Fremstilling af Published: October 15, 2012 doi: 10.3791/4264

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stefanie Ryglewski¹, Carsten Duch¹

¹School of Life Sciences, Arizona State University

Summary

In situ patch clamp-optagelser anvendes til elektrofysiologisk karakterisering af neuroner i intakt kredsløb. I Drosophila genetisk model patch fastspænding er vanskelig, fordi de CNS er lille og omgivet af en robust kappe. Denne artikel beskriver procedure for at fjerne hylsteret og rene neuroner for efterfølgende patch clamp optagelser.

Abstract

Korte generation tider og letkøbte genetiske teknikker gør bananfluen Drosophila melanogaster en fremragende genetisk model i fundamental neurovidenskab forskning. Ionkanaler er grundlaget for al adfærd, da de medierer neuronal excitabilitet. Den første spænding gated ion klonet kanal var Drosophila spænding gated kaliumkanal Shaker ^1,2. Til forståelse rolle for ionkanaler og membran excitabilitet for nervesystemet funktion er det nyttigt at kombinere stærke genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila med in situ patch clamp optagelser. I mange år har sådanne optagelser er blevet vanskeliggjort af den lille størrelse af Drosophila CNS. Desuden en robust kappe fremstillet af glia og kollagen udgjorde hindringer for patch pipette adgang til centrale neuroner. Fjernelse af denne kappe er en nødvendig forudsætning for patch clamp optagelser fra enhver neuron i den voksne Drosophila CNS. I de senere årforskerne har været i stand til at udføre in situ patch clamp optagelser fra neuroner i den voksne hjerne ^3,4 og ventrale nerve ledning af embryonale ^5,6, larve ^7,8,9,10 og voksne Drosophila ^11,12,13,14. En stabil giga-forsegling er den vigtigste forudsætning for et godt plaster og afhænger af ren kontakt af patch-pipetten med cellemembranen for at undgå lækage strømme. Derfor skal for hel-celle in situ patch clamp optagelser fra voksne Drosophila neuroner renses grundigt. I det første trin, har ganglioniske kappe, der skal behandles enzymatisk og mekanisk fjernet for at gøre målcellerne tilgængelige. I det andet trin, har cellemembranen, der skal poleres, således at ingen lag af glia, collagen eller andet materiale kan forstyrre giga-forsegling formation. Denne artikel beskriver, hvordan man forbereder en identificeret central neuron i Drosophila ventrale nerve ledning, flyvningen motoneuron 5 (MN5 ^15), for somatiske hel cEll patch clamp optagelser. Identifikation og synligheden af ​​neuron opnås ved målrettet ekspression af GFP i MN5. Vi har ikke til formål at forklare patch clamp-teknikken selv.

Protocol

Den følgende beskrivelse er ikke specifik for en motoneuron. Den kan bruges med alle neuron. I dette eksempel anvender vi flyvningen motoneuron 5 (MN5), der innerverer de to dorsalmost fibre dorsolongitudinal fløj depressor muskel (DLM). At identificere og visualisere MN5 bruger vi UAS/GAL4 system til at udtrykke GFP i flight motoneuroner (og få andre neuroner).

