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Immunology and Infection

फ्लो Thymic सकारात्मक और नकारात्मक चयन परीक्षा

Published: October 8, 2012 doi: 10.3791/4269
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta
* These authors contributed equally

Summary

हम एक प्रवाह cytometry आधारित टी सेल के विकास की जांच के लिए विधि मौजूद

Protocol

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के एक समग्र योजना के लिए आकृति 1 देखें.

1. विच्छेदन

  1. 60 x 15 मिमी पेट्री डिश में बाँझ इस्पात जाल स्क्रीन. एक ऊतक का नमूना प्रति यूनिट की जरूरत है.
  2. प्रत्येक पकवान हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) के 5 मिलीलीटर जोड़ें. बर्फ पर बर्तन रखें.
  3. सीओ 2 के साथ चूहों euthanize.
  4. विच्छेदन सतह से सुरक्षित माउस, उदर पक्ष को सामना करना पड़ रहा है. बंध्याकरण के लिए 70% इथेनॉल के साथ और करने के लिए सुनिश्चित करें कि फर नीचे उलझा हुआ है स्प्रे माउस.
  5. शल्य कैंची का प्रयोग, जननांग बस के ऊपर पेट की त्वचा में एक उदर चीरा द्वारा विच्छेदन शुरू करते हैं. ठोड़ी को चीरा ऊपर की ओर बढ़ाएँ.
  6. Midline से, सभी अंगों साथ चीरा नीचे का विस्तार. ढीली त्वचा वापस खींचो और यह विच्छेदन सतह नीचे पिन.
  7. थाइमस हार्वेस्ट:
    1. एक चीरा बनाने उरोस्थि के नीचे टिप लिफ्ट.
    2. जिगर से बचना, डायाफ्राम रिब पिंजरे से अलग और फिर प्रत्येक पक्ष रिब पिंजरे में कटौती में कटौती. प्रत्येक पक्ष पर ribcage ऊपर कट, फेफड़े और दिल से बचने के लिए देखभाल करने के लिए.
    3. धीरे से ribcage संदंश साथ वापस खींच. थाइमस एक सफेद, bilobed दिल से ऊपर स्थित अंग है. संदंश के फ्लैट बढ़त का उपयोग lobes के नीचे समझ, धीरे thymus खींचने के लिए और यह जाल स्क्रीन पर जगह.
  8. तिल्ली हार्वेस्ट:
    1. तिल्ली एक लाल, सर्फ़बोर्ड के आकार का माउस जिगर के नीचे उदर गुहा, के बाईं ओर स्थित अंग है.
    2. उदर गुहा में एक चीरा. धीरे संदंश की एक जोड़ी के साथ तिल्ली खींच, 2 जोड़ी का उपयोग करने के लिए दूर संयोजी ऊतक तंग. एक अलग जाल स्क्रीन पर तिल्ली रखें.

2. सेल तैयारी

  1. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से एक सवार का उपयोग पीसने,केवल संयोजी ऊतक और वसा बनी हुई है जब तक जाल स्क्रीन में अंगों. HbSS पकवान से तीन बार के साथ जाल कुल्ला. प्रत्येक ऊतक नमूने के लिए एक नया सवार का प्रयोग करें.
    1. ऊतक homogenizing के लिए अन्य विकल्प इस विधि के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. एक hemocytometer कोशिकाओं का उपयोग कर की गणना.
  3. गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा 335 में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए XG
  4. ACK lysis बफर के 500 कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए (0.15 एम एनएच 4 सीएल, 10 मिमी 3 KHC0, 0.1 मिमी ना 2 EDTA, पीएच 7.2) μl में Resuspend splenocytes. 20 में Resuspend thymocytes x 10 6 कोशिकाओं / FACS बफर में मिलीलीटर (पीबीएस FCS 1,%, 0.02% सोडियम azide) और बर्फ पर अलग निर्धारित करें.
  5. HbSS की 5 मिलीग्राम जोड़कर isotonicity के लिए splenocytes लौटें. Centrifugation और resuspend द्वारा 20 में गोली splenocytes x 10 6 कोशिकाओं / FACS बफर में मिलीलीटर. यदि कोशिकाओं को बाँझ रहने की जरूरत है, तो आप बाँझ RPMI + 10% FCS का उपयोग कर सकते हैं.

