إعداد Published: October 15, 2012 doi: 10.3791/4264

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stefanie Ryglewski¹, Carsten Duch¹

¹School of Life Sciences, Arizona State University

Summary

في التصحيح الموقع وتستخدم لتوصيف المشبك التسجيلات الكهربية للخلايا العصبية في الدوائر سليمة. في ذبابة الفاكهة الوراثية نموذج التصحيح تحامل صعب لأن CNS صغيرة ومحاطة غمد قوية. توضح هذه المقالة الإجراء لإزالة الخلايا العصبية وغمد نظيفة لاحقة التسجيلات المشبك التصحيح.

Abstract

أوقات قصيرة الجيل والتقنيات الوراثية السهل جعل ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا نموذجا ممتازا في مجال البحوث الجينية علم الأعصاب الأساسية. القنوات الأيونية هي أساس كل سلوك لأنها توسط استثارة الخلايا العصبية. كان أول قناة أيون الجهد بوابات المستنسخة الجهد ذبابة الفاكهة قناة البوتاسيوم بوابات شاكر ^1،2. نحو فهم دور القنوات الأيونية واستثارة الغشاء وظيفة الجهاز العصبي من المفيد الجمع بين أدوات الجينية القوية المتاحة في ذبابة الفاكهة في الموقع مع التسجيلات المشبك التصحيح. لسنوات عديدة وتعطلت هذه التسجيلات من صغر حجم الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة. وعلاوة على ذلك، يشكل غمد قوية مصنوعة من الكولاجين والخلايا الدبقية العقبات للوصول إلى الخلايا العصبية ماصة التصحيح المركزية. إزالة هذا الغلاف هو شرط مسبق ضروري للتسجيلات المشبك التصحيح من أي الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة الكبار. في السنوات الأخيرةكان العلماء قادرين على إجراء التسجيلات في الموقع المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الدماغ البالغ ^3،4 بطني والحبل العصبي الجنيني ^{5،6، 7،8،9،10} اليرقات، وذبابة الفاكهة الكبار ^{11،12،13،14.} A مستقر جيجا ختم هو الشرط المسبق الأساسي لتصحيح جيد ويعتمد على الاتصال نظيفة للماصة التصحيح مع غشاء الخلية لتجنب تسرب التيارات. لذلك، يجب أن لخلية كاملة في الموقع التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة الكبار تنظيفها جيدا. في الخطوة الأولى، وغمد العقدية لابد من معالجة إنزيمي وإزالة ميكانيكيا لجعل الخلايا المستهدفة للوصول. في الخطوة الثانية، غشاء الخلية لابد من مصقول بحيث لا طبقة من المواد الدبقية، والكولاجين أو غيرها قد تخل جيجا ختم التشكيل. توضح هذه المقالة كيفية إعداد الخلايا العصبية التي تم تحديدها في العصب المركزي ذبابة الفاكهة الحبل البطني، والعصبون الحركي رحلة 5 (MN5 ^15)، لج جسدية كاملةتسجيلات الذراع التصحيح المشبك. ويتحقق تحديد وتسليط الضوء على الخلايا العصبية المستهدفة من التعبير GFP في MN5 من. نحن لا نهدف إلى شرح تقنية المشبك التصحيح نفسه.

Protocol

الوصف التالي ليست خاصة لأحد العصبون الحركي. ويمكن استخدامه مع أي الخلايا العصبية. في هذا المثال، فإننا نستخدم الطيران العصبون الحركي 5 (MN5) أن يعصب الألياف 2 dorsalmost من عضلة خافضة الجناح dorsolongitudinal (DLM). لتحديد وتصور MN5 نستخدم نظام UAS/GAL4 للتعبير عن GFP في رحلة العصبونات الحركية (الخلايا العصبية وأخرى قليلة).

1. تشريح ذبابة الفاكهة الكبار للوصول إلى الجزء الظهري للحبل الاعصاب الاماميه (VNC)

