Summary
In situ di patch clamp registrazioni sono utilizzate per la caratterizzazione elettrofisiologica dei neuroni nel circuito intatto. Nel modello Drosophila genetico cerotto bloccaggio è difficile perché il CNS è piccolo e circondato da una guaina robusta. Questo articolo descrive la procedura per rimuovere i neuroni guaina e pulite per le registrazioni successive patch clamp.
Abstract
Tempi di generazione brevi e facili tecniche genetiche rendono il moscerino della frutta Drosophila melanogaster un ottimo modello genetico fondamentale nella ricerca neuroscientifica. I canali ionici sono la base di tutti i comportamenti in quanto mediare l'eccitabilità neuronale. Il primo canale ionico tensione gated clonato è stata la tensione di Drosophila gated canale del potassio Shaker 1,2. Verso la comprensione del ruolo dei canali ionici e di eccitabilità della membrana per il funzionamento del sistema nervoso, è utile combinare potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila con registrazioni in situ patch clamp. Per molti anni tali registrazioni sono stati ostacolati dalla piccola dimensione del SNC Drosophila. Inoltre, una guaina robusta fatta di glia e collagene costituivano ostacoli per l'accesso delle patch pipetta neuroni centrali. La rimozione di questa guaina è un presupposto necessario per le registrazioni di patch clamp da ogni neurone del sistema nervoso centrale adulto Drosophila. In anni recentiscienziati sono stati in grado di effettuare in situ registrazioni patch clamp da neuroni nel cervello adulto e 3,4 cordone nervoso ventrale del 5,6 embrionale, larvale 7,8,9,10, e adulti Drosophila 11,12,13,14. Una stabile giga-sigillo è il presupposto indispensabile per una buona patch e dipende contatto pulito della pipetta patch con la membrana cellulare per evitare correnti di perdita. Pertanto, per la cellula intera nelle registrazioni in situ patch clamp da neuroni adulti di Drosophila devono essere puliti a fondo. Nella prima fase, la guaina gangliare deve essere trattata enzimaticamente e rimosso meccanicamente per rendere accessibili le cellule bersaglio. Nella seconda fase, la membrana cellulare deve essere lucidato in modo che nessun strato di materiale glia, collagene o altro possono disturbare giga-sigillo formazione. In questo articolo viene descritto come preparare un neurone identificato centrale nel cordone nervoso ventrale Drosophila, il motoneurone volo 5 (MN5 15), per tutto il c somaticaell di patch clamp. L'identificazione e la visibilità del neurone si ottiene l'espressione mirata di GFP in MN5. Noi non proponiamo di spiegare la tecnica del patch clamp stesso.
Protocol
La seguente descrizione non è specifico per un motoneurone. Esso può essere utilizzato con qualsiasi neurone. In questo esempio, usiamo il volo motoneuroni 5 (MN5) che innerva i due fibre dorsalmost del dorsolongitudinal muscolare ala depressore (DLM). Per identificare e visualizzare MN5 usiamo il UAS/GAL4 sistema per esprimere GFP nei motoneuroni di volo (e pochi altri neuroni).
1. Dissezione di adulti Drosophila per accedere alla parte dorsale del cordone nervoso ventrale (VNC)
- Sezionare un lato adulto Drosophila dorsale lungo la sua linea mediana dorsale in una capsula rivestita Sylgard Petri (35 mm di diametro), come descritto in Ryglewski e Duch (2009 13). Un film di questa dissezione è disponibile online tramite JoVE (Boerner e Godenschwege 16. Di seguito una breve descrizione della dissezione.
- Mosche adulte sono anestetizzati mediante raffreddamento in ghiaccio per circa 1 min. Questo può essere ottenuto mediante pre-raffreddamento di un flacone fly vuoto (senza cibo)su ghiaccio e mettere la mosca nel flacone già freddo. Ali e le gambe vengono rimossi con un paio di forbici.
- La mosca viene quindi bloccato lato dorsale in una capsula rivestita Sylgard Petri (usiamo il coperchio di un piatto 35 millimetri Petri riempite fino all'orlo con Sylgard; figure 1A, B) con un anello di plastica (diametro interno 9 mm, spessore 1,3 mm ) incollata al Sylgard con etere di petrolio.
