Summary
Apresenta-se um método de citometria de fluxo com base para examinar o desenvolvimento das células T
Abstract
Um sistema imunitário saudável requer que as células T respondem a antigénios estranhos, permanecendo tolerante para auto-antígenos. Rearranjo aleatório do receptor de células T (TCR) e loci α β gera um repertório de células T com grande diversidade de especificidade antigénica, tanto a auto-e estrangeiras. A selecção do repertório durante o desenvolvimento do timo é crítico para a geração segura e úteis células T. Defeitos de selecção tímica contribuir para o desenvolvimento de doenças auto-imunes e da imunodeficiência 1-4.
Progenitores de células T do timo entrar como duplamente negativos (DN) timócitos que não expressam CD4 ou CD8 co-receptores. Expressão da αβTCR e ambos os co-receptores ocorre na fase dupla (DP) positivo. Interacção do αβTCR com auto-péptido-MHC (pMHC) apresentado pelas células do timo determina o destino do timócito DP. Interações de alta afinidade levar a seleção negativa e eliminaçãoção de auto-reactivos timócitos. Baixa afinidade interacções resultam na selecção positiva e desenvolvimento de CD4 ou CD8 positivas únicas células (SP) T capazes de reconhecer antigénios estranhos apresentados pelo MHC próprio 5.
Selecção positiva pode ser estudada em ratinhos com um anticorpo policlonal repertório de TCR (tipo selvagem), observando a geração de células T maduras. No entanto, eles não são ideais para o estudo de selecção negativa, o que envolve a eliminação de pequenas populações específicas de antigénio. Muitos sistemas de modelos têm sido utilizados para estudar a selecção negativa, mas variam na sua capacidade para recapitular eventos fisiológicos 6. Por exemplo, a estimulação in vitro de timócitos falta o ambiente do timo, que está intimamente envolvido na selecção, ao passo que a administração de antigénio exógeno pode levar à supressão não específica de timócitos 7-9. Atualmente, as melhores ferramentas para estudar na seleção negativa vivo são ratos que expressam uma transgenic específica TCR para endógena antígeno próprio. No entanto, muitos modelos clássicos TCR transgénicos são caracterizados pela expressão prematura da cadeia TCRα transgénico no estádio de DN, resultando em prematuro de selecção negativa. O nosso laboratório desenvolveu o HY modelo CD4, no qual a transgénico HY TCRα condicionalmente está expresso na fase de DP, permitindo a selecção negativa para ocorrer durante a transição para DP SP como ocorre em ratinhos de tipo selvagem 10.
Aqui, nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base em examinar selecção positiva e negativa do timo no modelo do rato HY CD4. Enquanto a selecção negativa nos ratos CD4 HY é altamente fisiológico, estes métodos podem também ser aplicados a outros modelos de TCR transgénicas. Nós também irá apresentar as estratégias gerais para a análise de seleção positiva em um repertório policlonal aplicáveis a quaisquer camundongos geneticamente manipulados.
Protocol
Consulte a Figura 1 para um esquema geral do protocolo experimental.
1. Dissecação
- Coloque tela de malha de aço estéril em 60 15 mm x placa de Petri. Uma unidade é necessária por amostra de tecido.
- Adicionar 5 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para cada prato. Mantenha pratos no gelo.
- Euthanize ratos com CO 2.
- Rato seguro para a superfície, dissecção lado ventral para cima. Pulverização do rato com etanol a 70% para a esterilização e para assegurar que a pele é opaco para baixo.
- Utilizando uma tesoura cirúrgica, dissecção começar por fazer uma incisão ventral na pele abdominal acima da genitália. Estender para cima da incisão para o queixo.
- A partir da linha média, estender a incisão para baixo ao longo de todos os membros. Puxe a pele solta e fixá-lo para a superfície dissecção.
- Colheita do timo:
- Levante a ponta inferior do esterno para fazer uma incisão.
- Evitando o fígado, o diafragma cortado para separar a caixa torácica e depois cortar a caixa torácica para cada lado. Corte as costelas para cima em cada lado, tendo o cuidado de evitar os pulmões eo coração.
- Com cuidado, puxe a parte de trás da caixa torácica com uma pinça. O timo é um órgão, branco bilobado localizado acima do coração. Usando a ponta plana do fórceps para agarrar o fundo dos lobos, puxe o timo e colocá-lo na tela de malha.