3.फ्लो के लिए धुंधला हो जाना कोशिकाओं

इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए सकारात्मक और नकारात्मक wildtype (WT) और हरियाणा CD4 चूहों का उपयोग कर चयन के विश्लेषण के लिए रणनीति की रूपरेखा तैयार करने के लिए है. सामान्य प्रवाह cytometry प्रयोगात्मक डिजाइन, अधिग्रहण विश्लेषण, और के बारे में विचार के लिए हम तुंग एट अल द्वारा एक उत्कृष्ट समीक्षा के लिए पाठकों का उल्लेख 11.

  1. 4 अशेष भाजक x 10 एक 96-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 6 प्रवाह cytometry नमूना प्रति thymocytes, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 1 एक्स 10 मुआवजा नियंत्रण प्रति 6 WT splenocytes. ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग अगर, आप अपने प्रयोग में एक नियंत्रण के रूप में एक WT माउस को शामिल करना चाहिए.
  2. बर्फ पर 10 मिनट के लिए anti-CD16/32 (2.4G2 क्लोन) के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक.
  3. 335 XG प्लेट 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन. ढ़क्कन निकालें और थाली एक बार flicking द्वारा तरल कुओं से दूर हो जाना, एक सिंक में नीचे चेहरा. FACS बफर के 200 μl में हर अच्छी तरह Resuspend. धोने दोहराएँ.
  4. एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार के रूप में नीचे सूचीबद्ध, FACS बफर की अच्छी तरह से प्रति 200 μl में कमजोर पड़ने पर आधारित प्रत्येक एंटीबॉडी के इष्टतम एकाग्रता का उपयोग. प्रत्येक एंटीबॉडी के इष्टतम एकाग्रता सबसे कम करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक आबादी का सबसे बड़ा जुदाई देने की जरूरत एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है. यदि वहाँ एक दिया एंटीबॉडी के लिए कोई नकारात्मक जनसंख्या है, एक निर्धारण एंटीबॉडी शामिल किया जाना चाहिए. कुल मात्रा के प्रति में अच्छी तरह से नीचे पहुंचा जा सकता है (उदाहरण के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl) अगर वांछित.
    1. WT थाइमस: विरोधी TCRβ विरोधी CD4, विरोधी CD8, विरोधी CD69 या विरोधी CD5, विरोधी CD24
    2. हरियाणा थाइमस CD4: विरोधी हरियाणा TCR (T3.70), विरोधी CD4, विरोधी CD8, विरोधी CD69 या विरोधी CD5, विरोधी CD24
      CD69 लो और thymocytes में CD69 उच्च आबादी के बेहतर जुदाई प्राप्त करने के लिए, यह सिफारिश की है कि एक biotinylated विरोधी CD69 प्राथमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जा के बाद, एक माध्यमिक दाग युक्त fluorochrome संयुग्मित streptavidin. हम यूसे CD5 धुंधला के लिए एक ही रणनीति.
  5. FACS बफर में एंटीबॉडी कॉकटेल के अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए 200 μl के साथ कोशिकाओं सेते हैं.
  6. एंटीबॉडी कॉकटेल धुंधला के साथ समवर्ती, एक एकल प्रतिरक्षी साथ fluorochrome संयुग्मित प्रत्येक मुआवजा नियंत्रण दाग. आदर्श रूप में, मुआवजा धुंधला हो ही एंटीबॉडी एंटीबॉडी कॉकटेल में उपयोग के रूप में शामिल है. हालांकि, प्रत्येक व्यक्ति प्रतिजन के लिए धुंधला बड़े प्रयोगों के लिए संभव नहीं हो सकता है जब कई प्रतिजनों assayed किया जा रहा है हो सकता है. इसलिए, या तो विरोधी CD4 या विरोधी CD8 धुंधला इन प्रतिजनों की उच्च अभिव्यक्ति, या मुआवजा मोतियों की उपयोग की वजह से सिफारिश की है. अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए FACS बफर में दाग. छोड़ दो एक मुआवजा नियंत्रण बेदाग.
  7. FACS बफर के साथ कोशिकाओं दो बार धो.
  8. FACS बफर और FACS ट्यूबों को हस्तांतरण में Resuspend कोशिकाओं.
  9. प्रवाह cytometer पर नमूने मोल. FSC-A के अधिग्रहण और एक FSC-डब्ल्यू शामिलनक़ल भेदभाव के लिए llow.

