstkorgen) en UV-pistol används för att härda limmet. Vi använder två 10 s intervaller med UV-ljusexponering.
14. De behandlade flugorna sätts på färsk mat i en fluga flaska. Se till att limmet plats på flugorna "bröstkorgen inte fastnar på väggarna i flaskan som fångar flugan.
15. Färgen behöver ett par timmar för att nå målet neuron. Den färdas längs membranet, inte i cytosolen, eftersom det är lipidlöslig. Vi behandlar djuren på eftermiddagen och lämna dem över natten.
16. Patch clamp experiment utförs följande dag. De neuroner kommer att vara mindre synlig i jämförelse med användningen av genetiskt uttryckte GFP.

4. Beredning av Enzyme Pipettera som används för rengöring

Det är viktigt att säkerställa ett jämnt flöde av saltlösning genom inspelningen kammaren. Med ökningen badvolym och fall måste undvikas eftersom det orsakar vibrationer och offset eventuella förändringar under experimenten. Perfusion och sug måste fastställas. Detta gör lösning utbyte mycket lättare, vilket i sin tur är viktig för snabb tvätta ur proteas före experimentet och snabbt utbyte av farmakologiska medel under experimentet.

1. Försäkra perfusion av inspelningen kammaren (flödeshastighet vid ca 2 ml per minut). Flödeshastighet kan regleras antingen genom att använda en kran eller med hjälp av specifika diameter slangar (ju större diametern, desto högre flödeshastighet). Har volymen av kammaren så liten som möjligt för att garantera snabbt utbyte av lösningen i the kammare. Detta säkerställer snabb borttagning av proteas och blockerare från inspelningen kammaren.
2. Volymen av kammaren beror på hur saltlösning-ut (figur 1) i perfusionssystemet införes i inspelningen kammaren (när vattennedsänkning målet sänks ned i badet).
3. Kontrollera att saltlösning ut är placerad på ett sådant sätt att den titern av inspelningen kammaren inte stiger och faller konstant (sug, stiga, sugning, upphov) men förblir konstant (konstant sugning). Vi bestämmer stadig och stabil perfusion med konstanten, aldrig avbruten gurglande ljud som produceras genom att ständigt suga saltlösning ur badet.
4. Som saltlösning-och ut vi använder injektionssprutor som är böjda och bifogas smala slangar och placeras nära inspelningen kammare med modellera (figur 1F).
5. Dra en patch pipett och bryta spetsen lite under visuell kontroll. Använda fina rena pincett. När visualisera pipetten under 40x vattennedsänkning lins pipettspetsen diameter bör vara ungefär mellan 40 och 70% av cellens soma diameter. Mycket stora tips (ungefär celldiameter eller större) även kan användas, emellertid, ökar sannolikheten för rippning av cellkroppen på grund av de kapillärkrafter av pipetten. Är pipetten mycket liten (mindre än 10% av soma diametern), täpper lätt, vilket resulterar i att behöva använda en eller flera färska pipett (er) under rengöringsproceduren.
6. Fylla pipetten med 2% proteas i PBS-buffert eller saltlösning utan igensättning den.
7. Sätt enzymet pipetten i elektrodhållaren. För att säkerställa en effektiv kontroll av det applicerade trycket måste innehavaren att tätt tillsluten.
8. Fäst en slang till den lilla uttaget på pipetten hållaren och säkra den på ett sätt som rycker i den fria änden av slangen inte påverkar pipetten som infördes i pipetten hållaren. Kontrollera för rörelse under mikroskop.
9. Sätt in en plast p ipette spets (den typ som används med en automatisk pipett, använder vi de blå 1000 il sådana, men det är en fråga om preferens. Andra storlekar kan användas likaväl) eller en spruta med en kran till den fria änden av röret att kunna tillämpa positivt och negativt tryck till enzymet / patch-pipetten. Positivt tryck appliceras genom antingen blåsa in i pipettspetsen (använder den som ett munstycke) eller genom att trycka ner sprutan. Negativt tryck appliceras genom sugning (med munnen med munstycket) eller genom att dra ut sprutan.
10. Syftet med de positiva och negativa tryck applikationer är att lossa och avlägsna celler och skräp som omger cellerna under utredning. Positivt tryck matas ut enzym från rengöring pipetten och blåsa skräp från ytan av CNS. Undertryck används för att suga skräp utanför VNC (som en dammsugare).