1. تشريح لذبابة الفاكهة الكبار الجانب الظهري على طول خط الوسط الظهرية في طبق بتري المغلفة sylgard (35 مم) كما هو موضح في Ryglewski ودوتش (2009 ^13). فيلم تشريح هذا متاح عبر الإنترنت من خلال إن الرب (Boerner وGodenschwege ^16. وفيما يلي وصفا موجزا للتشريح.
2. الذباب الكبار هي تخدير عن طريق التبريد على الجليد لمدة 1 دقيقة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ما قبل التبريد قارورة فارغة ذبابة (بدون طعام)على الجليد ووضع ذبابة في قارورة البارد بالفعل. تتم إزالة الأجنحة والأرجل مع زوج من مقص.
3. ويعلق ثم يطير الجانب الظهري حتى في طبق بتري sylgard المغلفة (نستخدم غطاء طبق بتري 35 مم ملء إلى حافة مع sylgard وفاعليات 1A، B) مع عصابة من البلاستيك (قطر داخلى 9 مم، 1.3 مم ) لصقها على sylgard مع الفازلين.
4. استخدام غطاء طبق بتري 35 مم يسهل الوصول إلى VNC مع ماصة التصحيح بموجب التصور مع عدسة المياه غمس. وهذا يساعد على إدخال ماصة بسطحية دون لمس جدار الطبق.
5. ويمكن إجراء حلقة بلاستيكية بواسطة حفر حفرة في ورقة رقيقة من البلاستيك (سمك نستخدم 1،3 مم). نستخدم قطع الأسلاك لتحديد المحيط الخارجي من الحلبة بحيث يناسب الطبق.
6. يغرق في المياه المالحة الطاير العادي (الشكل 1C، تكوين المالحة في MM: كلوريد الصوديوم 128، بوكل 2، CaCl ₂ 1.8، MgCl ₂ 4، HEPES 5، السكروز ~ 35 محة عناnding على الأسمولية من الحل؛ يتم ضبط درجة الحموضة إلى 7.25 مع هيدروكسيد الصوديوم M 1، يتم ضبط الأسمولية إلى 290 الميلي أسمول مع السكروز).
7. يتم تشريح الحيوان على طول خط الوسط الظهرية، وامتدت كبيرة الظهرية العضلات الطولية الطيران أفقيا وشبك لفضح القناة الهضمية وسرطان المريء، وتحت VNC. بعد إزالة الأمعاء والمريء، ما يتعرض له VNC (1D الشكل).
8. اختياريا، يمكن قطع رأس ذبابة في هذه الخطوة (الشكل 1E). إزالة الرأس يجعل الوصول مع الانزيم وماصات التصحيح أكثر ملاءمة، وغير منزعجة MN5 التشعبات عند تنظيف سوما (التشعبات هي الخلفية إلى سوما، أرقام 2B، C). ومع ذلك، يمكن أيضا أن يترك الرأس سليمة إذا لزم الأمر من خلال تصميم التجريبية (دراسة مثلا تنازلي مساهمة في العصبونات الحركية الصدري). يمكن في هذه الحالة يتم إدخال ماصة أو الجانبي الخلفي من (الشكل، الوحشي 2A).
9. لالسريعتبادل التجارب المالحة خلال تصغير حجم الدائرة تسجيل عن طريق وضع حلقة بلاستيكية (الداخلية بقطر 9 ملم) حول تشريح الحيوان ولصق إلى الطبق مع الفازلين (أرقام 1A، B؛ حجم غرفة التسجيل هو ~ 200 ميكرولتر) .
10. هي التي شنت على إعداد ثم تستقيم الثابتة المرحلة المجهر مضان (نستخدم زايس Axioskop 2 خ م بالاضافة الى ذلك، زايس، ألمانيا) وشاهدوا مع NA عالية (> 0.75)، العمل الطويلة المسافة (> 2 مم)، 40X الهدف المياه غمس. نظام نضح (المالحة في، المالحة المغادرة)، يتم إدراج سلك أرضي وماصة الانزيم في غرفة التسجيل (أرقام 1F - J، L).

2. تصور MN5 (انظر الشكلين 2 و 3)، تجنب

1. تحميل طبق بتري على مجهر مرحلة ثابتة تستقيم epifluorescent.
2. وضع الطبق مع الطيران في بحيث يواجه الجزء الأمامي الجانب حيث صاحب القطب هومحمولة على (الشكل 1).
3. استخدام تضخم عالية (40X أو أعلى)، وارتفاع المياه NA غمس عدسة (NA 0.75 أو أعلى) ومرشح GFP لإلقاء الضوء على VNC. لرؤية جيدة للخلية أثناء التنظيف نستخدم المياه غمس عدسات 40X مع NA إما 0.8 (أوليمبوس LUMPlanFl 40xW)، أو من NA 0.75 (زايس W N-M27 Achroplan 40x/0.8). للوصول جيدة مع ماصة التصحيح يجب أن تكون المسافة العمل 2 مم أو أكبر.
4. وتقع كل من MN5 في قسيم عصبي mesothoracic على السطح الظهري للالعقدة بالقرب من خط الوسط بين - وربما غطت جزئيا - القصبة الهوائية بارزة (أرقام 2 و 3). MN5 مع التشعبات التي تظهر منطقة خضراء منتشر. وsomata تصبح أكثر وضوحا بعد التنظيف. ومع ذلك، لا تظهر على التشعبات حادة ولكن لا تزال ضبابية بسبب منهم لا يزال يجري تغطيها الأنسجة (أرقام 2A، B).
5. في الإعداد لدينا ونحن نستخدم من 100 HBO مصدر الضوء في مضان التي لا نستطيع أن وزارة الدفاعify شدة الضوء الناتج. نستخدم مرشحات الكثافة محايدة لتجنب الإفراط في التعرض لضوء الفلورسنت الأنسجة لأكثر من اللازم، الضوء الأزرق بشكل خاص. وهذا قد يسبب تلف للصور وسوف تقتل في النهاية الخلايا. نستخدم الكثافة محايدة من 0.8. لا ينبغي لتبيض تحدث أثناء إجراء التنظيف. إذا تبيض يحدث، على الأرجح ناتج الضوء قوية جدا. الخلية هي الصورة معطوب.
6. إذا تم استخدام الإضاءة LED وضبط كثافة يجب أن يحدده المجرب. تبيض هو علامة على photodamage ويجب تجنبها.