- L'uso del coperchio di un piatto 35 millimetri Petri facilita l'accesso al VNC con una pipetta cerotto sotto visualizzazione con una lente acqua immersione. Questo aiuta a introdurre la pipetta superficialmente senza toccare la parete del piatto.
- L'anello di plastica può essere fatta da un foro in un sottile (usiamo 1,3 mm di spessore) foglio di plastica. Usiamo una fresa a filo per definire il perimetro esterno dell'anello in modo che si adatti il piatto.
- Immergere la mosca in soluzione fisiologica (Figura 1C, la composizione di soluzione salina in mM: NaCl 128, KCl 2, CaCl 2 1.8, MgCl2 4, HEPES 5, saccarosio ~ 35 depending la osmolalità della soluzione; pH a 7,25 con 1 M NaOH, osmolalità è regolato a 290 mOsm con saccarosio).
- L'animale viene sezionato lungo la linea mediana dorsale, e le grandi muscoli dorsali volo longitudinali sono allungati lateralmente e appuntato di esporre intestino, esofago, e la parte inferiore VNC. Dopo la rimozione del budello e l'esofago, il VNC è esposta (Figura 1D).
- Facoltativamente, la mosca può essere decapitato in questa fase (Figura 1E). Rimozione della testa rende l'accesso con l'enzima e pipette di patch più conveniente, e MN5 dendriti non sono disturbati durante la pulizia del soma (dendriti sono posteriori al soma, figure 2B, C). Tuttavia, la testa può anche essere lasciato intatto, se richiesto dal disegno sperimentale (ad esempio, lo studio di scendere ingresso motoneuroni toraciche). In questo caso la pipetta può essere introdotto dal posteriore o laterale (laterale, Figura 2A).
- Per una rapidascambio salina durante esperimenti il volume della camera di registrazione è minimizzato posizionando un anello di plastica (diametro interno 9 mm) intorno l'animale sezionato e incollaggio al piatto con etere di petrolio (figure 1A, B, volume della camera di registrazione è ~ 200 pl) .
- La preparazione è poi montato su un microscopio a fluorescenza fase montante fisso (usiamo Zeiss Axioskop 2 FS plus, Zeiss, Germania) e visualizzato con un elevato NA (> 0,75), a lunga distanza di lavoro (> 2 mm), l'obiettivo 40x immersione acqua. Il sistema di perfusione (salina-in, soluzione salina-out), il filo di terra e la pipetta enzima vengono inseriti nella camera di registrazione (figure 1F - J, L).
2. Visualizzazione delle MN5 (vedi figure 2 e 3), Head Off
- Montare la piastra di Petri con un microscopio a fase montante fisso epifluorescente.
- Posizionare il piatto con la mosca in modo che la parte anteriore rivolta verso il lato dove il portaelettrodo èmontato (Figura 1).
- Utilizzare un elevato ingrandimento (40x o superiore), ad alta lente acqua immersione NA (NA 0,75 o superiore) e un filtro GFP per illuminare il VNC. Per una buona visualizzazione della cella durante la pulizia si usa acqua 40x immersione lenti con una NA di entrambi 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW), o una NA di 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). Per un buon accesso con la pipetta di patch la distanza di lavoro deve essere di 2 mm o maggiore.
- Entrambi MN5 si trovano nella neuromere mesothoracic sulla superficie dorsale del ganglio vicino alla linea mediana tra - ed eventualmente parzialmente coperto da - trachea prominente (figure 2 e 3). MN5 con i loro dendriti appaiono come una zona verde diffuso. Il somata diventano più distinti dopo la pulizia. Tuttavia, le loro dendriti non risulteranno nitidi ma rimangono sfocate poiché esse continuano ad essere coperte da tessuto (figure 2A, B).
- Nella nostra configurazione usiamo un HBO 100 sorgente di fluorescenza luce in cui non si può modficare l'intensità della luce di uscita. Usiamo filtri a densità neutra per evitare la sovraesposizione del tessuto per troppa luce fluorescente, la luce blu in particolare. Ciò può causare danni foto e alla fine uccidere le cellule. Usiamo densità neutra di 0,8. Nessun imbianchimento dovrebbe avvenire nel corso della procedura di pulizia. Se si verifica lo sbiancamento, molto probabilmente l'emissione di luce è troppo forte. La cella è danneggiata foto.
