Summary
Vi præsenterer en flowcytometri-baserede metode til at undersøge T-celleudvikling
Abstract
Et sundt immunsystem kræver, at T-celler reagerer på fremmede antigener, mens de resterende tolerant til selv-antigener. Tilfældig omlejring af T-cellereceptoren (TCR) α og β loci genererer et T-celle-repertoire med stor forskel på antigenspecificitet, både til sig selv og fremmede. Udvælgelse af repertoiret under udvikling i thymus er kritisk for generering af sikre og egnede T-celler. Defekter i thymisk udvælgelse bidrage til udviklingen af autoimmune og immundefekt lidelser 1-4.
T-celle-progenitorer ind thymus som dobbelt-negative (DN) thymocytter, som ikke udtrykker CD4-eller CD8-co-receptorer. Ekspression af αβTCR og begge coreceptorer forekommer ved den dobbelte positive (DP) fase. Interaktion af αβTCR med selv-peptid-MHC (pMHC) præsenteret ved thymiske celler bestemmer skæbnen for DP thymocyt. Høj affinitet interaktioner fører til negativ selektion og elimineringtion af selvnedbrydende thymocytter. Lav affinitet interaktioner resulterer i positiv selektion og udvikling af CD4 eller CD8 enkelte positive (SP) T-celler stand til at genkende fremmede antigener præsenteret af selv-MHC 5.
Positiv selektion kan undersøges i mus med et polyklonalt (vildtype) TCR repertoire ved at observere dannelsen af modne T-celler. De er imidlertid ikke ideelle til studiet af negativ udvælgelse, der involverer deletion af små antigen-specifikke populationer. Mange modelsystemer har været anvendt til at undersøge negativ selektion, men varierer i deres evne til at rekapitulere fysiologiske begivenheder 6. For eksempel mangler in vitro-stimulering af thymocytter den thymiske miljø, som er tæt involveret i selektion, mens indgivelse af exogent antigen kan føre til ikke-specifik deletion af thymocytter 7-9. I øjeblikket er de bedste værktøjer til at studere in vivo negativ selektion er mus, der udtrykker en transgENIC TCR specifikke for endogene selv-antigen. Imidlertid er mange klassiske TCR-transgene modeller karakteriseret ved for tidlig ekspression af det transgene TCRα kæde på DN fase, hvilket resulterer i for tidlig negativ selektion. Vores laboratorium har udviklet HY CD4 model, hvor det transgene HY TCRα er betinget udtrykt på DP fase, hvilket tillader negativ selektion til at forekomme i DP til SP overgang som forekommer i vildtype-mus 10.
Her beskriver vi en flowcytometri-baseret protokol til at undersøge thymisk positiv og negativ selektion i HY CD4 musemodel. Mens negativ selektion i HY CD4 mus er meget fysiologisk, kan disse fremgangsmåder også anvendes på andre TCR-transgene modeller. Vi vil også præsentere generelle strategier til at analysere positiv selektion i et polyklonalt repertoire gælder for genetisk manipulerede mus.
Protocol
Se figur 1 for en samlet ordning af forsøgsprotokollen.
1. Dissection
- Sted sterile stål mesh sigte i 60 x 15 mm petriskål. En enhed er nødvendig pr vævsprøve.
- Der tilsættes 5 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) til hver skål. Hold retter på is.
- Aflive mus med CO 2.
- Sikker mus til dissektion overflade, ventral opad. Spray mus med 70% ethanol til sterilisering og sikre, at pelsen sammenfiltret ned.
- Anvendelse af kirurgiske sakse, dissektion begynde med en ventral incision i den abdominale hud lige over genitalier. Udvid indsnit opad til hagen.
- Fra midterlinjen forlænge snittet ned langs alle lemmer. Træk tilbage den løse hud og pin det ned til dissektion overflade.
- Høste thymus:
- Løfte bunden brystbensspids til at lave et snit.
- Undgå leveren, skære membranen for at frigøre brystkassen og derefter skære brystkassen på hver side. Skær brystkassen opad på hver side, idet man undgaar lungerne og hjertet.
- Træk forsigtigt brystkassen tilbage med en pincet. Thymus er et hvidt, bilobed organ placeret over hjertet. På den flade kant af tangen til at gribe undersiden af fligene, træk forsigtigt thymus og placere den på mesh sigte.