3. طريقة بديلة لرؤية MN5

لذلك طلبنا من المهم أن يكون الخلية المسمى، على سبيل المثال مع التعبير GFP استهدفت. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام مبادرة ديزرتك الصناعية، صبغة محبة للدهون، لتسمية هذا retrogradely الخلايا العصبية. في هذه الحالة يتم إدراج بلورات الصبغة في عضلات الطيران باستخدام دبوس minutien الحشرات، ويتم إغلاق الجرح باستخدام UV علاج الغراء.

1. جعل محلول المخزون مبادرة ديزرتك الصناعية عن طريق إذابة البلورات لمبادرة ديزرتك الصناعية قليلة (أي مبلغ محدد) في الإيثانول ميكرولتر 100 70٪. يمكن أن تظل هذا الحل في -20 درجة مئوية حتى استخدام ما يصل. تجميد والذوبان المتكرر ليست مشكلة.
2. وpipetted ثم 5 ميكرولتر من محلول على أحد زلة غطاء غير المعالجة. انتظر حتى الإيثانول قد تبخرت. هذا يستغرق سوى دقيقة قليلة.
3. وضع ذبابة في قارورة ما قبل المبردة (عن طريق الالتزام إلى شكل ثلج) وباردة لفترة قصيرة من الوقت (أقل من 1 دقيقة) على الجليد. وضع ذبابة تخدير الباردة على لوحة التبريد تحت stereomicroscope تشريح.
4. مركز الطاير والاحتفاظ بها في مكان بحيث لا يمكن دفع جانبا بسهولة عندما يجري مطعون مع دبوس minutien.
5. استخدام اثنين من ملقط، واحد لعقد دبوس minutien، والآخر لعقد ذبابة أسفل.
6. استخدام ملقط الخشنة لعقد دبوس minutien الحشرات وبعض من الصفر مبادرة ديزرتك الصناعية من الانزلاق الغطاء حتى لا يكون هناك بلورة مبادرة ديزرتك الصناعية على طرف دبوس minutien (باستخدامنفس زلة غطاء ونفس المكان جدا على أن غطاء ينزلق في كل مرة يساعد على الحصول على المزيد من الصبغة على دبوس في كل مرة يتم إجراء). لا ينبغي دبوس الإشارة أيضا، أنه قد ينحني بسهولة أكبر وبعد ذلك من الصعب استخدام.
7. ثم ثقب حفرة في وسط الصدر الذبابة الظهرية مع دبوس minutien مع صلاح الغيدان على الطرف. ومعصب وهما ألياف العضلات dorsalmost من عضلات الطيران dorsolongitudinal (DLM، الألياف العضلية 5 و 6 على كل جانب) من MN5. لذلك، وضع بلورات صبغة الحق في منتصف القفص الصدري يؤكد أن كل من سوف يكون المسمى MN5 لأنه سيتم يصب كل ألياف العضلات 6 من DLM والحصول على بعض الصبغة.
8. يجب وضع الصبغة مباشرة تحت بشرة. إذا تم إدراج الصبغة عميقة جدا، قد يكون طعن الطاير أو يمكن تمييز الخلايا العصبية الأخرى (مثل MN1-4) أيضا.
9. ويتكرر هذا حتى يتم إدراج صبغة يكفي (هذه المسألة من الممارسة والخبرة) في الصدر
10. مبادرة ديزرتك الصناعية ليست ذوبان المياهجنيه، وبالتالي فإنه لن تذوب في العصارة الخلوية من العضلات وسيتعين "محشوة" تحت بشرة.
11. ثم انخفضت إلى آخر دبوس minutien قطرات من الصمغ علاج الأشعة فوق البنفسجية (وضعنا قطرات من الصمغ في قارب وزنها).
12. يتم استخدام الغراء التي هي الآن على طرف دبوس minutien لإغلاق الجرح حيث تم إدراج بلورات صباغة.
13. بعد تطبيق بعض الغراء (فقط قليلا لإغلاق الجرح، وليس الصدر كامل) يستخدم بندقية UV لعلاج الغراء. نحن نستخدم كل منهما 10 ثانية من فترات التعرض للضوء فوق البنفسجي.
14. يتم وضع الذباب تعامل على المواد الغذائية الطازجة في قارورة الطاير. تأكد من أن بقعة الغراء على الصدر الذباب 'لا التمسك جدران القارورة التي الفخاخ الطاير.
15. الصبغة يحتاج إلى بضع ساعات للوصول إلى الخلايا العصبية المستهدفة. فإنه يسافر على طول الغشاء، وليس في العصارة الخلوية لأنها قابلة للذوبان الدهون. تعاملنا مع الحيوانات في فترة ما بعد الظهر وتركهم أكثر من ليلة.
16. وتجرى التجارب المشبك التصحيح في اليوم التالي. والخلايا العصبية تكون أقل وضوحا بالمقارنة مع استخدام GFP أعرب وراثيا.