- Se l'illuminazione LED è usato le impostazioni di intensità dovrà essere determinata dallo sperimentatore. Candeggio è un segno di fotodanneggiamento e deve essere evitato.
3. Metodo alternativo per la visualizzazione di MN5
Per la nostra applicazione è importante avere la cella etichettata, per esempio con l'espressione mirata di GFP. In alternativa, DiI, un colorante lipofilo, può essere usato per etichettare retrograda questo neurone. In questo caso i cristalli di colorante vengono inseriti nel muscolo pilotaggio tramite un perno minutien insetto, e la ferita viene chiusa con UV la colla.
- Ottenere una soluzione stock DiI sciogliendo un paio di cristalli di Dii (nessun importo specifico) in 100 microlitri di etanolo al 70%. Questa soluzione si conserva a -20 ° C fino a esaurimento. Congelamento e scongelamento ripetuti non è un problema.
- 5 microlitri della soluzione vengono poi pipettati su un vetrino trattato. Attendere che l'etanolo è evaporato. Questo richiede solo pochi minuti.
- Posizionare una mosca in un pre-raffreddata flacone (da attaccare in ghiaccio) e freddo per un breve periodo di tempo (inferiore a 1 min) su ghiaccio. Posizionare la mosca freddo anestetizzato su una piastra di raffreddamento allo stereomicroscopio dissezione.
- Centro al volo e tenerlo in posizione in modo che non può essere messo da parte facilmente quando viene infilò con un perno minutien.
- Utilizzare due pinze, una per tenere il perno minutien, l'altra per tenere il volo verso il basso.
- Utilizzare pinze grossolane per tenere un perno insetto minutien e graffiare alcuni dei DiI dal vetrino in modo che vi sia un cristallo DiI sulla punta del perno minutien (usando l'vetrino stesso e il luogo stesso su quella copertina scivolare ogni volta aiuta ad ottenere più di colorante sul pin ogni volta che viene eseguita la procedura). Il perno non dovrebbe essere troppo appuntito, potrebbe piegarsi più facilmente ed è quindi difficile da usare.
- Poi puntura un buco in mezzo torace dorsale della mosca con il perno minutien con DiI sulla punta. Le due fibre muscolari del muscolo dorsalmost volo dorsolongitudinal (DLM, fibre muscolari 5 e 6 per ogni lato) sono innervati dal MN5. Pertanto, ponendo cristalli colorante nel mezzo del torace assicura che sia MN5 sarà etichettato perché sia fibre muscolari 6 del DLM sarà danneggiato e ottenere qualche colorante.
- Il colorante deve essere posizionato direttamente sotto la cuticola. Se il colorante viene inserito troppo in profondità, la mosca può essere accoltellato o di altri neuroni (ad esempio MN1-4) potrebbe essere etichettato come bene.
- Questo si ripete fino colorante sufficiente (questa è una questione di pratica ed esperienza) viene inserito nel torace
- DiI non è SOLUB acquale, quindi non si dissolverà nel citosol del muscolo e dovrà essere "farcito" sotto la cuticola.
- Poi un altro pin minutien viene immerso in una goccia di colla UV (poniamo una goccia di colla in una barca di pesatura).
- La colla che è ora sulla punta del perno minutien viene utilizzato per chiudere la ferita in cui sono stati inseriti i cristalli tintura.
- Dopo l'applicazione della colla (solo un po 'per chiudere la ferita non, il torace intero) una pistola UV è utilizzata per curare la colla. Usiamo due intervalli di 10 s di esposizione alla luce UV.
- Le mosche trattate vengono messe in cibo fresco in un flaconcino mosca. Assicurarsi che il punto di colla sul torace delle mosche non si attacca alle pareti della fiala che intrappola la mosca.
- Il colorante deve poche ore per raggiungere il neurone bersaglio. Viaggia lungo la membrana, non nel citosol poiché è liposolubile. Trattiamo gli animali nel pomeriggio e lasciare loro durante la notte.
- Esperimenti di patch clamp sono effettuate il giorno successivo. I neuroni saranno meno visibili rispetto all'uso di GFP geneticamente espresso.