4. फ्लो डाटा का विश्लेषण - गैर TCR ट्रांसजेनिक चूहों

हम प्रवाह cytometry डेटा विश्लेषण के लिए FlowJo का उपयोग करें. गैर TCR ट्रांसजेनिक चूहों के लिए gating रणनीति के लिए 2A चित्रा देखें.

  1. FSC-एसएससी, "" जनसंख्या लिम्फोसाइट पर इलेक्ट्रॉनिक गेट से एक का उपयोग कर.
  2. लिम्फोसाइट आबादी के भीतर, FSC-डब्ल्यू द्वारा FSC इलेक्ट्रॉनिक फाटक FSC डब्ल्यू लो जनसंख्या सेल दोहरी और aggregrates को बाहर का उपयोग करें. यह "स्वेटर" द्वार है.
  3. "स्वेटर" गेट, CD4 द्वारा CD8 साजिश में घटनाओं का उपयोग करना. डी.एन., डी पी सुस्त, डी पी उज्ज्वल के लिए फाटकों ड्रा, CD4 + CD8 लो CD4SP, और CD8SP आबादी के रूप में चित्रा 2B में दर्शाया.
  4. फाटकों के तहत CD4SP और CD8SP, CD24 भूखंडों द्वारा TCRβ बनाते हैं. वृत्त का चतुर्थ भाग gating उपकरण का उपयोग फाटकों को आकर्षित के रूप में चित्र 2C में दर्शाया.
  5. एक NE बनाएँTCRβ CD69: "स्वेटर" गेट से w साजिश है. फाटकों ए, बी, सी, डी के रूप में चित्र 2d में दर्शाया. ड्रा
  6. CD5 TCRβ: "स्वेटर" गेट से एक और साजिश बनाएँ. फाटकों मैं, द्वितीय, तृतीय, चतुर्थ रूप में चित्रा 2E में दर्शाया ड्रा यह सकारात्मक चयन की जांच के लिए एक और रणनीति है.
  7. फाटकों के मैं, द्वितीय, तृतीय, चतुर्थ, ए, बी, सी, डी (चित्रा 2 डी, ई) के तहत "स्वेटर" से डी.एन., डी पी सुस्त, डी पी उज्ज्वल, CD4 int, CD4SP और CD8SP फाटकों लागू.
  8. प्रत्येक बाद फाटक के आवृत्ति से अंग कोषमयता गुणा जब तक आप अपने लक्ष्य आबादी तक पहुँचने के द्वारा एक विशेष सबसेट में कोशिकाओं की संख्या की गणना. उदाहरण के लिए, हाय TCRβ CD69-CD8SP thymocytes की संख्या थाइमस कोषमयता x% TCR भी निर्धारित किया जाएगा CD69 (अंश डी) x% CD8SP.
    1. गिनती पहले से ही खाते में लेता है जीवित और मृत कोशिकाओं को इतना "lymphoc नहीं शामिल नहीं हैअपनी गणना में YTE "गेट.

5. फ्लो डाटा का विश्लेषण - TCR ट्रांसजेनिक चूहों

Gating TCR ट्रांसजेनिक चूहों के लिए रणनीति के लिए 3A चित्रा देखें.

  1. 4.1 और 4.2 के रूप में पिछले अनुभाग में चरणों का पालन करें.
  2. "स्वेटर" गेट के तहत, एसएससी और T3.70 पर साजिश के गेट से एक T3.70 + सेल आबादी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं (3B चित्रा) का विश्लेषण. कुछ परिस्थितियों में, यह ब्याज की गैर विशिष्ट प्रतिजन (T3.70) टी सेल की आबादी के लिए इस आबादी की तुलना कर सकते हैं.
  3. भीतर T3.70 + जनसंख्या, आकर्षित डी.एन., डी पी, CD4SP और CD8SP गेट्स (चित्रा 3C).
    1. WT नियंत्रण नमूने के लिए, "स्वेटर" गेट के अंतर्गत इन फाटकों आकर्षित या एक T3.70 गेट बनाने के रूप में वहाँ बहुत कुछ T3.70 + कोशिकाओं हो जाएगा.
  4. CD8SP गेट के तहत, एक बनानेT3.70 CD24 साजिश के द्वारा. वृत्त का चतुर्थ भाग gating उपकरण का उपयोग करने के लिए चार आबादी (3F चित्रा) में कोशिकाओं के विभाजन.
  5. एक मढ़ा WT चूहों और हरियाणा CD4 चूहों की T3.70 + डी पी डिब्बे (4A चित्रा) के डी पी डिब्बे में CD69 अभिव्यक्ति चित्रण हिस्टोग्राम बनाएँ. CD5 अभिव्यक्ति (4B चित्रा) की जांच करने के लिए दोहराएँ.
  6. 4.8 के रूप में ब्याज की प्रत्येक सबसेट में कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या की गणना.