- Høste milt:
- Milten er en rød, surfboard-formet organ placeret på venstre side af musens bughulen, under leveren.
- Lave et snit ind i bughulen. Træk forsigtigt milten med en pincet eller lignende, ved hjælp af det andet par for at drille væk bindevæv. Anbring milten på et separat mesh sigte.
2. Cell Preparation
- Ved hjælp af et stempel fra en 3 ml sprøjte, maleorganer ind i mesh skærmen, indtil kun bindevæv og fedt rester. Skyl mesh med HBSS fra skålen tre gange. Anvende et nyt stempel til hver vævsprøve.
- Andre muligheder for at homogenisere væv kan anvendes i stedet for denne metode.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 335 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender splenocytter i 500 pi ACK lysis buffer (0,15 M NH4CI, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2) i 10 minutter ved stuetemperatur. Resuspender thymocytter på 20 x 10 6 celler / ml i FACS-buffer (PBS, 1% FCS, 0,02% natriumazid) og der er afsat på is.
- Returnerer splenocytter til isotonicitet ved tilsætning af 5 ml HBSS. Pellet splenocytter ved centrifugering og resuspenderes ved 20 x 10 6 celler / ml i FACS-buffer. Hvis celler har brug for at forblive sterile, kan du bruge steril RPMI + 10% FCS.
3.Farvning af celler til flowcytometri
Formålet med denne protokol er at skitsere strategier til analyse af positiv og negativ selektion ved hjælp af vildtype (WT) og HY CD4 mus. For generelle betragtninger vedrørende flowcytometri eksperimenterende design, erhvervelse, og analyse henvises læserne til en fremragende gennemgang af Tung et al. 11
- Alikvot 4 x 10 6 thymocyter pr flowcytometriprøver til hver brønd på en 96-brøndsplade, samt 1 x 10 6 vægt splenocytter per kompensationskontrol. Hvis du bruger transgene mus, bør du medtage en WT mus som en kontrol i dit eksperiment.
- Blokerer Fc-receptorer ved at inkubere celler med anti-CD16/32 (klon 2.4G2) i 10 minutter på is.
- Spin plade ved 335 x g ved 4 ° C i 5 minutter. Fjern låget og fjerne væske fra brøndene ved at stille pladen en gang, med forsiden nedad i en vask. Resuspender hver brønd i 200 pi FACS buffer. Gentag vask.
- Forbered antistof cocktails nedenfor anførte i den optimale koncentration af hvert antistof baseret på fortynding i 200 pi FACS buffer per well. Den optimale koncentration af hvert antistof defineres som den laveste koncentration nødvendig for at give den største adskillelse af positive og negative populationer. Hvis der ikke er nogen negativ population for et givet antistof, bør en isotype antistof medtages. Det totale volumen per brønd kan nedtrappes (fx til 100 pi per well) om ønsket.
- WT thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 eller anti-CD5 og anti-CD24
- HY CD4 thymus: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 eller anti-CD5-, anti-CD24
At opnå en bedre adskillelse af CD69 lo og CD69 hi befolkningsgrupper i thymocytter, anbefales det, at et biotinyleret anti-CD69 primært antistof anvendes, efterfulgt af en sekundær farvning med fluorochrom-konjugeret streptavidin. Vi use den samme strategi for CD5 farvning.
- Cellerne inkuberes med 200 ul antistof-cocktail i FACS-buffer i 30 min på is i mørke.
- Samtidig med antistof cocktail farvning, plet hver kompensationskontrol med et enkelt fluorochrom-konjugeret antistof. Ideelt set kompensation farvning involverer de samme antistoffer som anvendt i antistof-cocktail. Dog kan farvning for hvert enkelt antigen ikke være muligt for større eksperimenter, hvor mange antigener, der analyseres. Derfor er farvning for enten anti-CD4 eller anti-CD8 anbefales på grund af høj ekspression af disse antigener, eller brugen af kompensation perler. Farv i FACS-buffer i 30 min på is i mørke. Efterlad en kompensationskontrol ufarvet.
- Vask cellerne to gange med FACS-buffer.
- Resuspender celler i FACS-puffer og overføres til FACS rør.
- Erhverve prøver på flowcytometer. Medtag køb af FSC-A og FSC-W til enllow for dublet diskrimination.
4. Analyse af Flowcytometri Data - Non-TCR transgene mus
Vi bruger FlowJo til flowcytometri dataanalyse. Se figur 2A for gating strategi for ikke-TCR-transgene mus.