- Colher o baço:
- O baço é um vermelho, o órgão em forma de prancha de surf localizada no lado esquerdo da cavidade abdominal do rato, abaixo do fígado.
- Fazer uma incisão na cavidade abdominal. Retire cuidadosamente o baço com um par de fórceps, usando o segundo par de provocar o tecido conjuntivo. Coloque o baço em uma tela de malha separada.
2. Preparação de células
- Usando um êmbolo de uma seringa de 3 ml, moerórgãos para a tela de malha até que o tecido conjuntivo e apenas restos de gordura. Lavar malha com HBSS do prato três vezes. Usar um êmbolo para cada amostra de tecido.
- Outras opções para a homogeneização do tecido pode ser usado em lugar deste método.
- Contar as células utilizando um hemocitómetro.
- Células de pelotas por centrifugação a 335 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Esplenócitos Ressuspender em 500 ul de tampão de lise ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) durante 10 min à temperatura ambiente. Timócitos Ressuspender em 20 x 10 6 células / ml em tampão FACS (PBS, 1% de FCS, 0,02% de azida de sódio) e de lado em gelo.
- Retornar esplenócitos de isotonicidade pela adição de 5 ml de HBSS. Esplenócitos de pelotas por centrifugação e ressuspender em 20 x 10 6 células / ml em tampão de FACS. Se as células precisam permanecer estéril, você pode usar estéril RPMI + FCS 10%.
3.Células coradas para citometria de fluxo
O objectivo deste protocolo é traçar estratégias para a análise de seleção positiva e negativa utilizando tipo selvagem (WT) e camundongos CD4 HY. Para considerações gerais sobre a citometria de fluxo experimental design, aquisição, análise e, nos referimos aos leitores uma excelente revisão por Tung et al. 11
- Alíquota de 4 x 10 6 timócitos por exemplo citometria de fluxo para cada cavidade de uma placa de 96 poços, bem como 1 x 10 6 por esplenócitos WT controlo de compensação. Se usar camundongos transgênicos, você deve incluir um mouse como controle WT em sua experiência.
- Bloquear os receptores Fc, por incubação com células anti-CD16/32 (clone 2.4G2) durante 10 min em gelo.
- Girar em placas a 335 xg a 4 ° C durante 5 min. Retire a tampa e dissipar líquido de poços mexendo na placa de uma vez, de bruços em uma pia. Ressuspender a cada poço em 200 ul de tampão de FACS. Repetir a lavagem.
- Preparar cocktails de anticorpo tal como enumeradas a seguir, utilizando a concentração óptima de cada anticorpo com base na diluição de 200 ul de tampão de FACS por poço. A concentração óptima de cada um dos anticorpos é definido como a concentração mínima necessária para se obter a maior separação de populações positivas e negativas. Se não houver uma população negativa para um dado anticorpo, um anticorpo isotipo devem ser incluídas. O volume total por poço pode ser reduzida (por exemplo, a 100 ul por poço), se desejado.
- WT timo: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
- CD4: HY timo anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 ou anti-CD5, anti-CD24
Para obter uma melhor separação entre a CD69 e CD69 eis em populações hi timócitos, recomenda-se que um anticorpo biotinilado anti-CD69 primário ser utilizado, seguido de uma mancha secundária contendo estreptavidina conjugada com fluorocromo. Nós use a mesma estratégia para CD5 coloração.
- Incubar as células com 200 uL de mistura de anticorpos em tampão de SCAF, durante 30 minutos em gelo no escuro.
- Concomitante com coloração coquetel de anticorpos, cada mancha controlo de compensação com um anticorpo conjugado com fluorocromo único. Idealmente, a coloração compensação envolve os mesmos anticorpos, usado no cocktail de anticorpos. No entanto, a coloração para cada antigénio individual pode não ser praticável para experiências maiores quando muitos antigénios estão a ser ensaiados. Por isso, tanto para a coloração anti-CD4 ou anti-CD8 é recomendado devido à elevada expressão destes antigénios, ou a utilização de esferas de compensação. Mancha em tampão de FACS durante 30 minutos em gelo no escuro. Deixe um controle de compensação imaculada.
- Lave as células duas vezes com tampão FACS.
- Ressuspender as células em tampão de SCAF e transferência para tubos de FACS.
- Adquirir amostras no citômetro de fluxo. Incluem a aquisição de FSC-A e FSC-W para umGUARDE para a discriminação gibão.