4. إعداد ماصة الانزيم الذي يستخدم لتنظيف

من المهم لضمان تدفق مستمر من المياه المالحة من خلال غرفة التسجيل. وجود ارتفاع حجم الحمام وسقوط لابد من تجنبها لأنه يسبب الاهتزاز وتعويض التغييرات المحتملة خلال التجارب. ونضح شفط يجب أن يتم تعيين وفقا لذلك. وهذا يجعل الحل أسهل بكثير الصرف، والذي بدوره مهم لغسل السريع من قبل البروتيني التجربة والتبادل السريع للوكلاء الدوائية أثناء التجربة.

1. أؤكد للغرفة نضح تسجيل (معدل التدفق في حوالي 2 مل لكل دقيقة). يمكن تنظيم معدل التدفق إما باستخدام الديك أو باستخدام شبكة أنابيب قطرها محدد (الأكبر في قطر، وارتفاع في معدل التدفق). يكون حجم غرفة صغيرة بقدر الإمكان لضمان تبادل سريع من الحل في اله القاعة. هذا يؤكد إزالة سريعة للالبروتيني وحاصرات من غرفة تسجيل.
2. حجم الغرفة يعتمد على كيفية يتم إدراج المالحة المغادرة (الشكل 1) من نظام نضح في غرفة التسجيل (عندما يخفض الهدف غمر الماء في الحمام).
3. تأكد من أن يتم وضع خارج المالحة في الطريقة التي عيار وللغرفة تسجيل لا صعود وهبوط مستمر (الشفط، وارتفاع، وشفط، وارتفاع) ولكن تبقى ثابتة (شفط ثابت). نحدد نضح ثابت ومستقر عن طريق الصوت ثابت لم تنقطع أبدا، الغرغرة التي تم إنتاجها بواسطة مص باستمرار المالحة من الحمام.
4. كما المالحة في وخارج نستخدم إبر الحقن التي تحني وتعلق على شبكة أنابيب ضيقة وضعت بالقرب من غرفة تسجيل باستخدام البلاستيسين (الشكل 1F).
5. سحب ماصة التصحيح وكسر غيض قليلا تحت المراقبة البصرية. استخدام ملقط غرامة نظيفة. عندما تصور unde ماصةص الغمر 40X عدسة المياه يجب أن يكون قطرها حوالي تلميح ماصة بين 40 و 70٪ من قطر سوما الخلية. ويمكن أيضا نصائح كبيرة جدا (حوالي خلية قطرها أو أكبر) يمكن أن تستخدم، ومع ذلك، فإن احتمال مما أسفر عن تمزيق جسم الخلية يزيد بسبب القوات الشعرية ماصة. وماصة صغيرة جدا (أقل من 10٪ من قطر سوما)، فإنه يسد بسهولة مما يؤدي إلى الحاجة إلى استخدام واحد أو أكثر ماصة الطازجة (ق) أثناء إجراء التنظيف.
6. ملء ماصة مع البروتيني 2٪ في المخزن المؤقت PBS أو المالحة دون انسداد ذلك.
7. إدراج ماصة الانزيم في حامل الالكترود. لضمان الرقابة السليمة من الضغوط التي مورست، صاحب يحتاج إلى أن تكون مختومة بإحكام.
8. إرفاق أنابيب إلى منفذ صغير على حامل ماصة وضمان الحصول عليها بطريقة الجر في نهاية خالية من أنابيب لا تؤثر على ماصة التي تم إدراجها في حامل ماصة. تحقق من وجود حركة تحت المجهر.
9. إدراج إما ع البلاستيك تلميح ipette (من النوع الذي يستخدم مع pipetter التلقائي، ونحن نستخدم تلك ميكرولتر الأزرق 1000، ولكن هذا هو مسألة تفضيل، ويمكن استخدام أحجام أخرى أيضا) أو حقنة مع الديك في نهاية خالية من أنابيب لتكون قادرة على ممارسة الضغط الإيجابية والسلبية لانزيم ماصة / التصحيح. يتم تطبيق الضغط الايجابي من قبل تهب إما في تلميح ماصة (استخدامه كقطعة الفم) أو عن طريق دفع الحقنة إلى أسفل. يتم تطبيق الضغط السلبي عن طريق الشفط (مع الفم باستخدام قطعة الفم) أو عن طريق سحب الحقنة.
10. الغرض من تطبيقات الضغط الإيجابية والسلبية هو لتخفيف وإزالة الخلايا والحطام المحيطة الخلايا قيد التحقيق. والضغط الإيجابي إخراج انزيم من ماصة التنظيف وتفجير الحطام قبالة سطح الجهاز العصبي المركزي. يتم استخدام الضغط السلبي لامتصاص الحطام قبالة VNC (مثل المكنسة الكهربائية).

5. تنظيف GFP الموسومة MN5 (الشكل 3 و فيديو)

المحتوى "> ملاحظة للقارئ: صور قبل وبعد MN5 التنظيف من الصعب تمييزها في الشكل 3 وهذا هو ما تحصل عليه في الحياة الحقيقية سيستغرق بعض التدريب لتعلم التمييز بين الفروق الدقيقة بين تنظيفها وتنظيف غير.. الخلايا العصبية. يرجى ملاحظة أنه يمكن رؤية هذه الفروق الدقيقة في أفضل الصور المتحركة، لذلك الفيلم يقدم أفضل انطباع من الصور الثابتة (الشكل 3).