5. Rengöring av GFP-märkt MN5 (Figur 3 och Video)

innehåll "> Not till läsaren: Bilder av MN5 före och efter rengöring är svåra att skilja i figur 3 Detta är vad du får i verkligheten Det kommer att ta lite träning för att lära sig att skilja de subtila skillnaderna mellan rengjorda och ej rengöras.. nervceller. Observera att dessa subtila skillnader kan ses bättre i rörliga bilder. Därför ger filmen ett bättre intryck än statiska bilder (Figur 3).

1. Visualisera enzymet fyllda pipetten under 40x vattnet doppa objektiv med starkt ljus (Figur 3B, vit pil).
2. Fokus på pipettspetsen. Om det är igensatt, försöka få smuts genom att positivt eller negativt tryck. Om smutsen inte kommer ut, förbereda en ny enzym fylld pipett.
3. Växla till fluorescerande ljus (Figur 3A).
4. Sänk enzymet pipetten försiktigt och fokusera tills cellkroppen kan ses.
5. När enzymet pipetten är näracellkroppen, stänga av perfusionen av.
6. Applicera positivt tryck i korta skurar mot cellkroppen, så att allt som hämmar tillträde till cellen kommer att lossas. Detta måste göras tills vävnaden som omger cellkroppen lossnar.
7. Också flytta enzymet pipetten dorsalt för att fånga löst skräp som kan vara en vänster-over från ganglionisk skidan som omger VNC. Den kan ha tagits bort redan genom dissektion före montering förberedelserna på mikroskop (detta är inte alltid fallet).
8. Med omväxlande applicering av positivt och negativt tryck, använd enzymet pipetten som en dammsugare och vakuum runt cellkroppen. Det är inte nödvändigt att lossa hela cellkroppen helt. Rengöring av främre delen av somat kommer att göra (eller den bakre eller laterala del beroende på från vilken sida pipetten närmar somat).
9. Denna rengöringsprocedur sker tills membranet ser fri från skräp.
10. Den Membrane är rent när det inte finns någon "skugga" eller diffus kontrasten mellan cell och omgivande vävnad när de betraktas med fluorescerande ljus enbart. Detta kan ses bäst med hög intensitet blått ljus. Därför ökar ljusintensiteten för ett ögonblick (vi tar bort de neutrala täthetsfilter att uppnå detta). Observera att omfattande blått ljus exponering från en vanlig HBO 100 kvicksilver lampa kan orsaka foto skada i ungefär en minut. Detta kommer att resultera i GFP-signalen att blekna när cellerna dör.
11. Byt till ljus och ta bort celler och skräp som inte kunde ses med fluorescerande ljus. Observera att visualisering av luftstrupe och rengöring status kan dra nytta av att växla mellan starkt ljus och fluorescerande ljus.
12. När rengöringsproceduren är klar och cellkroppen verkar ren, växla perfusion systemet igen (göra det också om rengöringsproceduren tar längre tid än 3 till 5 minuter och fortsätt rengöring med stadig perfusion) och lampan.
13. Skölj cellen for ~ 15 till 20 min med saltlösning eller den lösning som kommer att användas för följande applikation. Inte mindre än 40 ml skall gå igenom inspelningen kammaren för att vara säker på att proteaset tvättas ut. Protease rester på cellytan kommer att orsaka plötslig celldöd under annars stabila inspelningar patch clamp.