4. Análise de citometria de fluxo de dados - Ratos não transgénicos TCR
Usamos FlowJo para a análise de dados de citometria de fluxo. Consulte a Figura 2A para a estratégia de propagação para os ratos não-transgênicos TCR.
- Usando FSC-A por SSC, portão eletrônico sobre a população "linfócitos".
- Dentro da população "linfócitos", use FSC-A pelo FSC-W para eletronicamente população portão eis FSC-W para excluir doublets celulares e aggregrates. Este é o "singleto" portão.
- Usando os eventos no "singlet" portão, lote CD8 por CD4. Desenhe portas para DN, maçante DP, brilhante DP, CD4 + CD8 populações eis CD4SP e CD8SP conforme ilustrado na figura 2B.
- Sob os portões e CD4SP CD8SP, criar TCRβ por CD24 parcelas. Utilize a ferramenta gating quadrante para desenhar portas como mostrado na Figura 2C.
- Criar um new enredo da "singlet" porta: TCRβ por CD69. Desenhar portas A, B, C, D, conforme ilustrado na Figura 2D.
- Criar outra trama do "singlet" porta: TCRβ por CD5. Desenhar portões i, ii, iii, iv, como representado na Figura 2E. Esta é uma outra estratégia para a análise de selecção positiva.
- Aplicar DN, DP opaca, DP brilhante, int CD4, CD4SP e CD8SP portões de debaixo "singleto" para portões i, ii, iii, iv A, B, C, D (Figura 2D, E).
- Calcule o número de células em um subconjunto específico multiplicando celularidade órgão pela freqüência de cada portão posterior até chegar ao seu público-alvo. Por exemplo, o número de TCRβ CD69 hi-CD8SP timócitos seria determinado por timo celularidade x% TCR bhi CD69-(fracção D) x CD8SP%.
- Contando já leva em conta as células vivas e mortas para que não incluem o lymphoc "gate "YTE nos seus cálculos.
5. Análise de dados de citometria de fluxo - TCR transgênico Ratos
Consulte a Figura 3A para a estratégia de gating para camundongos transgênicos TCR.
- Siga os passos 4.1 e 4.2 como na seção anterior.
- Sob o título "singleto" gate, criar um T3.70 por SSC trama e portão na T3.70 + população de células para análise de células T específicas de antigénio (Figura 3B). Em algumas circunstâncias, pode ser de interesse para comparar esta população para o antigénio não específico de população celular (T3.70) T.
- Dentro da população + T3.70, desenhar DN, DP, CD4SP e CD8SP portas (Figura 3C).
- Para as amostras controle WT, desenhar estas portas sob o "singlet" portão ou criar um T3.70 porta-uma vez que haverá muito poucos T3.70 + células.
- Sob o portão CD8SP, criar umT3.70 por CD24 trama. Use a ferramenta de propagação do quadrante para dividir as células em quatro populações (Figura 3F).
- Criar um histograma representando sobreposto expressão CD69 no compartimento DP de ratinhos WT e T3.70 + DP compartimento de camundongos CD4 HY (Figura 4A). Repetir para examinar a expressão CD5 (Figura 4B).
- Calcula-se o número absoluto de células em cada subconjunto de interesse como em 4.8.
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Representative Results
Em fisiológicas modelos TCR transgênicos e camundongos WT, a seleção positiva começa na fase DP brilhante antes de passar à fase DP aborrecido após encontro antígeno. Timócitos DP maçantes em seguida, digite um CD4 + fase de transição CD8 lo antes de se tornar CD4SP ou timócitos CD8SP (Figura 2B). Timócitos maduros SP são caracterizados pela expressão de TCR e da elevada perda de CD24 (Figura 2C). Enquanto o CD8 por CD4 perfil pode revelar defeitos na seleção positiva, examinando TCRβ por CD69 ou CD5 pode fornecer uma visão mais aprofundada em que o defeito se encontra. Tanto CD69 e CD5 são upregulated após estimulação TCR, com interacções mais fortes de condução maior expressão desses marcadores.
No TCRβ por CD69 trama, portão A (TCRβ eis CD69-) representa uma população de timócitos de pré-selecção DP, portão B (CD69 + TCRβ int) representa um transitional população diretamente após TCR engajamento, portão C (TCRβ oi CD69 +) representa a população de células diretamente seleção pós-positivo, e portão D (TCRβ oi CD69 -) representa uma população mais madura de células (Figura 2D). Em um rato WT, portão A é composta de células DP brilhantes, enquanto portão B consiste principalmente de DP brilhante com alguns maçante DP e CD4 + células CD8 Lo. Portão C consiste principalmente de DP maçante, CD4 + CD8 lo e células CD4SP, enquanto portão D consiste principalmente de CD4SP e CD8SP. Ausência de populações de B e C pode ser indicativo de selecção positiva prejudicada. Mudanças na proporção de CD4SP para dentro CD8SP população D pode sugerir alterações no compromisso linhagem. A perda de populações C e D podem reflectir questões de sobrevivência após a selecção positiva.