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Representative Results

शारीरिक TCR ट्रांसजेनिक मॉडल और WT चूहों में सकारात्मक चयन प्रतिजन मुठभेड़ के बाद डी पी सुस्त चरण में चलती से पहले डी पी उज्ज्वल चरण में शुरू होता है. डी पी सुस्त thymocytes तो एक संक्रमणकालीन CD4 + CD4SP या CD8SP thymocytes (चित्रा 2B) बनने से पहले CD8 लो चरण में प्रवेश. परिपक्व सपा thymocytes उच्च TCR अभिव्यक्ति और CD24 (चित्रा 2C) के नुकसान के द्वारा विशेषता है. जबकि CD4 प्रोफाइल सकारात्मक चयन में दोष प्रकट CD69 या CD5 द्वारा TCRβ की जांच कर सकते हैं द्वारा CD8 जहां दोष झूठ में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. दोनों CD69 और CD5 TCR उत्तेजना के बाद upregulated मजबूत करने के लिए इन मार्करों के उच्च अभिव्यक्ति ड्राइविंग बातचीत के साथ.

CD69 साजिश द्वारा TCRβ, गेट ए (TCRβ लो CD69) पूर्व चयन thymocytes डी पी की एक आबादी का प्रतिनिधित्व करता है, गेट बी (TCRβ int + CD69) एक tr का प्रतिनिधित्व करता हैTCR सगाई, गेट सी (TCRβ हाय CD69 +) के बाद सीधे ansitional आबादी सीधे कोशिकाओं के चयन के बाद सकारात्मक आबादी का प्रतिनिधित्व करता है, और फाटक डी (CD69 TCRβ हाय -) कोशिकाओं (चित्रा 2 डी) के एक अधिक परिपक्व आबादी का प्रतिनिधित्व करता है. एक WT माउस में, गेट ए डी पी उज्ज्वल कोशिकाओं के होते हैं, जबकि गेट बी मुख्यतः के साथ डी पी उज्ज्वल कुछ डी पी सुस्त और CD4 + CD8 लो कोशिकाओं के होते हैं. गेट सी मुख्य रूप से डी पी सुस्त, CD4 + CD8 लो और CD4SP कोशिकाओं के होते हैं, जबकि फाटक डी मुख्य रूप से CD4SP और CD8SP के होते हैं. आबादी बी और सी की अनुपस्थिति बिगड़ा सकारात्मक चयन का संकेत हो सकता है. जनसंख्या डी के अनुपात में CD4SP भीतर CD8SP परिवर्तन वंश प्रतिबद्धता में परिवर्तन का सुझाव हो सकता है. आबादी सी और डी के नुकसान सकारात्मक चयन के बाद अस्तित्व मुद्दों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं.