- Brug af FSC-A ved SSC, elektronisk gate på "lymfocyt" befolkning.
- Inden for "lymfocyt" befolkning, bruge FSC-A af FSC-W til elektronisk gate FSC-W lo befolkning at udelukke celle dubletter og aggregater. Dette er "singlet" gate.
- Brug af begivenhederne i "singlet" gate, plot CD8 af CD4. Tegn porte for DN, DP kedelig, DP lyse, CD4 + CD8 lo, CD4SP og CD8SP populationer som afbildet i figur 2B.
- Under CD4SP og CD8SP porte, oprette TCRβ med CD24 plots. Brug kvadrant gating til at tegne porte som vist i figur 2C.
- Opret en new plot fra "singlet" gate: TCRβ med CD69. Tegne porte A, B, C, D som vist i figur 2D.
- Opret en anden plot fra "singlet" gate: TCRβ ved CD5. Tegne porte I, II, III, IV som vist i figur 2E. Dette er en anden strategi for behandlingen af positiv selektion.
- Påfør DN, DP kedelig, DP lyse, CD4 int, CD4SP og CD8SP porte fra under "singlet" til gates I, II, III, IV, A, B, C, D (figur 2D, E).
- Beregn antallet af celler i en bestemt delmængde ved at multiplicere orgel cellularitet af frekvensen af hver efterfølgende gate, indtil du når din målgruppe. For eksempel ville antallet af TCRβ hi CD69-CD8SP thymocyter bestemmes ved thymus cellularitet x% TCR BHI CD69-(fraktion D) x% CD8SP.
- Optælling allerede tager hensyn til de levende og døde celler, så omfatter ikke "lymphocyte "gate i dine beregninger.
5. Analyse af Flowcytometri Data - TCR transgene mus
Der henvises til figur 3A for gating strategi for TCR-transgene mus.
- Følg trinene 4,1 og 4,2 som i det foregående afsnit.
- Under "singlet" gate, skal du oprette en T3.70 af SSC plot og gate på T3.70 + cellepopulationen at analysere antigen-specifikke T-celler (figur 3B). I nogle tilfælde kan det være af interesse at sammenligne denne population til den ikke-antigenspecifikke (T3.70-) T-cellepopulation.
- Inden for T3.70 +-populationen, draw DN, DP, CD4SP og CD8SP porte (figur 3C).
- For WT kontrolprøver, tegne disse porte under "singlet" gate eller oprette en T3.70-gate da der vil være meget få T3.70 + celler.
- Under CD8SP gate, oprette enT3.70 af CD24 plot. Brug kvadrant gating værktøj til at opdele cellerne i fire populationer (figur 3F).
- Opret en overlejret histogram viser CD69-ekspression i DP rum i WT mus og T3.70 + DP rum af HY CD4 mus (figur 4A). Gentag at undersøge CD5 ekspression (figur 4B).
- Beregne den absolutte antal celler i hver delmængde af interesse som i 4.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I fysiologiske TCR transgene modeller og WT mus, begynder positiv markering på DP lyse scene før du flytter ind i DP kedelig etape efter antigen encounter. DP kedelige thymocytter derefter indtaste et overgangs CD4 + CD8 lo etape før han blev CD4SP eller CD8SP thymocytter (figur 2B). Ældre SP thymocyter er kendetegnet ved høj TCR ekspression og tab af CD24 (figur 2C). Mens CD8 af CD4 profil kan afsløre fejl i positiv selektion, undersøge TCRβ med CD69 eller CD5 kan give yderligere indsigt i, hvor defekten ligger. Både CD69 og CD5 opreguleres efter TCR stimulering med stærkere interaktioner køre højere ekspression af disse markører.
På TCRβ med CD69 plot, A gate (TCRβ lo CD69-) repræsenterer en population af præ-valg DP thymocytter, gate B (TCRβ int CD69 +) repræsenterer en transitional population direkte efter TCR engagement, gate C (TCRβ hi CD69 +) repræsenterer populationen af celler direkte efter positiv selektion, og porten D (TCRβ hi CD69 -) repræsenterer en mere moden population af celler (figur 2D). I et WT mus, A gate består af DP lyse celler, mens porten B består primært af DP lyse med nogle DP matte og CD4 + CD8 lo celler. Gate C består primært af DP kedelige, CD4 + CD8 lo og CD4SP celler, hvorimod gate D består primært af CD4SP og CD8SP. Fravær af populationer B og C kan være et tegn på nedsat positiv selektion. Ændringer i forholdet mellem CD4SP til CD8SP inden befolkning D kan foreslå ændringer i slægt engagement. Tabet af befolkninger C og D kan afspejle overlevelse spørgsmål efter positiv selektion.