4. Preparazione della pipetta enzimatico che è utilizzato per la pulizia
È importante assicurare un flusso costante di soluzione salina attraverso la camera di registrazione. Avente l'aumento di volume vasca e caduta deve essere evitata in quanto provoca vibrazioni e compensare eventuali cambiamenti durante gli esperimenti. Perfusione e di aspirazione devono essere impostati di conseguenza. Questo rende molto più facile scambio soluzione, che a sua volta è importante per lavare rapida su proteasi prima dell'esperimento e rapido scambio di agenti farmacologici durante l'esperimento.
- Assicurare perfusione della camera di registrazione (portata a circa 2 ml al minuto). Portata può essere regolata mediante l'utilizzo di un rubinetto o utilizzando tubi diametro specifico (maggiore è il diametro, maggiore è la velocità di flusso). Hanno il volume della camera più piccola possibile per garantire lo scambio rapido della soluzione in the camera. Questo assicura una rimozione veloce delle proteasi e bloccanti della camera di registrazione.
- Il volume della camera dipende da come la soluzione salina-out (Figura 1) del sistema di perfusione è inserito nella camera di registrazione (quando l'obiettivo ad immersione acqua viene abbassato nel bagno).
- Accertarsi che la soluzione salina-out è posizionato in modo che il titolo del la camera di registrazione non aumentare e diminuire costantemente (aspirazione, aumento, aspirazione, aumento), ma rimane costante (aspirazione stazionario). Determiniamo perfusione costante e stabile dalla costante, mai interrotta suono gorgogliante che viene prodotta da succhiare costantemente salina dalla vasca.
- Come soluzione salina-in e-out usiamo aghi ipodermici che sono piegate e fissato tubazioni strette e posto vicino alla camera di registrazione utilizzando plastilina (Figura 1F).
- Tirare una pipetta di patch e rompere la punta un po 'sotto controllo visivo. Utilizzare belle pinza pulita. Quando la visualizzazione unde pipettar la lente 40x immersione in acqua il diametro punta della pipetta dovrebbe essere approssimativamente tra 40 e 70% del diametro soma della cellula. Punte molto grandi (circa cella diametro uguale o maggiore) può anche essere utilizzato, tuttavia, la probabilità di strappo dal corpo cellulare aumenta a causa delle forze capillari della pipetta. La pipetta è molto piccolo (meno del 10% del diametro soma), si intasa facilmente che si traduce nel dover utilizzare uno o più pipetta fresca (s) durante la procedura di pulizia.
- Riempire la pipetta con il 2% in tampone PBS proteasi o soluzione salina senza intasamento esso.
- Inserire la pipetta enzima nel supporto elettrodo. Per assicurare un adeguato controllo della pressione applicata, il supporto deve essere ermeticamente chiusi.
- Collegare un tubo all'uscita piccola pipetta sul supporto e fissarlo in modo che tirando l'estremità libera del tubo non influenza la pipetta che è stato inserito nel supporto pipetta. Controllare il movimento sotto il microscopio.
- Inserire sia un p di plastica ipette punta (del tipo che viene utilizzato con un pipettatore automatico, usiamo il blu 1000 quelli pl, ma questa è una questione di preferenza. Altre misure possono essere usati pure) o una siringa con un rubinetto nell'estremità libera del tubo essere in grado di esercitare una pressione positiva e negativa per l'enzima / patch pipetta. Pressione positiva viene applicata da una soffiando nella punta della pipetta (usando come un boccaglio) o spingendo la siringa. Pressione negativa è applicata mediante aspirazione (con la bocca con il pezzo di bocca) o estraendo la siringa.
- Lo scopo delle applicazioni di pressione positiva e negativa è svitare e rimuovere le cellule e detriti che circonda le cellule in esame. Pressione positiva espelle enzima dalla pipetta pulitura e scarico detriti dalla superficie del SNC. Pressione negativa viene utilizzato per aspirare i detriti fuori VNC (come un aspirapolvere).