CD5 द्वारा TCRβ की जांच के लिए एक और रणनीति टी हैओ पूर्व और बाद पॉजिटिव चयन आबादी की पहचान. जनसंख्या मैं (TCRβ लो CD5 लो) पूर्व चयन डी पी thymocytes का प्रतिनिधित्व करता है और जनसंख्या ii (TCRβ लो CD5 int) सकारात्मक चयन (चित्रा 2E) की शुरुआत कोशिकाओं रहे हैं. ये आबादी DPbright thymocytes की मुख्य रूप से मिलकर बनता है. जनसंख्या iii (TCRβ int हाय CD5) सकारात्मक चयन के दौर से गुजर की प्रक्रिया में thymocytes का प्रतिनिधित्व करता है और डी पी सुस्त और CD4 + CD8 लो thymocytes के मुख्य रूप से मिलकर बनता है. जनसंख्या iv (TCRβ हाय CD5 hi) के बाद सकारात्मक चयन सपा thymocytes के मुख्य रूप से शामिल है. आबादी द्वितीय और तृतीय बिगड़ा पीढ़ी दोषपूर्ण सकारात्मक चयन से पता चलता है. सामान्य पूर्ववर्ती आबादी के बावजूद CD4SP के अनुपात में जनसंख्या iv भीतर CD8SP परिवर्तन वंश प्रतिबद्धता में परिवर्तन का सुझाव हो सकता है. जनसंख्या iv का अभाव कम सकारात्मक selec के बाद अस्तित्व का संकेत हो सकता हैtion. उदाहरण के लिए, TOX में - / - चूहों, दोषपूर्ण CD4SP भेदभाव iv, सी और डी की आबादी में भारी कमी करने के लिए होता है जबकि सकारात्मक चयन 12 बरकरार है. सकारात्मक चयन में यह सच दोषों डी पी मंच है, जो आबादी के बी, सी और डी 13,14 के नुकसान की ओर जाता है दौरान Bcl11b निष्क्रियता के साथ देखा जा सकता है. RasGRP1 कमी चूहों सकारात्मक चयन में पहले के एक दोष है, जनसंख्या का केवल उपस्थिति में जिसके परिणामस्वरूप एक (अप्रकाशित डेटा).

नकारात्मक चयन के रूप में छोटे प्रतिजन विशेष आबादी का विलोपन शामिल है, इस प्रक्रिया में दोष TCR ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर मनाया जाता है. HY CD4 चूहों में व्यक्त ट्रांसजेनिक हरियाणा TCR thymocytes मोनोक्लोनल एंटीबॉडी T3.70 (3B चित्रा) के साथ पकड़ा जा सकता है. हरियाणा TCR हरियाणा पुरुष विशिष्ट प्रतिजन MHC वर्ग ID ख भीतर प्रस्तुत पहचानता है. इस प्रकार, हरियाणा CD4 नर चूहों (एम) हरियाणा TCR के नकारात्मक चयन से गुजरना + डी पी thymocyte संख्या (चित्रा 3 डी) और T3.70 में एक अधिक नाटकीय कमी + CD8SP thymocyte संख्या (चित्रा -3 सी, ई). इसके विपरीत, हरियाणा CD4 महिला (एफ) चूहों सकारात्मक चयन T3.70 + CD8SP टी कोशिकाओं उत्पन्न गुज़रना पड़ता है. अपने strictest परिभाषा के अनुसार, नकारात्मक चयन परिपक्व स्वयं प्रतिक्रियाशील thymocytes की पीढ़ी से बचाता है. इस प्रकार, जबकि डी पी thymocyte संख्या में एक कमी नकारात्मक चयन का संकेत है, प्रतिजन विशेष सपा thymocytes के अभाव सबसे सही उपाय है. कुछ हरियाणा CD4 एम चूहों में T3.70 + CD8SP thymocytes इसके अलावा परीक्षा से पता चलता है कि सबसे अपरिपक्व हैं (CD24 हाय), जबकि अधिकांश हरियाणा CD4 एफ में T3.70 + CD8SP thymocytes परिपक्वता तक पहुँच चुके हैं (CD24 लो) (3F चित्रा) . यह आगे की सहायता प्रदान करता है कि मैं नकारात्मक चयन होता हैn हरियाणा CD4 एम चूहों.