1. Dissektion af Voksen Drosophila til Access den dorsale del af den ventrale Nerve Cord (VNC)

1. Dissekere en voksen Drosophila dorsale side op langs dens dorsale midtlinie i en Sylgard coatet petriskål (35 mm diameter), som beskrevet i Ryglewski og Duch (2009 ^13). En film af denne dissektion er tilgængelig online via Jove (Boerner og Godenschwege ^16. Herunder er en kort beskrivelse af dissektion.
2. Voksne fluer bedøves ved afkøling på is i cirka 1 minut. Dette kan opnås ved for-køling en tom flue hætteglas (uden føde)på is og placere fluen i den allerede kolde hætteglas. Vinger og ben er fjernet med en saks.
3. The flue derpå fastgjort dorsale side op i en Sylgard coatet petriskål (vi bruger låget på en 35 mm petriskål fyldes til randen med Sylgard, figur 1A, B) med en plastring (indre diameter 9 mm, 1,3 mm tyk ) limet til Sylgard med vaseline.
4. Anvendelsen af ​​låget på en 35 mm petriskål letter adgang til VNC med en patch-pipette under visualisering med vand dypning linse. Dette medvirker til at indføre pipetten overfladisk uden at røre væggen af ​​skålen.
5. Den plastring kan fremstilles ved at bore et hul i et tyndt (vi bruger 1,3 mm tykkelse) plastark. Vi anvender en bidetang til at definere den ydre omkreds af ringen, så det passer skålen.
6. Nedsænkes flue i normalt saltvand (figur 1C; sammensætning af saltvand i mM: NaCl 128, KCl 2, _CaCI2 1,8, _MgCI2 4, HEPES 5, saccharose ~ 35 Depende på osmolaliteten af ​​opløsningen, pH justeres til 7,25 med 1 M NaOH, er osmolalitet justeret til 290 mOsm med saccharose).
7. Dyret dissekeres langs den dorsale midtlinje, og de store dorsale langsgående flyrejser muskler strækkes på tværs og fastgjort for at eksponere tarmen, spiserøret, og VNC nedenunder. Efter fjernelse af tarmen og spiserøret, er VNC eksponeret (figur 1D).
8. Eventuelt kan flyve halshugget på dette trin (fig. 1E). Fjernelse hovedet gør adgangen med enzymet og patch pipetter mere bekvem, og MN5 dendritter ikke forstyrres ved rengøring af soma (dendritter er posteriort for soma, fig 2B, C). Dog kan hovedet også stå intakt hvis det kræves af det eksperimentelle design (fx studier af faldende input til thorax motoneuroner). I dette tilfælde pipetten kan indføres fra posterior eller lateral (lateral, figur 2A).
9. For hurtigsaltvand udveksling ved forsøg volumenet af registreringskammer minimeres ved at anbringe en plastring (indre diameter 9 mm) omkring dissekeret dyr og limning den til skålen med vaseline (figur 1A, B, volumen registreringskammer er ~ 200 pl) .
10. Fremstillingen bliver så monteret på en opretstående fast fase fluorescensmikroskop (vi bruger Zeiss Axioskop 2 plus FS, Zeiss, Tyskland) og set med en høj NA (> 0,75), lang arbejdsafstand (> 2 mm), 40x vand dypning mål. Perfusionssystemet (saltvand-in, saltvand-out), er jordledningen, og enzymet pipette indført i registreringskammer (fig. 1F - J, L).

2. Visualisering af MN5 (se figur 2 og 3), uden hoved

1. Monter petriskålen på en opretstående fast fase epifluorescens mikroskop.
2. Placer skålen med fluen i den, så den forreste del vender den side, hvor elektrodeholderen ermonteret (fig. 1).
3. Brug en stor forstørrelse (40x eller højere), høj NA vand dyppe linse (NA 0,75 eller højere) og en GFP-filter til at belyse VNC. For god visualisering af cellen under rengøring vi bruger 40x vand dypning linser med en NA på enten 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW), eller en NA på 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). For god adgang med patch pipette arbejdsmiljøet afstand skal være 2 mm eller større.
4. Begge MN5 er placeret i mesothoracic neuromere på den dorsale overflade af ganglion tæt ved midterlinien mellem - og eventuelt delvist dækket af - fremtrædende trachea (figur 2 og 3). MN5 med deres dendritter fremstå som en diffus grønt område. Den somata blevet mere tydelig efter rengøring. Imidlertid vil deres dendritter ikke forekommer skarpe men forbliver sløret på grund af dem stadig er dækket af væv (figur 2A, B).
5. I vores setup bruger vi en HBO 100 fluorescens lyskilde, hvor vi kan ikke at moderder betingelserne lysoutputtet intensitet. Vi bruger neutralfiltre at undgå overeksponering af vævet for meget fluorescerende lys, især blåt lys. Dette kan forårsage billede beskadigelse og i sidste ende vil dræbe cellerne. Vi anvender neutral tæthed på 0,8. Ingen blegning bør forekomme i løbet af rengøringen. Hvis blegning opstår, sandsynligvis lyseffekten er for stærk. Cellen er tilgængeligt beskadiget.
6. Hvis LED-belysning er anvendt de intensitet indstillinger vil skulle fastlægges af eksperimentatoren. Blegning er et tegn på lysbeskadigelse og skal undgås.