Behandlingen TCRβ ved CD5 er en anden strategi to identificere præ-og post-positiv udvælgelse populationer. Befolkning i (TCRβ lo CD5 lo) repræsenterer operatørvalg DP thymocytter og befolkningen ii (TCRβ lo CD5 int) er celler indlede positiv selektion (figur 2E). Disse befolkninger består primært af DPbright thymocytter. Population iii (TCRβ int CD5 hi) repræsenterer thymocyter i færd med at undergå positiv selektion og består primært af DP matte og CD4 + CD8 lo thymocytter. Befolkning iv (TCRβ hi CD5 hi) består primært af post-positiv selektion SP thymocytter. Nedsat produktion af populationer II og III viser defekt positiv selektion. Ændringer i forholdet mellem CD4SP til CD8SP inden befolkning iv trods normal foregående populationer kan foreslå ændringer i slægt engagement. Et fravær af befolkningen iv kan indikere nedsat overlevelse efter positiv udvæltion. For eksempel i Tox - / -, mus defekte CD4SP differentiering fører til en drastisk reduktion i populationer iv, C og D, mens positiv selektion forbliver intakt 12. Sande fejl i positiv selektion kan ses med Bcl11b inaktivering under DP fase, som fører til tab af populationer B, C og D 13,14. RasGRP1-deficiente mus har en tidligere fejl ved positiv selektion, hvilket resulterede i nærværelse af kun population A (upublicerede data).
Som negativ selektion involverer sletning af små antigen-specifikke populationer, der mangler i denne proces bedst observeres ved hjælp af TCR transgene mus. I HY-CD4 mus, kan thymocyter udtrykkende det transgene HY TCR påvises med det monoklonale antistof T3.70 (figur 3B). Den HY TCR genkender den mandlige-specifikke HY antigen præsenteret i MHC klasse-id b. Således HY CD4 Mand (M) mus gennemgå negativ selektion af HY TCR
En advarsel fra TCR transgene modeller er, at de transgene TCR udtrykkes stærkt i hele thymocyt udvikling. Som følge heraf er det vanskeligt yderligere at karakterisere positiv selektion ved at identificere populationer baseret på TCR og CD69/CD5 ekspression. Men CD69 og CD5 udtryk korrelerer med styrken af TCR-signalering. I WT mus, de fleste DP thymocytter ikke undergår positiv eller negativ selektion, som kræver TCR engagement pMHC, og således ikke opregulere CD69 eller CD5. HY CD4 F mus har en stor population af T3.70 + DP thymocyter, som undergår positiv selektion, som indikeret ved en stigning i CD69 +-populationen i forhold til WT (figur 4A). Negativ selektion involverer en højere affinitet TCR stimulus end positiv selektion, hvilket er angivet ved højere ekspression af CD69 på T3.70 + DP thymocyter i HY-CD4 M mus, hvilket resulterer i et skift of histogrammet top til højre. Lignende tendenser ses med CD5-ekspression (figur 4B). Når man analyserer thymiske selektion i genetisk manipulerede mus, undersøge CD69 eller CD5 udtryk kan afgøre, om defekten ligger hos TCR signalering eller en downstream resultat af TCR stimulation.
Figur 1. Overordnet opbygning af forsøgsprotokollen.
Figur 2. Analyse thymisk selektion i ikke-TCR-transgene mus. (A) Gating strategi til analyse thymisk selektion i ikke-TCR-transgene mus. (B) CD8 af CD4 profil af en WT thymus. (C) Undersøgelse af modenhed af SP thymocyter ved TCRβ og CD24-ekspression. (D) Stadier af positiv selektion kan skelnes vedCD69 ved TCRβ udtryk, sammen med CD8 og CD4 profilering i hvert undersæt. (E) TCRβ ved CD5 er en anden strategi, der kan anvendes til at adskille udviklingsstadier. se større tal .