Examinando TCRβ por CD5 é outra estratégia de to identificar populações de selecção pré-e pós-positivo. I população (TCRβ eis CD5 lo) representa timócitos de pré-selecção de DP e ii população (TCRβ eis CD5 int) são células de iniciação de selecção positiva (Figura 2E). Estas populações consistem principalmente de timócitos DPbright. Iii população (TCRβ int CD5 oi) representa timócitos no processo de se submeter a selecção positiva e consistem principalmente de DP aborrecido e timócitos CD4 + CD8 eis. População iv (TCRβ oi oi CD5) consiste principalmente de pós-positivos timócitos SP seleção. Prejudicada geração de populações II e III sugere defeito seleção positiva. Mudanças na proporção de CD4SP para dentro CD8SP população iv apesar normais populações anteriores pode sugerir alterações no compromisso linhagem. Uma ausência de população iv pode indicar diminuição da sobrevida após seleção positivação. Por exemplo, em TOX - / - ratos, defeituoso diferenciação CD4SP conduz a uma redução drástica nas populações iv, C e D, enquanto a selecção positiva permanece intacta 12. Defeitos verdadeiros na selecção positiva pode ser visto com a inactivação Bcl11b durante a etapa de DP, o que leva a perda de populações B, C e D 13,14. RasGRP1 camundongos deficientes possuem um defeito no início de selecção positiva, o que resulta na presença de uma única população. (Dados não publicados)
Como a selecção negativa envolve a eliminação de pequenas populações específicas de antigénio, os defeitos deste processo são melhor observados utilizando ratinhos transgénicos TCR. Em camundongos CD4 HY, timócitos que exprimem a transgénico HY TCR pode ser detectada com o anticorpo monoclonal T3.70 (Figura 3B). O TCR reconhece o antígeno HY HY macho específico apresentado dentro de MHC classe ID b. Assim, CD4 HY macho (M) ratos submetidos a selecção negativa de TCR HY
Uma limitação dos modelos transgénicos TCR é que o TCR é expresso transgénico altamente durante todo o desenvolvimento dos timócitos. Como resultado, torna-se difícil para caracterizar ainda mais a selecção positiva, identificando populações com base na expressão de TCR e CD69/CD5. No entanto, CD69 e CD5 expressão se correlacionam com a força de TCR sinalização. Em ratinhos WT, a maioria dos timócitos DP não sofrem de selecção positiva ou negativa, que requer acoplamento de TCR pMHC, e, portanto, não sobrerregular CD69 ou CD5. HY ratos CD4 F têm uma grande população de timócitos T3.70 + DP que sofrem de selecção positiva, como indicado por um aumento na população de CD69 + em comparação com WT (Figura 4A). Selecção negativa envolve uma maior afinidade de TCR estímulo de selecção positiva, o que é indicado pelo aumento da expressão de CD69 em timócitos T3.70 + DP em ratos CD4 HY M, resultando em um desvio of pico do histograma para a direita. Tendências semelhantes são vistos com expressão CD5 (Figura 4B). Ao analisar seleção tímica em camundongos geneticamente manipulados, examinando CD69 ou CD5 expressão pode determinar se o defeito está com TCR sinalização ou um resultado a jusante da estimulação de TCR.
Figura 1. Esquema global do protocolo experimental.
Figura 2. Analisando selecção tímica em ratinhos não transgénicos TCR. (A) Gating estratégia de análise de selecção tímica em ratinhos não transgénicos TCR. (B) CD8 por CD4 de um perfil timo WT. (C) Examinando a maturidade de timócitos SP por TCRβ e CD24 expressão. (D) Etapas de selecção positiva pode ser distinguida pelaCD69 pela expressão TCRβ, juntamente com CD8 e CD4 de perfis em cada subconjunto. (E) TCRβ por CD5 é uma outra estratégia que pode ser utilizado para separar as fases de desenvolvimento. para ver figura maior .