3. Alternativ metode til visualisering af MN5

For vores ansøgning er det vigtigt at have cellen mærkes, for eksempel med målrettet ekspression af GFP. Alternativt kan Dil, en lipofil farvestof, anvendes til retrogradt navngive dette neuron. I dette tilfælde farvning krystaller er indsat i flugt musklen under anvendelse af et insekt minutien pin, og såret lukkes med UV hærdende lim.

1. Gøre en Dil stamopløsning ved at opløse nogle DII krystaller (ingen specifik mængde) i 100 pi 70% ethanol. Denne opløsning kan opbevares ved -20 ° C indtil opbrugt. Gentagen frysning og optøning er ikke et problem.
2. 5 ul af opløsningen derefter pipetteret på en ubehandlet dækglas. Vente, indtil ethanol er afdampet. Det tager kun et par min.
3. Anbring en flue i en forud afkølet hætteglas (ved at stikke det i is) og afkøles i en kort tidsperiode (under 1 min) på is. Anbring den kolde bedøvet flue på en køleplade under en dissektion stereomikroskop.
4. Centrer flue og holde det på plads, så det kan ikke blive skubbet til side nemt når de stukket med en minutien pin.
5. Brug to pincet, en til at holde minutien pin, den anden til at holde fluen nede.
6. Brug grove pincet til at holde et insekt minutien pin og ridse nogle af de Dil fra dækglasset, således at der er en Dil krystal på spidsen af ​​minutien stiften (ved hjælp afmeget samme dækglas og den meget samme sted på denne dækning glide hver gang hjælper til at få mere farve på pinden hver gang proceduren gjort). Tappen må ikke for spidse, kan det bøje lettere og derpå vanskeligt at bruge.
7. Derefter punkterer et hul i midten af ​​flue dorsale thorax med minutien pin med Dil på spidsen. De to dorsalmost muskelfibre i dorsolongitudinal flyvning musklen (DLM, muskelfibrene 5 og 6 på hver side) er innerverede af MN5. Derfor placerer farvestof krystaller lige i midten af ​​brystkassen sikrer, at begge MN5 vil blive mærket, fordi begge muskelfibre 6 i DLM vil blive såret og få nogle farvestof.
8. Farvestoffet skal placeres direkte under neglebånd. Hvis farvestoffet er indsat for dybt, kan flyve blive stukket eller andre neuroner (f.eks MN1-4) kan mærkes også.
9. Dette gentages, indtil nok farvestof (dette er et spørgsmål om praksis og erfaring) er indsat i thorax
10. Dil er ikke vand soluble, hvorfor det ikke vil blive opløst i cytosolen af ​​musklen og skal "fyld" under overhuden.
11. Derefter en anden minutien pin dyppes i en dråbe af UV-hærdende lim (vi sætte en dråbe lim i en vejebåd).
12. Den lim, der nu er på spidsen af ​​minutien pin anvendes til at lukke såret, hvor farvestoffet krystaller blev indsat.
13. Efter påføring af en lim (kun lidt at lukke såret, ikke hele thorax) en UV-pistol anvendes til at hærde limen. Vi anvender to 10 s intervaller på UV-lyseksponering.
14. De behandlede fluer er sat på friske fødevarer i en flue hætteglas. Sørg for, at lim plet på fluerne 'brystkasse ikke klæber til væggene i hætteglasset der fælder fluen.
15. Farvestoffet brug for et par timer at nå målet neuron. Den bevæger sig langs membranen, ikke i cytosolen da det er lipidopløselig. Vi behandler dyrene i eftermiddag og lad dem natten over.
16. Patch-clamp-eksperimenter udføres den følgende dag. Neuronerne bliver mindre synlige i forhold til anvendelsen af ​​genetisk udtrykte GFP.