Figur 3. Analyse thymisk selektion i HY CD4 mus. (A) Gating strategi til analyse thymisk selektion i TCR-transgene mus. (B) Hyppigheden af thymocyter udtrykker HY TCR (T3.70 +) i WT, HY CD4 F og HY CD4 M mus. (C) CD8 af CD4 profiler af T3.70 +-populationen i angivne mus. Ud over frekvenser, er det absolutte antal T3.70 + DP (D) og især T3.70 + CD8SP (E) thymocyter vigtig indikator for negativ selektion. (F) Undersøgelse afløbetid på CD8SP thymocyter i angivne mus. Klik her for at se større figur .
Fig. 4. Ekspression af aktiveringsmarkører CD69 (A) og CD5 (B) på totale DP thymocyter fra WT og T3.70 + DP thymocytter fra HY CD4 F og HY CD4 M mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her kan anvendes til at undersøge positiv og negativ selektion i ikke-TCR transgene og TCR-transgene mus. Denne protokol beskrives farvning af overflade-antigener. For en nærmere analyse af molekylære mekanismer, er det ofte nødvendigt at udføre intracellulær farvning. Vi bruger BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit for de fleste intracellulære proteiner og BD Biosciences foxp3 farvningssæt for transkriptionsfaktorer. Vi plejer at købe vores prøver umiddelbart efter farvning. Imidlertid kan prøverne opbevares natten over i FACS puffer med 1% formaldehyd ved 4 ° C i mørke. Vær opmærksom på at nogle fluorokromer og antistoffer ikke kan være forenelig med fiksering.
Til analyse af positiv selektion anbefales det at anvende biotinyleret anti-CD69 eller anti-CD5 at tilvejebringe bedre adskillelse af negative, mellemliggende og højt ekspresserende populationer (figur 2). Som beskrevet i de repræsentative resultater,denne gating strategi vil hjælpe med at skelne fejl i positiv markering fra slægt engagement, da de to kan kræve anderledes opfølgning. Ud over frembringelse af modne SP thymocyter, kan positiv selektion bekræftes ved opregulering af IL-7Rα og CCR7. Men disse markører udtrykkes på et lavt niveau på efter-valg DP thymocytter i forhold til SP thymocyter 15,16. For detaljeret analyse af modning faser i DP rum, kan intracellulær Zap70 udtryk måles 17. Dette kan især være nyttigt at demonstrere, at befolkninger med lignende udtryk for modning markører, såsom I og II på den TCRβ x CD5 plot (Figur 2E), repræsenterer forskellige stadier af udvikling.
HY CD4 modellen har fordelene ved repræsenterer både positiv og negativ selektion, såvel som fysiologisk ekspression af det transgene TCR. Imidlertid kan disse metoder anvendes tilandre TCR transgene modeller med visse overvejelser. Altid omfatter et antistof mod det transgene TCR valg at muliggøre undersøgelse af antigenspecifikke T-celler. For visse analyser kan det være af interesse at sammenligne den antigen-specifik population af ikke-specifik population som en intern kontrol. At studere negativ selektion i andre TCR transgene modeller kræver yderligere overvejelser. Den fase af thymocyt udvikling, hvor negativ udvælgelse finder sted, varierer mellem de forskellige TCR transgene modeller. HY CD4 thymocyter indgreb pMHC på DP fase, således analyse af HY-specifikke CD8SP afkom population er den korrekte udlæsning for negativ selektion 10,18 (fig. 3). Hvis negativ selektion forekommer under DN til DP overgang som i klassisk HY-mus 19, ville analysen af interesse være tilstedeværelsen eller fraværet af antigen-specifikke DP thymocyter. Selektion mod den allestedsnærværende HY-antigenet forekommer i den thymiskecortex 20. I modsætning hertil forekommer negativ selektion mod vævs-begrænsede antigener på den thymiske medulla 21,22. OT-I RIP-mOva mus sammenfatte denne type udvælgelse som Ova antigenet udtrykkes under styring af rotte-insulin-promotor, som er aktiv kun i thymus medulla og pancreas 23. Siden positiv selektion af DP thymocyter i thymiske cortex først kræves for indvandring i medulla, fraværet af modne (CD24 lo) OT-I TCR + CD8SP thymocytter indikerer en succesfuld negativ selektion i OT-I Rip-mOva mus 24.