6. Elektrofysiologi

1. Konventionell in situ helcell patch clamp i spänning klämma och strömtång läge utförs med en Axopatch 200B förstärkare (Molecular Devices, USA), signaler digitaliseras med hjälp av en Digidata 1320 (Molecular Devices, USA) och analyserades med pClamp 10,2 mjukvara.
2. Patch pipetter dras från borosilikatglas kapillärer med en vertikal pipett avdragare (Narishige, PC-10).
3. Pipettspets motstånd är mellan 5,8 och 6,2 Mohm (strömtång och kalium nuvarande inspelningar) och mellan 2,8 och 3,5 Mohm (för kalcium nuvarande inspelningar) respektive. Tip motståndet beror påintra-och extracellulära lösningar som används (för detaljer se ^{13, 14).}

7. Representativa resultat

Efter rengöring både MN5 är redo för in situ helcells patch clamp (Figur 3). Följande avsnitt visar representativa spänning klämma och nuvarande spår klämma som spelats in från MN5 soma efter att ha använt beskrivna rengöringsproceduren. MN5 uttrycker en mängd spänningsstyrda jonkanaler (se även ^13,14). Vi visar ett exempel på spänningsstyrda kalcium strömmar (Figur 4), spänningsstyrda kalium strömmar (Figur 5) och åtgärder potentiella spår (Figur 6). Spänningsstyrda kalcium och strömmar kalium framkallade av liknande spänning protokoll, men de lösningar som har använts skiljer sig så att endast de jonkanaler undersökta passera ström (för detaljer se ^13,14). Alla andra stora spänningsstyrda jon channels har blockerats (spänningsstyrda natriumkanaler med 100 nM tetrototoxin - pipetteras direkt i badet, perfusionen stoppades under två minuter - kalcium kanaler med 500 M cadmiumchloride, kalium kanaler med 2 mM 4-aminopyridin (4-AP) och 30 mM tetraethylammoniumchloride extracellulärt och 0,5 mM 4-AP, 20 mM tetraethylammoniumbromide och 144 mM cesiumchloride intracellulärt via intracellulära lapp lösning i plåstret pipetten (för detaljer se ^13,14). aktionspotential spår har framkallat genom nuvarande injektion i MN5 soma (Figur 6) utan användning av några jonkanal-blockerare ^12.

Figur 1. Rengöring inställning. Flugan är fäst i en Sylgard belagd lock av en 35 mm petriskål som vi limmade en plastring (innerdiameter 9 mm, 1,3 mm tjock) wte vaselin (A, B). Efter nedsänkning av flugan i saltlösning (C) den öppnas längs ryggens mittlinje. Tarm och matstrupen tas bort för att exponera den ventrala nerv sladd (D). För bättre tillgänglighet bröst neuromere huvudet avlägsnas (E). Efter montering av beredningen på en upprättstående epifluorescensmikroskop är perfusionssystemet (F, G, saltlösning-i, saltlösning out, vita pilar till vänster) liksom jordledningen bringas i läge (F, G, vita pilen på höger). Enzymet fylld rengöring pipett bringas i position efter nedsänkning i vatten mål (40x, NA 0,8) har sänkts i badet (H). För tydlighetens skull visar vi det redan innan målet har sänkts (F, G, vita pilen till höger). Den vinkel som enzymet pipett som innehas av en 1-HL-U elektrodhållaren (J) in i inspelningen kammaren är viktigt eftersom pipetten får inte röra både mål och plastringen. Denna vinkel varierar från installation till installation. Här är det ungefär 30 ° (se ritning i J, pil i K). Arrangemanget av pipetten i dess hållare, som är fäst vid en huvudsteg visas i (L). Den huvudsteg är ansluten till en motordriven mikromanipulator. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. MN5 i ventrala nerv sladd. MN5 kan lätt identifieras genom sin plats i Drosophila ventrala nerv sladd (VNC) när GFP är genetiskt uttryck genom användning av motoneuron specifika GAL4 drivrutiner (A). Den streckade rektangeln visar bröstkorg neuromere. För att få en uppfattning om hur storlekarna förhåller sig till varandra, visar vi en pipett rengöring lapp närmar vänster MN5 från den vänstra sidan av den dorsolongitudinal flygningen muskler. För bättre visualisering, var fläckpipetten fylld med ett rött färgämne (dextran-tetrametylrodamin, A). Den contralatmänhet utskjutande MN5 är placerade på den dorsala ytan av den mesothoracic neuromere av VNC på vardera sidan om mittlinjen (projektion vy av ett konfokalt bildstapel i B). Den ipsilaterally utskjutande MN1-4 ligger mer lateralt och anteriort relaterade till MN5 (pilar i B). Den streckade cirkeln mellan båda MN5 avbildar dendriter flygrepresentanterna motoneuroner i neuropil innefattande MN5 (B). GFP etikett i (B) förstärktes genom immunohistokemisk färgning med en antikropp mot GFP. Information om MN5 morfologi synliggörs genom att fylla neuron intracellulärt (jontoforetiskt) med osynliga spårämnet neurobiotin och efterföljande konfokal bildtagning (C). Färgning gjordes synligt med streptavidin kopplad till en fluorofor. Skala bar är 30 nm.