4. Fremstilling af Enzyme pipetten der anvendes til rensning

Det er vigtigt at sikre en konstant strøm af saltvand gennem registreringskammer. Under badet volumen stiger og falder skal undgås, da det forårsager vibration og opveje eventuelle ændringer i løbet af eksperimenter. Perfusion og sug skal fastsættes i overensstemmelse hermed. Dette gør opløsning udveksling meget lettere, som igen er vigtig for hurtig udvaskning af protease før forsøget og hurtig udveksling af farmakologiske midler under eksperimentet.

1. Sikre perfusion af optagelsen kammeret (strømningshastighed på cirka 2 ml pr min). Strømningshastighed kan reguleres enten ved anvendelse af en hane eller ved hjælp af specifik diameter slanger (jo større diameter, jo højere strømningshastigheden). Har det antal af kammeret så lille som muligt for at sikre hurtig udveksling af opløsningen i the kammer. Dette sikrer hurtig fjernelse af protease og blokkere fra optagelsen kammer.
2. Volumenet af kammeret afhænger af hvordan saltvand-ud (fig. 1) i perfusionssystemet indsættes i optagelsen kammer (ved nedsænkning i vand målet sænkes ned i badet).
3. Sørg for, at saltvand-out er placeret på en sådan måde, at titeren af ​​optagelsen kammer ikke stiger og falder konstant (sugning, stige, suges stigning), men forbliver konstant (steady sugning). Vi bestemme jævn og stabil perfusion af den konstante, uden afbrydelser klukkende lyd, der frembringes ved konstant suger saltvand ud af badet.
4. Som saltvand ind og-ud vi bruger kanyler, der er bøjet og fastgjort til smalle slanger og placeret nær optagelse kammer ved hjælp af modellervoks (figur 1F).
5. Træk et patch-pipette og bryde spidsen lidt under visuel kontrol. Brug tynde rene tang. Når visualisere pipetten under 40x nedsænkning i vand linse pipettespidsen diameter bør være omtrent mellem 40 og 70% af cellens soma diameter. Meget store spidser (ca. cellediameter eller større) kan også anvendes, men sandsynligheden for at flå cellelegemet øges som følge af kapillarkræfterne af pipetten. Bliver pipetten meget små (mindre end 10% af soma diameter), det træsko let, hvilket resulterer i at skulle anvende en eller flere friske pipette (er) under rensningen.
6. Fylde pipetten med 2% protease i PBS-buffer eller saltvand uden at tilstoppe den.
7. Sæt enzymet pipette ind i elektrodeholderen. For at sikre korrekt styring af det påførte tryk, at indehaveren skal tæt lukket.
8. Vedhæfte en slange til den lille udtag på pipetten holderen og sikres på en sådan måde, at trække i den frie ende af røret ikke påvirker pipetten der blev indsat i pipetten holderen. Check for bevægelse under mikroskop.
9. Indsætte enten en plast p ipette spids (den slags, der bruges med en automatisk pipette, bruger vi de blå 1000 pi dem, men dette er et spørgsmål om præference. Andre størrelser kan anvendes såvel) eller en sprøjte med en hane til den frie ende af røret at kunne anvende positive og negative tryk til den enzym / patch-pipette. Positivt tryk påføres ved enten at blæse ind i pipettespidsen (bruge det som et mundstykke) eller ved at skubbe sprøjten ned. Negativt tryk tilføres ved sugning (med munden ved hjælp af mundstykket) eller ved at trække i sprøjten.
10. Formålet med de positive og negative tryk applikationer er at løsne og fjerne celler og nedbrudt materiale omgiver cellerne der undersøges. Positivt tryk vil skubbe enzym fra rengøring pipette og blæse snavs væk fra overfladen af ​​CNS. Undertryk anvendes til at suge affald fra VNC (som en støvsuger).

5. Rengøring af GFP-mærkede MN5 (figur 3 og video)

indhold "> Note til læseren: Images of MN5 før og efter rengøring er svært at skelne i figur 3 Dette er, hvad du får i det virkelige liv Det vil tage nogle uddannelse at lære at skelne de subtile forskelle mellem rengøres og urensede.. neuroner. Bemærk venligst, at disse subtile forskelle kan ses bedre i levende billeder. Derfor filmen giver et bedre indtryk end de statiske billeder (Figur 3).