5. Pulizia di GFP-tagged MN5 (figura 3 e Video)
contenuto "> Nota per il lettore: Immagini di MN5 prima e dopo la pulizia sono difficili da distinguere nella figura 3 Questo è quello che si ottiene nella vita reale Ci vorrà un po 'di formazione per imparare a distinguere le sottili differenze tra puliti e non puliti.. neuroni. Si noti che tali differenze sottili può essere visto meglio in immagini in movimento. Pertanto, il film fornisce un'impressione migliore rispetto alle immagini statiche (Figura 3).- Visualizza l'enzima riempito pipetta sotto la lente d'acqua 40x immersione con luce (Figura 3B, freccia bianca).
- Focus sulla punta della pipetta. Se è intasato, cercare di ottenere lo sporco mediante l'applicazione di una pressione positiva o negativa. Se lo sporco non esce, preparare un nuovo enzima riempito pipetta.
- Passa alla luce fluorescente (Figura 3A).
- Abbassare la pipetta enzima attenzione e ricentrare finché il corpo cellulare può essere visto.
- Quando la pipetta enzima è vicino alcorpo cellulare, spegnere la perfusione off.
- Applicare pressione positiva in brevi verso il corpo cellulare in modo che tutto ciò che ostacola l'accesso alla cella verrà allentate. Questo deve essere fatto finché il tessuto che circonda il corpo della cella di allentamento.
- Anche spostare la pipetta enzima dorsalmente per la cattura detriti che può essere a sinistra-over dalla guaina gangliare che circonda il VNC. Potrebbe essere stato rimosso dalla dissezione già prima del montaggio della preparazione sul microscopio (questo non è sempre il caso).
- Alternata con applicazione di pressione positiva e negativa, utilizzare la pipetta enzima come un aspirapolvere e vuoto intorno al corpo cellulare. Non è necessario allentare il corpo cellulare completamente. Pulire la parte anteriore del soma farà (o la parte posteriore o laterale a seconda che parte dalla pipetta avvicina al soma).
- Questa procedura di pulizia viene eseguita fino a quando la membrana sembra privo di detriti.
- La membrane è pulito quando non c'è "ombra" o contrasto diffusa tra cellula e il tessuto circostante se visto con la luce fluorescente solo. Questo può essere visto meglio con luce blu ad alta intensità. Di conseguenza, aumentare la luminosità per un momento (togliamo i filtri a densità neutra per conseguire tale). Si noti che vasta esposizione alla luce blu, come previsto da una normale lampadina da 100 HBO mercurio può causare danni foto nel giro di circa un minuto. Ciò comporterà il segnale GFP a svanire come le cellule muoiono.
- Passare ad una luce forte e rimuovere le cellule e detriti che non poteva essere visto con luce fluorescente. Si noti che la visualizzazione della trachea e lo stato di pulizia possono trarre beneficio dal passaggio tra la luce e la luce fluorescente.
- Quando la procedura di pulizia è finito e il corpo cellulare appare pulita, commutare il sistema di perfusione indietro (fare anche se la procedura di pulizia richiede più di 3 a 5 minuti e continuare la pulizia con perfusione costante) e la luce spenta.
- Sciacquare il fo cellar ~ 15 a 20 minuti con soluzione salina o la soluzione che verrà utilizzato per la seguente applicazione. Non meno di 40 ml deve passare attraverso la camera di registrazione per essere sicuri che la proteasi è lavato fuori. Resti della proteasi sulla superficie delle cellule provoca la morte improvvisa delle cellule durante le registrazioni di patch clamp altrimenti stabili.
6. Elettrofisiologia
- Convenzionale in situ di patch clamp intera cella in voltage clamp e modalità morsetto corrente viene condotta utilizzando un amplificatore Axopatch 200B (Molecular Devices, USA); segnali vengono digitalizzati utilizzando un Digidata 1320 (Molecular Devices, USA) e analizzati con software pClamp 10,2.
- Pipette patch vengono estratti da vetro borosilicato capillari con una pipetta estrattore verticale (Narishige, PC-10).
- Pipette resistenze punta sono comprese tra 5,8 e 6,2 MW (pinza di corrente e di potassio registrazioni correnti) e tra 2,8 e 3,5 MW (per le registrazioni di calcio in corso), rispettivamente. Resistenza punta dipendesoluzioni intra-ed extracellulari utilizzato (per i dettagli cfr 13, 14).