TCR ट्रांसजेनिक मॉडल की एक चेतावनी है कि ट्रांसजेनिक TCR अत्यधिक thymocyte विकास भर में व्यक्त किया जाता है. एक परिणाम के रूप में, यह मुश्किल है कि आगे TCR और CD69/CD5 अभिव्यक्ति के आधार पर आबादी की पहचान के द्वारा सकारात्मक चयन विशेषताएँ. हालांकि, CD69 और CD5 अभिव्यक्ति TCR सिगनल की ताकत के साथ सहसंबंधी. WT चूहों में, सबसे डी पी thymocytes सकारात्मक या नकारात्मक चयन है, जो TCR pMHC की सगाई की आवश्यकता नहीं गुजरना है, और इस तरह CD69 या CD5 नहीं upregulate. हरियाणा CD4 एफ चूहों T3.70 + डी पी thymocytes कि सकारात्मक चयन, के रूप में WT (4A चित्रा) की तुलना में CD69 + जनसंख्या में वृद्धि के द्वारा संकेत से गुजरना की एक बड़ी आबादी है. नकारात्मक चयन सकारात्मक चयन से एक उच्च आत्मीयता TCR प्रोत्साहन शामिल है, यह हरियाणा CD4 एम चूहों में T3.70 + डी पी thymocytes CD69 के उच्च अभिव्यक्ति ने संकेत दिया है, जिसके परिणामस्वरूप एक बदलाव ओ मेंसही करने के लिए च हिस्टोग्राम शिखर. इसी तरह के रुझान CD5 अभिव्यक्ति (4B चित्रा) के साथ देखा जाता है. जब thymic चयन आनुवंशिक चालाकी से चूहों में विश्लेषण, CD69 की जांच या CD5 अभिव्यक्ति का निर्धारण कर सकते हैं कि क्या दोष TCR संकेतन या TCR उत्तेजना की एक बहाव के परिणाम के साथ है.

चित्रा 1
चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की समग्र योजना.

चित्रा 2
चित्रा 2 गैर TCR ट्रांसजेनिक चूहों में thymic चयन का विश्लेषण. (ए) गैर TCR ट्रांसजेनिक चूहों में thymic चयन का विश्लेषण करने के लिए Gating रणनीति. (बी) CD8 एक WT थाइमस की CD4 प्रोफाइल. (सी) TCRβ और CD24 अभिव्यक्ति द्वारा सपा thymocytes की परिपक्वता की जांच करना. (D) सकारात्मक चयन के चरणों से प्रतिष्ठित किया जा सकता हैCD69 TCRβ अभिव्यक्ति द्वारा CD8 और प्रत्येक सबसेट में रूपरेखा CD4 के साथ साथ. (ई) द्वारा TCRβ CD5 एक और रणनीति है कि विकास के चरणों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 हरियाणा CD4 चूहों में thymic चयन का विश्लेषण. (ए) TCR ट्रांसजेनिक चूहों में thymic चयन का विश्लेषण करने के लिए Gating रणनीति. (बी) WT में हरियाणा (T3.70 +) TCR, हरियाणा CD4 एफ और CD4 चूहों एम हरियाणा व्यक्त thymocytes की आवृत्ति. (सी) CD8 जनसंख्या T3.70 + संकेत चूहों में CD4 प्रोफाइल में से एक है. आवृत्तियों के अलावा, T3.70 + (डी) डी पी और विशेष रूप से T3.70 + CD8SP thymocytes (ई) के पूर्ण संख्या ऋणात्मक चयन के महत्वपूर्ण संकेतक हैं. (एफ) की जांचसंकेत चूहों में CD8SP thymocytes की परिपक्वता. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4 सक्रियण CD69 (A) और कुल WT और T3.70 से डी पी thymocytes + हरियाणा CD4 एफ और हरियाणा CD4 एम चूहों से डी पी thymocytes पर (बी) CD5 मार्करों की अभिव्यक्ति.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल गैर TCR ट्रांसजेनिक और TCR ट्रांसजेनिक चूहों में सकारात्मक और नकारात्मक चयन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल की सतह प्रतिजनों के धुंधला का वर्णन करता है. आणविक तंत्र के आगे के विश्लेषण के लिए, यह अक्सर intracellular धुंधला हो प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है. हम सबसे intracellular प्रोटीन और बी.डी. बायोसाइंसेज Foxp3 धुंधला किट के लिए प्रतिलेखन कारकों के लिए बी.डी. बायोसाइंसेज किट / Cytofix Cytoperm का उपयोग करें. हम आम तौर पर धुंधला हो के तुरंत बाद हमारे नमूने हासिल. हालांकि, नमूने FACS बफर में रात भर सकते हैं और 4 में 1% formaldehyde ° सी के साथ अंधेरे में संग्रहीत. पता है कि कुछ fluorochromes और एंटीबॉडी के निर्धारण के साथ संगत नहीं हो सकता.