1. تصور إنزيم ملء ماصة تحت عدسة 40X المياه غمس مع الضوء الساطع (الشكل 3B، بيضاء السهم).
2. التركيز على الطرف ماصة. إذا تم انسداد ذلك، في محاولة للحصول على الأوساخ من خلال تطبيق ضغط إيجابي أو سلبي. إذا لا يأتي من التراب، وإعداد انزيم جديدة مليئة ماصة.
3. التبديل إلى ضوء الفلورسنت (الشكل 3A).
4. خفض انزيم ماصة بعناية وإعادة التركيز حتى يمكن رؤية جسم الخلية.
5. عندما ماصة الانزيم على مقربة منجسم الخلية، تبديل نضح قبالة.
6. تطبيق الضغط الايجابي في رشقات نارية قصيرة نحو جسم الخلية لذلك سيتم خففت أن كل ما يعيق الوصول إلى الخلية. هذا الذي ينبغي القيام به حتى الأنسجة المحيطة جسم الخلية يأتي فضفاضة.
7. أيضا نقل ماصة للقبض على انزيم ظهريا الحطام فضفاضة قد يكون اليسار أكثر من غمد العقدية التي تحيط VNC. قد يكون تم بالفعل إزالته من قبل تشريح تركيب المجهر على إعداد (وهذا ليس هو الحال دائما).
8. بالتناوب مع تطبيق الضغط الايجابي والسلبي، استخدم ماصة انزيم مثل مكنسة كهربائية والفراغ في جميع أنحاء الجسم الخلية. فإنه ليس من الضروري لتخفيف الجسم خلية كاملة تماما. سوف تنظيف الجزء الأمامي من القيام سوما (أو الجزء الخلفي الجانبي أو اعتمادا على ما من الجانب ماصة تقترب من سوما).
9. ويتم هذا الإجراء حتى تنظيف الغشاء تبدو خالية من الحطام.
10. والاغشيهشمال شرق نظيفة عندما لا يكون هناك "الظل" أو العكس منتشر بين الخلايا والأنسجة المحيطة عند عرضها مع ضوء الفلورسنت فقط. ويمكن رؤية هذا أفضل مع ارتفاع كثافة الضوء الأزرق. ولذلك، وزيادة شدة الضوء للحظة (نحن حذف مرشح الكثافة محايدة لتحقيق ذلك). نلاحظ أن التعرض للضوء الأزرق واسعة على النحو المنصوص عليه لمبة العادية HBO الزئبق يمكن أن تسبب أضرارا 100 صورة داخل دقيقة تقريبا. وهذا سيؤدي في إشارة إلى GFP تتلاشى كما تموت الخلايا.
11. التبديل إلى الضوء الساطع وإزالة الخلايا والحطام الذي لا يمكن أن ينظر إليها مع ضوء الفلورسنت. نلاحظ أن التصور من القصبة الهوائية ووضع التنظيف يمكن أن تستفيد من التبديل بين الضوء الساطع وضوء الفلورسنت.
12. عندما يتم الانتهاء من إجراء تنظيف خلايا الجسم وتظهر نظيفة، تبديل نظام نضح مرة أخرى على (فعل ذلك أيضا إذا الإجراء التنظيف وقتا أطول من 3 إلى 5 دقائق وتستمر مع التنظيف المستمر نضح) وضوءا.
13. شطف الخلايا FOR ~ 15 حتي 20 دقيقة مع المالحة أو الحل الذي سيتم استخدامه لتطبيق التالية. يجب أن لا تقل عن 40 مل تذهب من خلال غرفة التسجيل للتأكد من أن يغتسل من الأنزيم البروتيني. سوف بقايا البروتيني على سطح الخلية يسبب موت الخلايا المفاجئ أثناء مستقرة خلاف ذلك التسجيلات المشبك التصحيح.

6. الكهربية

1. ويجري التقليدية في الموقع كله الخلية المشبك المشبك التصحيح في الجهد والتيار وضع المشبك باستخدام مكبر للصوت 200B Axopatch (الأجهزة الجزيئية، الولايات المتحدة الأمريكية)، ويتم ترقيم إشارات باستخدام Digidata 1320 (الأجهزة الجزيئية، الولايات المتحدة الأمريكية) وتحليلها مع برنامج 10،2 pClamp.
2. يتم سحبها ماصات التصحيح من البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية مع مجتذب ماصة العمودي (Narishige، PC-10).
3. تلميح ماصة المقاومة هي بين 5.8 و 6.2 MΩ (المشبك الحالية والتسجيلات الحالية البوتاسيوم) وبين 2.8 و 3.5 MΩ (للتسجيلات الكالسيوم الحالي) على التوالي. المقاومة تعتمد على تلميححلول داخل وخارج الخلية المستخدمة (لمزيد من التفاصيل انظر ^{13، 14).}