7. Risultati rappresentativi
Dopo la procedura di pulizia sia MN5 sono pronti per in situ di patch clamp intera cella (Figura 3). La sezione seguente mostra clamp rappresentante di tensione e corrente con la pinza da tracce registrate da soma MN5 dopo aver utilizzato la procedura di pulizia descritta. MN5 esprime una varietà di canali ionici voltaggio gated (vedi anche 13,14). Mostriamo un esempio di tensione correnti di calcio gated (Figura 4), tensione correnti gated potassio (Figura 5) e le tracce del potenziale d'azione (Figura 6). Tensione di calcio recintato e correnti di potassio sono stati evocati da protocolli di tensione simili, ma le soluzioni che sono state utilizzate diverse al fine di consentire solo i canali ionici in esame per passare la corrente (per i dettagli vedi 13,14). Tutti gli altri principali ioni ch tensione gatedannels sono state bloccate (tensione canali del sodio voltaggio con 100 nM tetrototoxin - pipettati direttamente nella vasca da bagno, la perfusione è stato fermato per due minuti - canali del calcio con 500 cadmiumchloride pM, canali di potassio con 2 mM a 4 aminopyridin (4-AP) e 30 mM tetraethylammoniumchloride mM extracellulare e 0,5 4-AP, 20 tetraethylammoniumbromide mM e 144 mM cesiumchloride intracellulare attraverso la soluzione cerotto intracellulare nella pipetta patch (per i dettagli vedi 13,14). tracce potenziali d'azione sono stati evocati da iniezione di corrente nel soma MN5 (Figura 6) senza l'utilizzo di alcun bloccanti dei canali ionici 12.
Figura 1. L'installazione di pulizia. La mosca viene immobilizzato in un coperchio Sylgard rivestito di un piatto 35 millimetri Petri in cui abbiamo incollato un anello di plastica (diametro interno 9 mm, spessore 1,3 mm) with petrolato (A, B). Dopo sommergendo la mosca in soluzione salina (C) si apre lungo la linea mediana dorsale. Intestinale e dell'esofago vengono rimosse per esporre il cavo ventrale nervo (D). Per una migliore accessibilità del neuromere toracica la testa viene rimossa (E). Dopo il montaggio del preparato su un microscopio a epifluorescenza verticale, il sistema di perfusione (F, G, soluzione salina, soluzione salina-in-out, frecce bianche a sinistra) e il filo di terra vengono portati in posizione (F, G, freccia bianca destra). L'enzima riempito pulizia pipetta viene portata in posizione dopo l'immersione in acqua obiettivo (40x, NA 0,8) è stata abbassata nel bagno (H). Per chiarezza facciamo vedere già prima che l'obiettivo è stato abbassato (F, G, freccia bianca a destra). L'angolo al quale la pipetta enzima che è tenuto da un supporto 1-HL-U elettrodo (J) è di entrare nella camera di registrazione è importante in quanto la pipetta non deve toccare l'obiettivo e l'anello di plastica. Questo angolo varia da configurazione a configurazione. Qui è circa 30 ° (vedi disegno in J, freccia in K). La disposizione della pipetta nel supporto è attaccato ad una headstage è mostrata in (L). Il headstage è collegato a un micromanipolatore motorizzato. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. MN5 nel cordone nervoso ventrale. MN5 può essere facilmente identificato dalla sua posizione nel cordone nervoso ventrale Drosophila (VNC) quando GFP è geneticamente espresso dall'uso del motoneurone specifici GAL4 driver (A). Il rettangolo tratteggiato rappresenta il neuromere toracica. Per avere un'idea di come le dimensioni in relazione tra loro, che mostrano una pipetta cerotto pulizia avvicina sinistra MN5 dal lato sinistro del muscolo volo dorsolongitudinal. Per una migliore visualizzazione, la pipetta patch è stata riempita con un colorante rosso (destrano-tetrametilrodamina, A). Il controlateraleerally sporgente MN5 si trovano sulla superficie dorsale della neuromere mesothoracic del VNC su ciascun lato della linea mediana (proiezione di una pila immagine confocale in B). Il ipsilaterale sporgente MN1-4 si trovano più lateralmente ed anteriormente relativa a MN5 (frecce B). Il cerchio tratteggiata tra due MN5 raffigura i dendriti dei motoneuroni di volo nel neuropilo compreso MN5 (B). Etichetta GFP in (B) è stata migliorata mediante colorazione immunoistochimica con un anticorpo contro GFP. Dettagli di MN5 morfologia sono resi visibili riempiendo il neurone intracellulare (iontophoretically) con l'invisibile tracciante neurobiotin e successiva acquisizione immagine confocale (C). La colorazione è stata resa visibile con streptavidina accoppiata ad un fluoroforo. Barra di scala è di 30 micron.