सकारात्मक चयन के विश्लेषण के लिए, हम biotinylated विरोधी CD69 या विरोधी CD5 का उपयोग करने के लिए नकारात्मक, मध्यवर्ती, और अत्यधिक व्यक्त आबादी के बेहतर जुदाई (2 चित्रा) उपलब्ध कराने की सलाह देते हैं. के रूप में प्रतिनिधि परिणाम में वर्णित है,इस gating रणनीति वंश प्रतिबद्धता से सकारात्मक चयन में दोष भेद करने में मदद के रूप में दो अलग ऊपर का पालन की आवश्यकता हो सकती है. परिपक्व सपा thymocytes की पीढ़ी के अलावा, सकारात्मक चयन आईएल 7Rα और CCR7 की upregulation द्वारा पुष्टि की जा सकती है. हालांकि, इन मार्करों के बाद चयन डी पी सपा 15,16 thymocytes तुलना thymocytes पर कम स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं. डी पी डिब्बे के भीतर परिपक्वता चरणों के विस्तृत विश्लेषण के लिए, intracellular Zap70 अभिव्यक्ति 17 मापा जा सकता है. यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है और मैं TCRβ x CD5 साजिश (चित्रा 2E) द्वितीय के रूप में परिपक्वता मार्करों, इसी तरह की अभिव्यक्ति के साथ है कि आबादी में प्रदर्शन करने के लिए, विकास के विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं.

हरियाणा CD4 मॉडल सकारात्मक और नकारात्मक दोनों चयन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्रांसजेनिक TCR की शारीरिक अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करने के फायदे हैं. हालांकि, इन तरीकों को लागू किया जा सकता हैकुछ बातों के साथ अन्य TCR ट्रांसजेनिक मॉडल. हमेशा पसंद की ट्रांसजेनिक TCR के खिलाफ एक एंटीबॉडी के प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का अध्ययन सक्षम शामिल हैं. कुछ विश्लेषण के लिए यह ब्याज की एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में आबादी गैर विशिष्ट प्रतिजन विशेष आबादी की तुलना कर सकते हैं. अध्ययन अन्य TCR ट्रांसजेनिक मॉडल में नकारात्मक चयन आगे विचार की आवश्यकता है. जिसके दौरान नकारात्मक चयन जगह लेता है thymocyte विकास के मंच अलग TCR ट्रांसजेनिक मॉडल के बीच बदलता है. हरियाणा CD4 thymocytes डी पी चरण में pMHC संलग्न इस प्रकार हरियाणा विशिष्ट CD8SP संतान जनसंख्या का विश्लेषण, नकारात्मक चयन 10,18 (3 चित्रा) के लिए सही readout है. अगर नकारात्मक चयन शास्त्रीय हरियाणा 19 चूहों में संक्रमण के लिए डी पी DN के दौरान होता है, ब्याज की विश्लेषण या प्रतिजन विशेष डी पी thymocytes की उपस्थिति या अनुपस्थिति होगा. सर्वव्यापी हरियाणा प्रतिजन के खिलाफ चयन thymic में होता है20 प्रांतस्था. इसके विपरीत, ऊतक प्रतिबंधित प्रतिजनों के खिलाफ नकारात्मक चयन thymic 21,22 मज्जा में होता है. OT-मैं चीर Mova चूहों के रूप में चयन के इस प्रकार की पुनरावृत्ति करना OVA प्रतिजन चूहा इंसुलिन प्रमोटर, जो thymic मज्जा और अग्न्याशय 23 में ही सक्रिय है के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है. Thymic प्रांतस्था में डी पी thymocytes के सकारात्मक चयन के बाद से 1 मज्जा, परिपक्व की अनुपस्थिति (CD24 लो) OT-मैं TCR CD8SP + thymocytes OT-I चीर Mova 24 चूहों में सफल नकारात्मक चयन इंगित करता है में प्रवास के लिए आवश्यक है.