7. ممثل النتائج

بعد إجراء تنظيف كل MN5 مستعدون لفي الموقع كله الخلية المشبك التصحيح (الشكل 3). المقطع التالي يوضح ممثل الشبك الجهد وآثار المشبك الحالي كما هو مسجل من MN5 سوما بعد التنظيف باستخدام الإجراء وصفها. MN5 عن مجموعة متنوعة من القنوات الأيونية الجهد بوابات (انظر أيضا ^13،14). نعرض مثالا على الجهد التيارات الكالسيوم بوابات (الشكل 4)، والجهد التيارات البوتاسيوم بوابات (الشكل 5) وآثار العمل المحتملة (الشكل 6). وأثار الكالسيوم بوابات الجهد والتيارات البوتاسيوم عن طريق بروتوكولات الجهد مماثلة، ولكن الحلول التي تم استخدامها تختلف من أجل السماح فقط القنوات الأيونية قيد التحقيق لتمرير الحالية (لمزيد من التفاصيل انظر ^13،14). جميع الرئيسية الأخرى CH الجهد بوابات أيونوقد تم حظر annels (الجهد بوابات قنوات الصوديوم مع tetrototoxin نانومتر 100 - pipetted مباشرة في الاستحمام، أوقف نضح لمدة دقيقتين - قنوات الكالسيوم مع cadmiumchloride ميكرومتر 500، قنوات البوتاسيوم مع 2 مم 4-aminopyridin (4-AP) و 30 ملي ملي tetraethylammoniumchloride خارج الخلية و0.5 4-AP، 20 و 144 ملي tetraethylammoniumbromide cesiumchloride ملي داخل خلوي عن طريق حل التصحيح داخل الخلايا في ماصة التصحيح (لمزيد من التفاصيل انظر ^13،14) أثيرت. آثار المحتملة عن طريق الحقن العمل الحالية في MN5 سوما (الشكل 6) دون استخدام أية حاصرات قنوات أيون ^12.

الشكل 1. الإعداد التنظيف. هو مقيد والطيران بانخفاض في غطاء والمغلفة sylgard من طبق بيتري 35 ملم التي نعمل لصقها حلقة البلاستيك (قطر داخلي 9 مم، 1.3 مم) ثإيث الفازلين (A، B). بعد غمر في المياه المالحة الطاير (C) يتم فتحه على طول خط الوسط الظهرية. تتم إزالة الأمعاء والمريء لفضح الحبل البطني العصب (D). لتحسين إمكانية الوصول إلى قسيم عصبي الصدري تتم إزالة الرأس (E). بعد تصاعد إعداد على المجهر لepifluorescence تستقيم، يتم إحضارها نظام نضح (F، G، المالحة في، المالحة المغادرة، السهام البيضاء على اليمين) وكذلك سلك الأرض في موقف (F، G، سهم الابيض يوم الحق). يتم إحضارها الانزيم شغل تنظيف ماصة في الموقف بعد أن تم خفض الهدف الغمر بالماء (40X، NA 0.8) في حمام (H). من أجل الوضوح نعرض بالفعل قبل أن يتم خفض الهدف (F، G، سهم أبيض على اليمين). الزاوية التي ماصة الانزيم الذي يقام من قبل صاحب 1-HL-U الكهربائي (J) يدخل غرفة تسجيل لا يقل أهمية عن ماصة يجب عدم لمس كل من الهدف وحلقة بلاستيكية. هذه الزاوية تختلف من الإعداد لبرنامج الإعداد. ومن هنا ما يقرب من 30 ° (انظر الرسم في J، K السهم في). يظهر ترتيب ماصة على حامله التي يتم تركيبها على headstage في (L). يتم إرفاق headstage إلى مياداة مجهرية الآلية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. MN5 في الحبل البطني العصب، ويمكن تحديدها بسهولة من قبل MN5 موقعه في العصب الحبل البطني ذبابة الفاكهة (VNC) عندما يتم التعبير عن GFP وراثيا عن طريق استخدام برامج تشغيل العصبون الحركي GAL4 محددة (A). المستطيل المنقط يصور قسيم عصبي الصدري. للحصول على فكرة عن كيفية أحجام تتصل بعضها ببعض، وتبين لنا ماصة التصحيح تنظيف يقترب من MN5 اليسرى من الجانب الأيسر من عضلات الطيران dorsolongitudinal. لتحسين التصور، وقد شغل ماصة التصحيح مع صبغة حمراء (ديكستران-tetramethylrhodamine، A). وcontralatوتقع إسقاط erally MN5 على السطح الظهري للقسيم عصبي mesothoracic من VNC على كل جانب من خط الوسط (مشاهدة الإسقاط من كومة صورة مبائر في B). وتوقع ipsilaterally MN1-4 وتقع أكثر إبداعا والمتعلقة الأمامية لMN5 (الأسهم في B). دائرة منقط بين كل من MN5 يصور التشعبات من العصبونات الحركية في رحلة neuropil بما في ذلك MN5 (B). وتعززت التسمية في GFP (B) عن طريق تلطيخ المناعى مع الأجسام المضادة ضد GFP. مصنوعة من التفاصيل MN5 مورفولوجيا مرئية عن طريق ملء الخلايا العصبية داخل خلوي (iontophoretically) مع neurobiotin التتبع غير مرئية والحصول على الصور مبائر اللاحقة (C). تم تلطيخ مرئية مع streptavidin بالإضافة إلى fluorophore. شريط النطاق هو 30 ميكرومتر.