Figur 3. MN5 före och efter rengöring. Visualisering av MN5 uppnås genom uttryck av GFP med UAS/GAL4systemet (A, C, se etikett). MN5 före (A, B) och efter (C, D) rengöringsproceduren. Vänstra sidan av varje bild representerar främre representerar höger bakre. Nervceller att spela in från rengörs med en fylld proteas patch pipett med en bruten spets. Enzymet pipett är endast svagt synligt (A, B, se etikett). Infälld i A visar en förstoring av botten MN5 med enzymet pipetten närmar cellen. MN5 kan inte ses i starkt ljus innan rengöring förfarande (B). Luftstrupen måste tas bort om de täcker cellerna undersökta. Efter rengöringen, är kontrasten mellan cellen och omgivande vävnad mer skarpa (C, botten MN5) och cellen kan nu ses i starkt ljus (D). Pipettspetsen kan ses mer tydligt när starkt ljus används. Utvidgningen visar området i den streckade torget med MN5 cellkropp gränser omgiven med en prickad linje för bättre identifiering. Visualisering i starkt ljus hjälper ofta dom renlighet.

<p class = "jove_content">
Figur 4. Kalcium ström i MN5. Exempel inspelning av hela strömmar cell kalcium som spelats in från MN5. Minst två olika kalciumströmmar visas, en låg spänning aktiverad övergående kalcium och en fortsatt hög spänning kalcium ström. Strömmarna framkallade från en anläggning potential -90 mV. Spänningssteg från -90 mV till 20 mV tillämpades. Blockerare användes för att blockera de flesta andra jonkanaler. Artefakter utelämnades för tydlighetens skull (för karakterisering av MN5 kalcium strömmar ser Ryglewski et al., 2012).

Figur 5. Kalium strömmar i MN5. Exempel inspelning av hela strömmar cell kalium som spelats in från MN5. Visas Strömmar inkluderar kalcium aktiverade kalium strömmar som ingen kalciumkanalblockerare tillämpades. Strömmarna framkallade från en anläggningpotential -90 mV för den totala kalium ström (A) eller från en anläggning potential -20 mV för att inaktivera transienta kalium strömmar och visar bara den ihållande kalium ström (B). Spänningssteg från -90 mV till 20 mV applicerades i 10 mV steg. Offline subtraktion av kalium strömmar som framkallat från en anläggning potential -90 mV (A) och -20 mV (B) visar rent övergående kalium strömmar (C). Spänningsstyrda natriumkanaler blockerades. Artefakter utelämnades för tydlighetens skull (för karakterisering av MN5 spänning och kalcium strömmar kalium se Ryglewski och Duch, 2009).

Figur 6. Firing mönster som uppvisas av MN5. Exempel inspelning av bränning mönster som framkallas i MN5 av somatiska nuvarande injektioner (0,4 nA, svart, 0,5 nA, grå) på 200 ms varaktighet. Vilomembranpotentialen var -59 mV. Inga jonkanal-blockerare har använts. (För strömtång analys av MN5 bränningmönster ser Duch et al., 2008).

Discussion

När visualisera celler med fluorescerande proteiner som GFP, är det viktigt att inte över-exponera beredningen för mycket ljus. Detta kan resultera i foto skador. Vi använder 100W HBO korta glödlampor båge kvicksilver för belysning, och vi också använda neutral densitet (ND) i 0,8 (Chroma ND filter 0,3 och 0,5). För att kunna bedöma kvaliteten på rengöring god sikt är avgörande. Därför kan ND filter tas bort under kortare perioder på ca 20 s för flera gånger.