Figura 3. Analisando selecção tímica em ratos CD4 HY. (A) a estratégia Gating para analisar seleção tímica em camundongos transgênicos TCR. (B) A frequência de timócitos que expressam a TCR HY (T3.70 +) no WT, CD4 HY HY F e M CD4 ratos. (C) por CD4 CD8 perfis da população + T3.70 em ratinhos indicadas. Além de frequências, o número absoluto de T3.70 + DP (D) e, especialmente, T3.70 CD8SP + (E) timócitos são indicadores importantes de selecção negativa. (F) Examinando amaturidade de timócitos CD8SP em camundongos indicados. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 4. Expressão dos marcadores de activação CD69 (A) e CD5 (B) em timócitos totais DP de WT e T3.70 timócitos + DP de HY F CD4 CD4 e HY M ratinhos.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado pode ser usado para examinar a selecção positiva e negativa, em não-transgénicos TCR e ratinhos transgénicos TCR. Este protocolo descreve a coloração de antigenes de superfície. Para uma análise mais aprofundada dos mecanismos moleculares, é muitas vezes necessário efectuar a coloração intracelular. Nós usamos o BD Biosciences Kit Cytofix / Cytoperm para a maioria das proteínas intracelulares e da BD Biosciences kit de coloração Foxp3 para fatores de transcrição. Nós geralmente adquirem nossas amostras imediatamente após a coloração. No entanto, as amostras podem ser armazenadas durante a noite em tampão FACS com formaldeído a 1%, a 4 ° C no escuro. Esteja ciente de que alguns fluorocromos e anticorpos podem não ser compatíveis com a fixação.
Para a análise de selecção positiva, é recomendável usar biotinilado anti-CD69 ou anti-CD5 para fornecer uma melhor separação das populações negativas, intermediário e altamente expressa (Figura 2). Conforme descrito nos resultados representativos,esta estratégia de propagação vai ajudar a distinguir defeitos de seleção positiva de compromisso linhagem, como os dois podem exigir diferentes acompanhamento. Além de geração de timócitos maduros SP, selecção positiva pode ser confirmada por supra-regulação de IL-7Rα e CCR7. No entanto, estes marcadores são expressos em baixos níveis em timócitos de pós-selecção de DP em comparação com os timócitos SP 15,16. Para uma análise detalhada do estádio de maturação dentro do compartimento de DP, expressão Zap70 intracelular pode ser medida 17. Isto pode ser particularmente útil para demonstrar que as populações com a expressão dos marcadores de maturação semelhante, tais como I e II sobre a TCRβ x CD5 plot (Figura 2E), representam diferentes fases de desenvolvimento.
O modelo CD4 HY tem as vantagens de que representa tanto positivo como negativo de selecção, assim como a expressão fisiológica do TCR transgénico. No entanto, estes métodos podem ser aplicados aoutros modelos transgénicos TCR com certas considerações. Sempre incluem um anticorpo contra o TCR transgénico de escolha para permitir estudo das células T específicas de antigénio. Para algumas análises, podem ser de interesse comparar a população específica de antigénio para a população não-específica como um controlo interno. Estudar seleção negativa em outros modelos transgênicos TCR requer maiores considerações. O estágio de desenvolvimento dos timócitos durante o qual seleção negativa ocorre varia entre os diferentes modelos de TCR transgênicos. Timócitos CD4 HY envolver pMHC na fase DP, assim a análise da população de descendência HY específicos CD8SP é a leitura correcta para a selecção negativa 10,18 (Figura 3). Se a selecção negativa ocorre durante a transição para DN DP como em ratinhos HY clássicos 19, a análise de interesse seria a presença ou ausência de timócitos específicas de antigénio de DP. Selecção contra o antigénio HY ubíquo ocorre no timocórtex 20. Em contraste, a selecção negativa contra o tecido de restrição antígenos ocorre na medula do timo 21,22. OT-I-RIP MOVA ratos recapitular este tipo de selecção como do antigénio Ova é expresso sob o controlo do promotor de insulina de rato, que é activa apenas na medula do timo e do pâncreas 23. Uma vez que a selecção positiva de timócitos DP no córtex do timo é primeiro necessário para a migração para dentro da medula, a ausência de madura (CD24 lo) OT-I TCR + timócitos CD8SP indica a selecção negativa com sucesso em ratos Rip-MOVA OT-I 24.