الشكل 3. ويتحقق MN5 قبل وبعد التنظيف. التصور من MN5 من التعبير عن GFP باستخدام UAS/GAL4نظام (A، C، انظر تسمية). MN5 قبل (A، B) وبعد (C، D) إجراء التنظيف. اليسار الجانب من كل صورة تمثل الأمامي، أليس كذلك الجانب الخلفي يمثل. يتم تنظيف الخلايا العصبية لتسجيل من التصحيح مع ماصة البروتيني مليئة طرف مكسورة. ماصة الانزيم هو فقط مرئية بصوت ضعيف (A، B، انظر تسمية). أقحم في A يظهر توسيع MN5 أسفل مع ماصة انزيم الاقتراب من الخلية. لا يمكن أن ينظر إليه في MN5 الضوء الساطع الذي يسبق عملية التنظيف (B). القصبة الهوائية تحتاج إلى إزالة إذا كانت تغطية خلايا قيد التحقيق. بعد إجراء التنظيف، التناقض بين الخلايا والأنسجة المحيطة بها أكثر هش (C، أسفل MN5)، ويمكن الآن أن ينظر إلى الخلية في الضوء الساطع (D). ويمكن رؤية الطرف ماصة أكثر وضوحا عند استخدام الضوء الساطع. توسيع يصور المنطقة في مربع منقط مع MN5 الحدود مع جسم الخلية طوق خط منقط لتحسين تحديد الهوية. التصور في الضوء الساطع يساعد غالبا ما تصدر أحكاما النظافة.

<ف الطبقة = "jove_content">
الشكل 4. الكالسيوم الحالية في MN5. تسجيل مثال كامل التيارات الكالسيوم الخلية كما هو مسجل من MN5. وترد اثنين على الأقل من الكالسيوم التيارات المختلفة، وانخفاض الجهد عابرة الكالسيوم وتنشيط الكالسيوم عالية الجهد المستمر الحالية. وأثار التيارات من المحتمل عقد -90 بالسيارات. تم تطبيق الخطوات من الجهد -90 إلى +20 بالسيارات بالسيارات. واستخدمت حاصرات قنوات أيون لمنع أخرى من العالم. حذفت التحف من أجل الوضوح (لتوصيف التيارات الكالسيوم MN5 انظر Ryglewski وآخرون، 2012).

الشكل 5. التيارات البوتاسيوم في MN5. تسجيل مثال كامل التيارات البوتاسيوم الخلية كما هو مسجل من MN5. أظهرت التيارات تشمل الكالسيوم البوتاسيوم تنشيط التيارات حيث تم تطبيق أي حاصرات قنوات الكالسيوم. وأثار التيارات من محجرإمكانات -90 بالسيارات البوتاسيوم ليبلغ المجموع الحالي (A) أو من المحتمل عقد بالسيارات -20 إلى تعطيل التيارات البوتاسيوم عابرة وتظهر فقط البوتاسيوم المستمر الحالية (B). تم تطبيق الخطوات من الجهد -90 إلى +20 بالسيارات بالسيارات في 10 زيادات بالسيارات. حاليا الطرح التيارات البوتاسيوم كما أثار من المحتمل عقد -90 بالسيارات (A) و -20 بالسيارات (B) تكشف نقية التيارات البوتاسيوم عابرة (C). أغلقت بوابات الجهد قنوات الصوديوم. حذفت التحف من أجل الوضوح (لتوصيف MN5 الجهد والتيارات البوتاسيوم والكالسيوم وانظر Ryglewski دوتش، 2009).

الشكل 6. اطلاق نمط أظهرتها MN5. تسجيل مثال على اطلاق أنماط أثارت كما هو الحال في MN5 عن طريق الحقن الجسدية الحالية (0.4 NA، أسود، 0.5 NA، رمادي) لمدة مللي 200. كان يستريح غشاء المحتملة -59 بالسيارات. لم يستخدم أي حاصرات قنوات أيون. (لتحليل المشبك الحالي لإطلاق MN5أنماط رؤية دوتش وآخرون، 2008).

Discussion

عندما تصور الخلايا مع البروتينات الفلورية مثل GFP، من المهم عدم الإفراط في تعريض إعداد للضوء أكثر من اللازم. وهذا قد يؤدي إلى تلف الصورة. نستخدم 100W HBO الزئبق قوس قصيرة المصابيح لإضاءة، ونحن أيضا استخدام الكثافة المحايدة (ND) 0.8 (الفلاتر ND صفاء 0.3 و 0.5). لتكون قادرة على الحكم على جودة الرؤية خير التنظيف أمر بالغ الأهمية. لذلك، قد تتم إزالة مرشحات ND لفترات قصيرة من حوالي 20 لمرات متعددة.