1. Visualisere enzymet fyldt pipette under 40x vand dyppe linse med stærkt lys (figur 3B, hvid pil).
2. Fokus på pipettespidsen. Hvis det er tilstoppet, så prøv at få snavs ud ved at anvende positivt eller negativt tryk. Hvis snavset ikke kommer ud, forberede et nyt enzym fyldt pipette.
3. Skifte til fluorescerende lys (figur 3A).
4. Sænk enzymet pipette forsigtigt og refokusere indtil cellelegemet kan ses.
5. Når enzymet pipetten er tæt påcellen kroppen, skifte perfusion off.
6. Påfør positivt tryk i korte stød mod cellen kroppen, så alt det, der hæmmer adgangen til cellen vil blive løsnet. Dette skal ske indtil vævet, der omgiver cellelegemet løsnes.
7. Også bevæge enzymet pipette dorsalt at fange løst snavs, der kan være en venstre fra det ganglioniske kappe, der omgiver VNC. Det kan være blevet fjernet allerede ved dissektion før montering forberedelsen på mikroskop (dette er ikke altid tilfældet).
8. Med skiftende anvendelse af positive og negative tryk, anvende enzymet pipette som en støvsuger og vakuum omkring cellelegemet. Det er ikke nødvendigt at løsne hele cellelegemet fuldstændigt. Rengøring den forreste del af soma vil gøre (eller den bageste eller sidedel afhængigt af hvilken side pipetten nærmer sig soma).
9. Denne rengøring procedure er gjort indtil membranen ser fri for snavs.
10. Den membrane er ren, når der ikke er nogen "skyggen" eller diffus kontrast mellem cellen og det omgivende væv, når de ses med fluorescerende lys udelukkende. Dette ses bedst med høj intensitet blåt lys. Derfor øger lysintensiteten et øjeblik (vi fjerner neutralfiltre at nå dette). Bemærk, at omfattende blåt lys eksponering, som leveres af en almindelig HBO 100 kviksølv pære kan forårsage foto skade i omkring et minut. Dette vil resultere i GFP signal til at falme når cellerne dør.
11. Skift til lys og fjerne celler og nedbrudt materiale, som ikke kunne ses med fluorescerende lys. Bemærk, at visualisering af luftrøret og rengøring status kan drage fordel af at skifte mellem lys og fluorescerende lys.
12. Når rengøringen procedure er afsluttet, og cellen kroppen fremstår ren, skifte perfusion systemet igen (gøre det også, hvis rengøringen procedure tager længere tid end 3 til 5 min og fortsætte rengøringen med konstant perfusion) og lyset slukket.
13. Skyl cellen for ~ 15 til 20 min med saltvand eller opløsningen, som vil blive anvendt til den næste ansøgning. Mindst 40 ml skulle gå gennem registreringskammer at være sikker på, at proteasen er vasket ud. Protease rester på celleoverfladen vil forårsage pludselig celledød i ellers stabile patch-clamp-optagelser.

6. Elektrofysiologi

1. Konventionel in situ-helcelle-patch clamp i spænding klemme og strømtang tilstand udføres under anvendelse af en Axopatch 200B-forstærker (Molecular Devices, USA); signaler digitaliseres ved anvendelse af en Digidata 1320 (Molecular Devices, USA) og analyseret med pClamp 10,2 software.
2. Patch pipetter trækkes fra borsilikatglas kapillarer med en lodret pipette puller (Narishige, PC-10).
3. Pipettespids modstande er mellem 5,8 og 6,2 MOhm (strømtang og kalium aktuelle optagelser) og mellem 2,8 og 3,5 MOhm (for calcium aktuelle optagelser) hhv. Tip modstand afhænger afintra-og ekstracellulære væsker, der anvendes (se nærmere ^{13, 14).}