Enquanto utilizando ratinhos transgénicos TCR tem a vantagem de ser capaz de estudar uma grande população de células específicas de antigénio, uma advertência potencial é alterada desenvolvimento de células T, devido à limitada ligandos que podem mediar a selecção positiva e negativa do TCR transgénico. Em RAG-suficientes CD4 ratos HY, outra ressalva é que a co-expressão de endógenasnous cadeias TCRα tem o potencial de modular a selecção positiva e negativa em uma minoria de HY TCR + timócitos. Esta advertência não é único para o modelo de HY CD4, mas, em vez de TCR modelos transgénicos em geral. As CD4 HY representativos apresentados são derivados de ratinhos HY CD4 em um fundo Rag-suficiente. Apesar de um pouco mais de natureza complexa, há muitas maneiras de estudar a seleção dos timócitos em um ambiente mais fisiológico de freqüência precursor limitado. Por exemplo, TCR transgénico e quimeras de medula óssea WT mistos podem ser gerados para reduzir o antigénio específico frequência precursor de timócitos. Além disso, pode-se usar ratinhos que expressam apenas uma cadeia TCRβ transgénico, tal como a cadeia do TCR VB8 HY 25 ou a cadeia do TCR VB5 OT-I 26 para limitar a frequência do precursor. Como a cadeia TCRβ transgênico está emparelhado com várias cadeias TCRα endógenos, acompanhamento de antígeno específico re timócitosrequer que a utilização dos tetrâmeros pMHC. Uma limitação deste método é que a expressão de TCR é muito baixo em timócitos de DP para permitir a detecção com tetrâmeros. Isto limita ainda mais estudo dos mecanismos moleculares em timócitos de DP que levam a selecção positiva e negativa. Mais recentemente, uma combinação de tetrâmeros pMHC e enriquecimento esfera magnética foi usada para enumerar pequenas, específicas de antigénios populações de células T CD4 + em ratos não manipulados 27.
Selecção negativa é mediada primariamente por deleção clonal de auto-reactivas timócitos, através da via intrínseca da apoptose. Timócitos apoptóticos pode ser detectada por citometria de fluxo utilizando coloração intracelular para caspase-3 clivada. O BH3-somente Bcl-2 Bim membro da família é essencial para a activação da caspase-3 em timócitos em resposta a estimulação TCR 18,28. Ao cruzar Bim camundongos deficientes para diferentes modelos de TCR transgênicos, nosso laboratório constatou que Bim é necessário para seleção negativação contra ubíquos auto-antigénios, mas não restritas a antigénios de tecido, indicando a existência de múltiplos mecanismos de selecção negativa 18,29. Abordagens semelhantes têm indicado o Nur77 receptor órfão de esteróides como outro importante mediador de seleção negativa tímica 30,31. Análise transcricional de timócitos de ratos DP CD4 HY gerou uma lista de genes especificamente induzidos durante a selecção positiva e negativa 32. Aplicando os métodos apresentados aqui para ratos manipulados nestes genes podem fornecer insights sobre os mecanismos moleculares da seleção tímica.
É ideal para acompanhar exame de selecção tímica com uma análise do compartimento periférico imune. No entanto, é muitas vezes difícil de separar deleção central e periférico. Selecção negativa é finalmente reflectido pela ausência de auto-imunidade. Embora eles têm limitações, os camundongos transgênicos TCR são uma forma poderosa e prática paraestudar seleção negativa fisiológica. Camundongos transgênicos TCR cruzamento para camundongos deficientes em genes específicos é uma maneira eficaz para investigar os mecanismos moleculares de seleção negativa. É importante estar ciente, no entanto, que a inflamação periférica devido a um defeito no gene podem causar supressão não específica mediada por timócitos corticosteróides e citocinas 7-9. Em tais casos, a estratégia aqui apresentada pode ser aplicada à análise de Thymi a partir de ratos neonatais, antes do início da inflamação. A selecção positiva, por outro lado, pode ser estudada em ambos os modelos de TCR-ou não-transgénicos TCR, poupando os investigadores dos problemas de cruzamento. Uma melhor compreensão das moléculas envolvidas na selecção positiva e negativa irá conduzir a novas estratégias para o diagnóstico e tratamento de distúrbios auto-imunes e imunodeficiência.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Bing Zhang por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-86595). TAB é um CIHR novo investigador e estudioso AHFMR. QH é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação CIHR Canadá - Doutorado e um Studentship tempo inteiro AIHS. SAN é apoiado por uma Rainha Elizabeth II de Bolsas de Estudo de Pós-Graduação. AYWS é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação NSERC - Doutorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
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