عند تطبيق بعض الضغط الإيجابي، وجسم الخلية "اللوحات" قليلا. ويساعد هذا الحكم على جودة النظافة. في المقابل العصبية الحبل البطني منخفضة جدا، ويمكن أن تكون حركة مفيدة للغاية لتصور الخلايا. صاحب القطب والذي يتم استخدامه لإجراء التنظيف (وكذلك للقط التصحيح) يجب أن يكون مغلقة بإحكام؛ تسيطر على خلاف ذلك تطبيق الضغط لن يكون ممكنا. سوف يفقد ضغط تخل إزالة الأنسجة بنجاح وDEBسوف RIS ومنع جيجا ختم تشكيل

في حالة في الموقع تسجيلات المشبك التصحيح يجب أن يؤديها بعد تنظيف الخلية، تكون على علم بأن هناك ليس فقط غمد المحيطة الحبل البطني العصب ككل (التي تحتاج إلى إزالة أية التصحيح المشبك تسجيل أي الخلايا العصبية المركزية من الذباب الكبار )، ولكن قد تكون محاطة الخلايا نفسها من غمد أيضا. MN5، على سبيل المثال، يحيط بها غمد غير الخلوية التي يمكن رؤيتها فقط مع موجز الإضاءة عالية الكثافة. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون موجودا تحت خلايا القصبة الهوائية. في حالة لا يمكن الخلية يمكن الوصول إليها، والقصبة الهوائية يجب أن يتم سحبها جانبا إن لم يكن انفصل مع ماصة أثناء إجراء تنظيف (بعد أن سحبت جانبا). إجراء التنظيف كله يجب القيام به دون سحب الكثير من الأنسجة. وسوف يتطلب هذا الإجراء التدريب. وأفضل التنظيف، وسيكون أعلى وتيرة الفوري GIGA-الأختام (في حدود 1 ق بعد لمس الخلية والرطوبةتخفيف الضغط الإيجابي).

اعتمادا على بروتوكول التنظيف وانهيار في السيناريوهات التالية ممكنة: أولا، إذا لم تنظف جيدا بما فيه الكفاية الخلايا، وختم جيجا غير ممكن ويجب إنهاء التجربة. الثانية، في بعض الحالات تنظيف جيدة بما يكفي لتشكيل ختم جيجا لكن رقيقة، بالكاد مرئية بقايا من غمد لا تزال في جميع أنحاء سوما. سيؤدي ذلك إلى تمزق الغشاء وتسبب تسرب التيارات من سعة المختلفة. والنتيجة أقل حدة من تنظيف الخلية غير كافية هو أن بعض فلول السبب في غمد يزيد المقاومة الوصول. قد اعتمادا على معايير جودة التصميم المختلفة التجريبية لتطبيق التصحيح. لرصد أنماط العمل المحتملة في المشبك الحالي يجب أن إمكانات غشاء الخلية تكون صحية (-55 بالسيارات أو أكثر hyperpolarized في حالة MN5)، ولكن المقاومة وصول ليست هذه قضية مهمة. ومع ذلك، عندما تستحضر إمكانات العمل من قبل حقن الحالي إعادة الوصولاملساعدات يصبح قضية. لإثارة كبيرة السعة التيارات البوتاسيوم التي تنشأ بالقرب من موقع تسجيل تسرب ينبغي أن تكون صغيرة (في حالة الإدخال يجب MN5 المقاومة من قبل أعلى من 80 MΩ) والمقاومة لا ينبغي أن يكون الوصول أكبر من 15 MΩ. لالمشبك الفضاء ما هو مطلوب في التسجيلات المشبك الجهد الصغيرة التيارات السعة الكالسيوم شجيري التي تنشأ على مسافة ليست بالقصيرة من سوما ويمكن إدخال أي تسرب (للMN5 المقاومة المدخلات يجب أن يكون فوق 120 MΩ) والمقاومة الوصول لا يمكن أن يكون أعلى من 12 MΩ. في معظم التسجيلات نقيس التيارات الكالسيوم مع المقاومة وصول ما بين 8 و 10 MΩ (اقرأ اعتبارا من الطلب على مكبر للصوت axopatch 200B بعد سلسلة المقاومة والسعة تعويض كامل الخلية). لكل نوع من الخلايا ليتم تسجيلها، لا بد من تحديد معايير الجودة مثل على حدة.

التنظيف باستخدام الإجراء الموصوفة هنا، يمكننا الاستمرار على تسجيلات مستقرة لapproximately 90 دقيقة. نحن لا نلاحظ كبير متهدم (اختبار خصيصا لالتيارات الكالسيوم وCav2 Cav3 وشاكر، الشال، وتأخر التيارات البوتاسيوم المعدل). ومع ذلك، فإننا لم أحاول لعقد التصحيح أطول وبالتالي لا يمكن القول ما إذا كان يعد من الممكن التسجيلات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease type XIV	Sigma Aldrich USA	P5147
Microfil flexible injection needle	World Precision Instruments USA	MF28G-5
Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament	World Precision Instruments USA	PG52151-4
DiI	Invitrogen USA	D3899
Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT
ND filter set (unmounted)	Chroma Technology Corp.	22000b series
Electrode holder 1-HL-U	Molecular Devices	1-HL-U