7. Repræsentative resultater

Efter rengøringen både MN5 er klar til in situ helcelle-patch clamp (figur 3). Det følgende afsnit viser repræsentativ spænding clamp og Strømtænger spor, som er registreret fra MN5 soma efter brug af den beskrevne rengøring procedure. MN5 udtrykker en bred vifte af spænding ionkanaler (se også ^13,14). Vi viser et eksempel på spændingsfølsomme calciumstrømme (Figur 4), spændingsfølsomme kalium strømme (figur 5) og handling potentielle spor (figur 6). Spænding gated calcium og kalium strømme blev fremkaldt af lignende spænding protokoller, men de løsninger, der er blevet anvendt forskellige for at give kun de ionkanaler, der undersøges for at passere strøm (se nærmere ^13,14). Alle andre større spænding gated ion channels er blevet blokeret (spændingsfølsomme natriumkanaler med 100 nM tetrototoxin - pipetterede direkte ind i badet, perfusionen blev standset i to minutter - calcium kanaler med 500 pM cadmiumchloride, kalium kanaler med 2 mM 4-aminopyridin (4-AP) og 30 mM tetraethylammoniumchloride ekstracellulært og 0,5 mM 4-AP, 20 mM tetraethylammoniumbromide og 144 mM cesiumchloride intracellulært via intracellulære patch løsning i patch pipette (for detaljer se ^13,14). virkningspotentiale spor blev fremkaldt af den nuværende injektion i MN5 soma (Figur 6) uden brug af nogen ion-kanal blokkere ^12.

Figur 1. Rengøring setup. Fluen holdt nede i et Sylgard overtrukket låget på en 35 mm petriskål, hvor vi limet en plastring (indre diameter 9 mm, 1,3 mm tyk) wi'te vaseline (A, B). Efter nedsænkning fluen i saltvand (C) den åbnes langs ryggens midterlinie. Tarm og spiserøret er fjernet for at blotlægge den ventrale nerve ledningen (D). For bedre tilgængelighed af den thorakale neuromere hovedet, fjernes (E). Efter montering af præparatet på en opretstående epifluorescensmikroskop, er perfusionssystemet (F, G, saltvand-i, saltvand-out, hvide pile til venstre) og jordledningen bragt i position (F, G, hvide pil på højre). Den fyldte enzym rengøring pipette bringes i position efter nedsænkning i vand mål (40x, NA 0.8) er sænket i badet (H). For klarhedens skyld viser vi det allerede før målet er sænket (F, G, hvid pil til højre). Den vinkel, som enzymet pipette, der fastholdes af et 1-HL-U elektrodeholder (J) er på vej ind optagelsen kammer er vigtig, da pipetten ikke skal røre både formål og plastring. Denne vinkel varierer fra opsætning til opsætning. Her er cirka 30 ° (se tegning i J, pil i K). Arrangementet af pipetten i holderen, som er fastgjort til en hovedtrin er vist i (L). Den hovedtrin er fastgjort til en motoriseret mikromanipulator. Klik her for at se større figur .

Figur 2. MN5 i den ventrale nerve ledningen. MN5, kan let identificeres ved dets placering i Drosophila ventrale nerve ledning (VNC), når GFP er genetisk udtrykkes ved anvendelse af motoneuron specifikke GAL4 drivere (A). Den stiplede rektangel viser thorax neuromere. For at få en idé om, hvordan de størrelser forholde sig til hinanden, viser vi en rengøring patch pipette nærmer sig venstre MN5 fra den venstre side af dorsolongitudinal flyvning muskel. For bedre visualisering blev patch-pipetten er fyldt med en rød farve (dextran-tetramethylrhodamin, A). Den contralatnerelt rager MN5 er placeret på den dorsale overflade af mesothoracic neuromere af VNC på hver side af midterlinjen (projektionsbillede af et konfokalt billedstak i B). Den ipsilaterally udragende MN1-4 ligger mere sideværts og fortil forbundet med MN5 (pile i B). Den stiplede cirkel mellem både MN5 afbilder dendritter af flight motoneuroner i neuropil inklusive MN5 (B). GFP etiket i (B) blev forstærket ved immunohistokemisk farvning med et antistof mod GFP. Detaljer vedrørende MN5 morfologi gøres synlige ved at fylde neuron intracellulært (iontoforetisk) til det usynlige tracer neurobiotin og efterfølgende konfokalt billedoptagelse (C). Farvning blev synliggjort med streptavidin koblet til en fluorophor. Scale bar er 30 um.