Figura 3. MN5 pulizia prima e dopo. Visualizzazione di MN5 si ottiene l'espressione di GFP con il UAS/GAL4sistema (A, C, vedere etichetta). MN5 prima (A, B) e dopo (C, D) la procedura di pulizia. Lato sinistro di ogni immagine rappresenta anteriore, lato destro rappresenta posteriore. I neuroni per registrare da si puliscono con una pipetta proteasi pieno di patch con una punta rotta. La pipetta enzima è solo debolmente visibile (A, B, vedere etichetta). Un inserto in mostra un ingrandimento inferiore MN5 con la pipetta enzima avvicinando alla cella. MN5 non può essere visto in luce prima che la procedura di pulizia (B). Trachea devono essere rimossi se riguardano le cellule in esame. Dopo la procedura di pulizia, il contrasto tra cellula e tessuto circostante è più fresco (C, basso MN5), e la cellula può essere visto in luce (D). La punta della pipetta può essere visto più chiaramente quando la luce viene utilizzato. L'allargamento rappresenta l'area in piazza costellata di MN5 bordi corpo cellulare circondato da una linea tratteggiata per una migliore identificazione. Visualizzazione in piena luce spesso aiuta a giudizio di pulizia.
Figura 4. Calcio corrente in MN5. Esempio di registrazione di correnti di calcio cellule intere come registrato dal MN5. Almeno due differenti correnti di calcio sono presenti, una bassa tensione di calcio attivato transiente di calcio e una costante corrente ad alta tensione. Le correnti sono stati evocati da un potenziale di mantenimento di -90 mV. Gradini di tensione da -90 mV a 20 mV sono stati applicati. Bloccanti sono stati utilizzati per bloccare i canali ionici maggior parte degli altri. Manufatti sono stati omessi per chiarezza (per la caratterizzazione delle correnti di calcio MN5 vedere Ryglewski et al., 2012).
Figura 5. Correnti di potassio in MN5. Esempio di registrazione delle correnti intere potassio cellulari come registrati dalla MN5. Correnti indicati sono comprensivi di calcio correnti attivati potassio in quanto non bloccanti dei canali del calcio sono stati applicati. Le correnti sono stati evocati da un'aziendapotenziale di -90 mV per il potassio totale corrente (A) o da un potenziale di mantenimento di -20 mV per inattivare transitori correnti di potassio e mostrano solo il potassio sostenuta corrente (B). Passi di tensione da -90 mV a +20 mV sono stati applicati incrementi di 10 mV. Sottrazione linea di correnti di potassio come evocato da un potenziale di mantenimento di -90 mV (A) e -20 mV (B) rivelano puri correnti di potassio transitorie (C). Tensione canali del sodio voltaggio sono stati bloccati. Gli artefatti sono stati omessi per chiarezza (per la caratterizzazione di MN5 tensione e correnti di potassio calcio e vedere Ryglewski Duch, 2009).
Figura 6. Sparare modello esibito da MN5. Esempio di registrazione di sparare modelli come raggiunta in MN5 da iniezioni somatiche attuali (0.4 nA, nero, 0,5 nA, grigio) di 200 ms durata. Potenziale di membrana a riposo è -59 mV. Nessun bloccanti dei canali ionici sono stati utilizzati. (Per analisi morsetto corrente di MN5 cotturamodelli vedere Duch et al., 2008).
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Discussion
Quando visualizzare le cellule con proteine fluorescenti come la GFP, è importante non sovraesporre la preparazione di troppa luce. Ciò può causare danni foto. Usiamo 100W HBO brevi lampade al mercurio ad arco per l'illuminazione, e si usa anche densità neutra (ND) di 0,8 (filtri ND Chroma 0.3 e 0.5). Per poter valutare la qualità della pulizia buona visibilità è cruciale. Pertanto, filtri ND può essere rimosso per brevi periodi di circa 20 s per più volte.