Mens anvendelse af TCR-transgene mus har den fordel at være i stand til at studere en stor population af antigen-specifikke celler er en potentiel advarsel ændret T-celleudvikling grund af begrænsede ligander, som kan mediere positiv og negativ selektion af transgene TCR. I RAG-tilstrækkelige HY-CD4 mus, er et andet forbehold, at co-ekspression af endogenous TCRα kæder har potentiale til at modulere positiv og negativ selektion på et mindretal af HY TCR + thymocyter. Denne advarsel er ikke enestående for HY CD4 model, men snarere TCR transgene modeller i almindelighed. De repræsentative HY præsenterede CD4 er afledt af HY CD4 mus på en Rag-tilstrækkelig baggrund. Selvom noget mere komplicerede, er der mange måder at studere thymocyt-selektion i en mere fysiologisk indstilling af begrænset precursor frekvens. For eksempel kan TCR transgene og WT blandede knoglemarv kimærer dannes for at reducere den antigenspecifikke thymocyt precursor frekvens. Derudover kan der anvendes mus, som kun udtrykker en transgen TCRβ kæde, såsom VB8 kæden af HY TCR 25 eller VB5 kæden af OT-I TCR 26 for at begrænse precursor frekvens. Fordi den transgene TCRβ kæden er parret med forskellige endogene TCRα kæder, sporing af antigen-specifikke thymocytter reDette kræver, anvendelsen af pMHC tetramerer. En begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at TCR ekspression er for lav på DP thymocyter at muliggøre detektion med tetramerer. Dette begrænser yderligere undersøgelse af de molekylære mekanismer i UP-thymocytter, der fører til positiv og negativ selektion. For nylig er en kombination af pMHC tetramerer og magnetiske perler berigelse blevet anvendt til at optælle små antigen-specifikke populationer af CD4 + T-celler i umanipulerede mus 27.
Negativ selektion medieres primært af klonal deletion af selv-reaktive thymocyter via den indre apoptosis pathway. Apoptotiske thymocytter kan påvises ved flowcytometri under anvendelse af intracellulær farvning for kløvet caspase-3. The BH3-only Bcl-2 familiemedlem Bim er afgørende for caspase-3 aktivering i thymocytter som reaktion på TCR-stimulering 18,28. Ved at krydse Bim-deficiente mus til forskellige TCR-transgene modeller, har vores laboratorium fandt, at Bim kræves til negativ udvælgelsetion mod allestedsnærværende selv-antigener, men ikke væv-begrænsede antigener, hvilket indikerer at der findes mange negative selektionssystemer mekanismer 18,29. Lignende tiltag har impliceret den forældreløse steroidreceptorvirkning Nur77 som endnu en central formidler af thymisk negativ selektion 30,31. Transkriptionel analyse af DP thymocyter fra HY CD4 mus har genereret en liste af gener, der specifikt induceres under positiv og negativ selektion 32. Anvendelse af de metoder der præsenteres her til mus manipuleret i disse gener kan give indsigt i de molekylære mekanismer i thymisk valg.
Den er ideel til at følge op undersøgelse af thymisk markering med en analyse af det perifere immun rum. Det er imidlertid ofte vanskeligt at adskille central og perifer deletion. Negativ selektion i sidste ende afspejlet ved fravær af autoimmunitet. Selvom de har begrænsninger, TCR transgene mus er en kraftfuld og praktisk måde atundersøge fysiologisk negativ selektion. Crossing TCR-transgene mus til mus, der mangler bestemte gener, er en effektiv metode til at undersøge de molekylære mekanismer i negativ selektion. Det er vigtigt at være klar over, kan det perifere inflammation på grund af en gendefekt forårsage uspecifik thymocyt deletion medieres af corticosteroider og cytokiner 7-9. I sådanne tilfælde kan den, der fremlægges her, kan anvendes til analyse af thymi fra neonatale mus før indtræden af inflammation. Positiv selektion, på den anden side, kan studeres i enten TCR-eller ikke-TCR-transgene modeller, sparer undersøgere besværlighederne af krydsning. En bedre forståelse af de molekyler, der er involveret i positiv og negativ selektion vil føre til nye strategier til diagnose og behandling af autoimmune og immundefekt lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Bing Zhang for hans teknisk bistand. Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Institutes for Health Research (MOP-86.595). TAB er en CIHR New Investigator og AHFMR Scholar. QH er understøttet af en CIHR Canada Graduate Scholarship - Ph.d. og en AIHS Fuldtids studentship. SAN er understøttet af en dronning Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS understøttes af en NSERC Postgraduate Scholarship - Doctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