Figur 3. MN5 før og efter rengøring. Visualisering af MN5 opnås ved ekspression af GFP ved hjælp af UAS/GAL4system (A, C, se etiket). MN5 før (A, B) og efter (C, D) med rensningen. Venstre side af hvert billede repræsenterer anterior, højre side repræsenterer posterior. Neuroner at optage fra rengøres med en protease fyldt patch-pipette med en brækket spids. Enzymet pipette er kun svagt synlig (A, B, se etiket). Indsat i A viser en forstørrelse af bund MN5 med enzymet pipette nærmer cellen. MN5 kan ikke ses i skarpt lys, før rengøringen procedure (B). Luftrør skal fjernes, hvis de dækker cellerne er omfattet af undersøgelsen. Efter rengøringen, er kontrasten mellem cellen og det omgivende væv mere sprøde (C, bottom MN5), og cellen kan nu ses i stærkt lys (D). Pipettespidsen kan ses mere tydeligt, når lys benyttes. Udvidelsen viser det område i den stiplede firkant med MN5 cellen kroppen grænser omgivet med en stiplet linje for bedre identifikation. Visualisering i skarpt lys hjælper ofte dom af renlighed.

<p class = "jove_content">
Figur 4. Calciumstrøm i MN5. Eksempel optagelse af helcelle calciumstrømme som registreret fra MN5. Mindst to forskellige calcium strømme er vist, en lav spænding aktiveret forbigående calcium og en fortsat høj spænding calcium strøm. Strømme blev fremkaldt fra et holdepotentiale på -90 mV. Spændingstrin fra -90 mV til +20 mV blev anvendt. Blokkere blev anvendt til at blokere de fleste andre ionkanaler. Artefakter blev udeladt for overskuelighedens skyld (for karakterisering af MN5 calciumstrømme se Ryglewski et al., 2012).

Figur 5. Kalium strømninger i MN5. Eksempel optagelse af helcelle kaliumstrømme som optaget fra MN5. Viste strømme omfatter calcium aktiverede kaliumstrømme som ingen calciumantagonister blev anvendt. Strømme blev fremkaldt af en bedriftpotentiale på -90 mV til den samlede kaliumstrøm (A) eller fra et holdepotentiale på -20 mV til inaktivering transiente kaliumstrømme og viser kun den vedvarende kaliumstrøm (B). Spændingstrin fra -90 mV til +20 mV blev anvendt i 10 mV trin. Offline subtraktion af kaliumkanaler som fremkaldt fra et holdepotentiale på -90 mV (A) og -20 mV (B) viser rene transiente kaliumstrømme (C). Spændingsfølsomme natriumkanaler blev blokeret. Artefakter blev udeladt for overskuelighedens skyld (for karakterisering af MN5 spænding og calcium kaliumstrømme se Ryglewski og Duch, 2009).

Figur 6. Firing mønster udstillet af MN5. Eksempel optagelse af fyring mønstre som fremkaldes i MN5 af somatiske nuværende injektioner (0,4 nA, sort, 0,5 nA, grå) på 200 ms varighed. Membranens hvilepotentiale var -59 mV. Ingen ion-kanal blokkere blev anvendt. (For strømtang analyse af MN5 fyringmønstre ser Duch et al., 2008).

Discussion

Når visualisere celler med fluorescerende proteiner såsom GFP, er det vigtigt at ikke overeksponere præparatet for for meget lys. Dette kan resultere i foto skader. Vi bruger 100W HBO kortbue kviksølv pærer til belysning, og vi bruger også neutral tæthed (ND) på 0,8 (Chroma ND-filtre 0,3 og 0,5). For at kunne bedømme kvaliteten af ​​rengøringsprocessen godt udsyn er afgørende. Derfor kan ND-filtre fjernes i korte perioder på omkring 20 s til flere gange.