Vid tillämpning av vissa positivt tryck, cellkroppen "flikar" lite. Detta hjälper att bedöma kvaliteten på renlighet. I den ventrala nerv sladd kontrast är mycket låg, och rörelse kan vara till stor hjälp för att visualisera celler. Elektrodhållaren som används för rengöring förfarande (och även för patch uppspänning) måste tättslutande, annars tryckstyrda ansökan kommer inte att vara möjligt. Förlora trycket kommer att störa lyckad borttagning av vävnad och debRIS och kommer att förhindra giga-tätning bildning

I fall in situ inspelningar patch clamp skall ske efter rengöring av cellen, vara medveten om att det inte bara en mantel som omger den ventrala nerv sladd som helhet (som måste tas bort för varje patch clamp inspelning av någon central neuron av vuxna flugor ), men cellerna själva kan vara omgiven av en mantel samt. MN5, exempelvis, är omgiven av en icke-cellulär mantel som kan ses endast med kort hög intensitet belysning. Dessutom kan celler vara belägen under luftstrupen. I fall cellen inte kan nås, luftstrupen måste dras åt sidan om det inte rippat med pipetten under rengöringsproceduren (efter att ha dragits undan). Hela rengöringsprocedur behöver göras utan att dra vävnaden för mycket. Detta förfarande kräver träning. Ju bättre rengöring, desto högre kommer frekvensen av omedelbara giga-tätningar (inom 1 s efter att röra cellen och rellätta övertryck).

Beroende på rengöring protokollet och inbrott i följande scenarier är möjliga: det första, om cellerna inte städades tillräckligt bra, är en giga-tätning inte möjlig och experimentet måste avslutas. Andra, i vissa fall städning är bra nog för giga-tätning bildas utan en tunn, knappt synlig rest av höljet förblir runt soma. Detta kommer att bringa membranet att brista och orsaka läckage strömmar av olika amplituder. En mindre allvarlig konsekvens av otillräcklig cell städning är att vissa rester av manteln orsaken ökar i tillgång motstånd. Beroende på de experimentella designen olika kvalitetskriterier för plåstret kan tillämpas. För uppföljningen potentiella mönster i strömtång membranpotentialen i cellen måste vara frisk (-55 mV eller mer hyperpolariserade vid MN5), men tillgången motstånd är inte så viktig fråga. Men när frammana aktionspotentialer av nuvarande injektion tillgång resistance blir ett problem. För frammana stora strömmar amplitud kalium som har sitt ursprung nära inspelningsplatsen läckan ska vara liten (i fallet med MN5 ingångsresistans måste med högre än 80 Mohm) och tillgång motstånd bör inte vara större än 15 Mohm. För det utrymme klämman som behövs i spänningsklämma inspelningar av små kalcium amplitud dendritiska strömmar som härstammar på ganska avstånd från somat inget läckage kan införas (för MN5 ingångsresistans måste vara över 120 Mohm) och tillgång motstånd kan inte vara högre än 12 MQ. I de flesta inspelningar vi mäter kalcium strömmar med tillgång motstånd mellan 8 och 10 Mohm (som läses från ratten på Axopatch 200B förstärkare efter serieresistans och helcells kapacitans ersättning). För varje celltyp som skall spelas in, måste sådana kvalitetskriterier bestämmas individuellt.

Användning rengöring som beskrivs här, kan vi hålla inspelningarna stabil för tillnärmningbart 90 minuter. Vi följer inte stor nedgångna (speciellt med avseende på CAV2 och Cav3 kalcium strömmar och Shaker, shal och fördröjda likriktare strömmar kalium). Vi har dock försökt att inte hålla plåstret längre och kan därför inte ange om längre inspelningar skulle vara möjligt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease type XIV	Sigma Aldrich USA	P5147
Microfil flexible injection needle	World Precision Instruments USA	MF28G-5
Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament	World Precision Instruments USA	PG52151-4
DiI	Invitrogen USA	D3899
Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT
ND filter set (unmounted)	Chroma Technology Corp.	22000b series
Electrode holder 1-HL-U	Molecular Devices	1-HL-U