Quando si applica un po 'di pressione positiva, il corpo cellulare "flap" un po'. Questo aiuta a giudicare la qualità della pulizia. Nel contrasto cordone nervoso ventrale è molto basso, e il movimento può essere estremamente utile per visualizzare le cellule. Il portaelettrodo che viene utilizzato per la procedura di pulizia (e anche per cerotto bloccaggio) deve essere ben sigillato; applicazione di pressione controllata altrimenti non sarà possibile. Perdere pressione disturbare la rimozione di successo di tessuto e debris e impedisce la formazione di giga-seal
Nel caso in situ registrazioni patch clamp è effettuata dopo la pulizia della cella, tenere presente che non c'è solo una guaina che circonda il midollo ventrale nervo nel suo complesso (che deve essere rimosso per qualsiasi registrazione patch clamp su qualsiasi neurone centrale di mosche adulte ), ma le cellule stesse può essere circondato da una guaina pure. MN5, per esempio, è circondato da una guaina non cellulare che può essere visto solo con brevi illuminazione ad alta intensità. Inoltre, le cellule possono essere situato sotto la trachea. Nel caso la cella non è possibile accedere, la trachea devono essere prese da parte se non strappato con la pipetta durante la procedura di pulizia (dopo essere stato tirato da parte). L'intera procedura di pulizia deve essere fatto senza tirare il tessuto troppo. Questa procedura richiede una formazione. La migliore è la pulizia, maggiore sarà la frequenza di immediate giga-guarnizioni (entro 1 s dopo aver toccato la cella e relallentamento della pressione positiva).
A seconda del protocollo di pulizia e la rottura nei seguenti scenari sono possibili: Primo, se le celle non sono stati puliti abbastanza bene, un giga-sigillo non è possibile e l'esperimento deve essere terminato. In secondo luogo, in alcuni casi, la pulizia è abbastanza buono per giga-sigillo formazione ma un sottile residuo difficilmente visibile della guaina rimane intorno al soma. Questo farà sì che la membrana di rottura e causare correnti di fuga di diverse ampiezze. Una conseguenza meno grave di pulizia della cella insufficiente è che alcuni residui della causa guaina aumenta in resistenza accesso. A seconda dei criteri di qualità di progettazione sperimentali differenti per la patch potrebbe applicarsi. Per monitorare modelli di azione potenziali morsetto corrente del potenziale di membrana della cellula deve essere sano (-55 mV o più iperpolarizzato nel caso di MN5), ma la resistenza di accesso non è una questione importante. Tuttavia, quando evocando potenziali d'azione dal re di accesso corrente di iniezioneresistenza diventa un problema. Per evocare grandi correnti di potassio ampiezza che originano vicino al sito di registrazione della perdita dovrebbe essere piccola (nel caso di MN5 resistenza di ingresso mosto superiore a 80 MW) e resistenza accesso non dovrebbe essere maggiore di 15 MW. Per il morsetto spazio necessario in registrazioni voltage clamp di piccole correnti di ampiezza dendritiche calcio che hanno origine piuttosto distante dal soma nessuna perdita può essere introdotto (per MN5 resistenza di ingresso deve essere superiore a 120 MW) e la resistenza di accesso non può essere superiore a 12 MW. Nella maggior parte delle registrazioni si misura correnti di calcio con le resistenze di accesso tra 8 e 10 MW (come letto dalla manopola dell'amplificatore axopatch 200B dopo resistenza in serie e tutta compensazione capacità della cella). Per ciascun tipo di cellula da registrare, i criteri di qualità devono essere determinati singolarmente.
Utilizzando la procedura di pulizia descritta qui, siamo in grado di tenere le registrazioni stabili per ravvicinamentotamente 90 minuti. Noi non osserviamo una notevole run-down (in particolare testati per CAV2 e Cav3 correnti di calcio e per Shaker, Shal, e ritardi correnti di potassio raddrizzatore). Tuttavia, non abbiamo cercato di tenere il cerotto più a lungo e quindi non può precisare se registrazioni più lunghe sarebbe possibile.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
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