Når de anvender nogle positive pres, cellen kroppen "flapper" en smule. Dette hjælper at vurdere kvaliteten af ​​renlighed. I den ventrale nerve ledning kontrast er meget lav, og bevægelse kan være ekstremt nyttigt at visualisere celler. Elektrodeholderen, der bruges til rengøring procedure (og også for patch fastspænding) skal tæt forseglet, ellers kontrolleret tryk ansøgning vil ikke være mulig. Miste pres vil forstyrre vellykket fjernelse af væv og debRIS og vil forhindre giga-seal formation

I tilfælde in situ patch clamp optagelser skal udføres efter rengøring af cellen, være klar over, at der ikke kun er et hylster der omgiver den ventrale nerve ledning som en helhed (som skal fjernes for enhver patch clamp-optagelse af en central neuron af voksne fluer ), men cellerne selv kan være omgivet af en kappe samt. MN5, fx omgivet er af en ikke-cellulær kappe, som kun kan ses med kortvarig høj intensitet belysning. Desuden kan celler placeret under luftrøret. I tilfælde cellen kan ikke få adgang, luftrøret skal trækkes til side, hvis der ikke rippet med pipetten under rengøring procedure (efter at være blevet trukket til side). Hele rengøringsprocedure skal gøres uden at trække i vævet alt for meget. Denne procedure vil kræve uddannelse. Jo bedre rengøring, desto højere vil hyppigheden af ​​øjeblikkelige giga-forsegling (inden for 1 s efter berøring cellen og rellette positivt tryk).

Afhængigt af rengøringsprotokol og indbrud i følgende scenarier mulige: det første, hvis cellerne ikke blev renset godt nok, en giga-forsegling ikke er mulig, og forsøget skal afsluttes. For det andet, i nogle tilfælde rengøring er tilstrækkelig for giga-forsegling dannelse, men en tynd, næppe synlig rest af kappen forbliver omkring soma. Dette vil bringe membranen til at briste og forårsage lækage strømme af forskellige amplituder. En mildere konsekvens af utilstrækkelig celle rengøring er, at nogle rester af skeden årsag stiger i adgangen modstand. Afhængigt af de eksperimentelle design forskellige kvalitetskriterier for plasteret kan finde anvendelse. Til overvågning action potentielle mønstre i strømtang membranpotentialet i cellen skal være sund (-55 mV eller mere hyperpolariserede i tilfælde af MN5), men adgangen modstand er ikke et så vigtigt spørgsmål. Men når vækker virkningspotentialer ved strømindkobling adgang reisoleringsmodstanden bliver et problem. Til at fremkalde stor amplitude kaliumstrømme som opstår tæt på optagelsen stedet lækagen skal være lille (for MN5 indgangsmodstand most ved højere end 80 MOhm) og adgang resistens bør ikke være større end 15 MQ. For den plads klemme, der er nødvendig i spænding clamp optagelser af små amplitude dendritiske calcium strømme, der stammer i temmelig lang afstand fra soma nogen lækage kan indføres (for MN5 indgangsmodstand skal være over 120 MOhm) og adgang resistens kan ikke være højere end 12 MQ. I de fleste optagelser måler vi calciumstrømme med adgang modstand mellem 8 og 10 MOhm (som læst fra skiven på Axopatch 200B forstærker efter serie modstand og helcelle kapacitans kompensation). For hver celletype, der skal registreres, skal disse kvalitetskriterier bestemmes individuelt.

Brug af rengøring proceduren beskrevet her, kan vi holde optagelserne stabile for indbyrdestely 90 minutter. Vi har ikke overholder betydelig nedslidte (testet specifikt for CAV2 og Cav3 calcium strømme og for Shaker, Shal, og forsinkede ensretter kaliumstrømme). Imidlertid har vi ikke forsøgt at holde plasteret længere og kan derfor ikke oplyse, om længere optagelser ville være muligt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease type XIV	Sigma Aldrich USA	P5147
Microfil flexible injection needle	World Precision Instruments USA	MF28G-5
Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament	World Precision Instruments USA	PG52151-4
DiI	Invitrogen USA	D3899
Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT
ND filter set (unmounted)	Chroma Technology Corp.	22000b series
Electrode holder 1-HL-U	Molecular Devices	1-HL-U