जबकि TCR ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग प्रतिजन विशेष कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी का अध्ययन करने में सक्षम होने का लाभ है, एक संभावित चेतावनी टी सेल सीमित कि ligands ट्रांसजेनिक TCR के सकारात्मक और नकारात्मक चयन मध्यस्थता कर सकते हैं के कारण विकास बदल दिया है. चीर पर्याप्त हरियाणा CD4 चूहों में, एक और चेतावनी है कि सह endoge की अभिव्यक्ति हैnous TCRα श्रृंखला हरियाणा TCR + thymocytes के एक अल्पसंख्यक पर सकारात्मक और नकारात्मक चयन मिलाना क्षमता है. इस चेतावनी हरियाणा CD4 मॉडल अद्वितीय नहीं है, बल्कि सामान्य में TCR ट्रांसजेनिक मॉडल. प्रतिनिधि हरियाणा प्रस्तुत CD4 हरियाणा चीर पर्याप्त एक पृष्ठभूमि पर CD4 चूहों से प्राप्त कर रहे हैं. हालांकि कुछ हद तक प्रकृति में और अधिक जटिल है, वहाँ सीमित अग्रदूत आवृत्ति की एक और अधिक शारीरिक सेटिंग में thymocyte चयन का अध्ययन करने के लिए कई तरीके हैं. उदाहरण के लिए, TCR ट्रांसजेनिक और WT मिश्रित अस्थि मज्जा काइमेरा प्रतिजन विशेष thymocyte अग्रदूत आवृत्ति को कम करने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, एक चूहों कि केवल हरियाणा 25 TCR Vb8 चेन या OT-मैं 26 TCR Vb5 श्रृंखला अग्रदूत आवृत्ति सीमा के रूप में एक ट्रांसजेनिक TCRβ श्रृंखला व्यक्त, का उपयोग कर सकते हैं. क्योंकि ट्रांसजेनिक TCRβ श्रृंखला विभिन्न ट्रैकिंग अंतर्जात TCRα प्रतिजन विशेष thymocytes फिर चेन के साथ रखा जाता हैpMHC tetramers का उपयोग quires. इस पद्धति का एक सीमा है कि TCR अभिव्यक्ति भी डी पी thymocytes पर कम tetramers साथ पता लगाने की अनुमति है. यह डी पी thymocytes में आणविक तंत्र है कि सकारात्मक और नकारात्मक चयन करने के लिए नेतृत्व के आगे के अध्ययन की सीमा. हाल ही में, pMHC tetramers और चुंबकीय मनका संवर्धन का एक संयोजन के लिए unmanipulated 27 चूहों में छोटे, CD4 के प्रतिजन विशेष आबादी + टी कोशिकाओं की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.

नकारात्मक चयन मुख्य रूप से आंतरिक apoptosis मार्ग के माध्यम से आत्म प्रतिक्रियाशील thymocytes की clonal विलोपन द्वारा मध्यस्थता है. Apoptotic thymocytes प्रवाह cytometry cleaved कस्पासे-3 के लिए intracellular धुंधला हो जाना का उपयोग कर के द्वारा पाया जा सकता है. बीसीएल BH3 केवल 2 परिवार के सदस्य Bim TCR 18,28 उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया में कस्पासे 3 thymocytes में क्रियान्वयन के लिए आवश्यक है. अलग TCR ट्रांसजेनिक मॉडल Bim कमी चूहों को पार करके, हमारी प्रयोगशाला में पाया गया है कि Bim नकारात्मक selec के लिए आवश्यक हैसर्वव्यापक आत्म प्रतिजनों लेकिन प्रतिजनों ऊतक प्रतिबंधित नहीं, अनेक नकारात्मक चयन 18,29 तंत्र के अस्तित्व का संकेत के खिलाफ tion. इसी तरह के दृष्टिकोण thymic नकारात्मक 30,31 चयन की एक और महत्वपूर्ण मध्यस्थ के रूप में अनाथ स्टेरॉयड रिसेप्टर Nur77 फंसा है. हरियाणा CD4 चूहों से डी पी thymocytes Transcriptional विश्लेषण विशेष रूप से सकारात्मक और नकारात्मक चयन 32 के दौरान प्रेरित जीन की एक सूची उत्पन्न किया है. इन जीनों में हेरफेर चूहों के लिए यहाँ प्रस्तुत तरीकों लागू thymic चयन के आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.

यह को परिधीय प्रतिरक्षा डिब्बे के एक विश्लेषण के साथ thymic चयन की परीक्षा का पालन करने के लिए आदर्श है. हालांकि, यह अक्सर मुश्किल होता है केंद्रीय और परिधीय विलोपन अलग. नकारात्मक चयन अंततः autoimmunity के अभाव से परिलक्षित होता है. हालांकि वे सीमाएं हैं, TCR ट्रांसजेनिक चूहों एक शक्तिशाली और व्यावहारिक तरीका हैअध्ययन शारीरिक नकारात्मक चयन. क्रॉसिंग TCR विशेष जीन की कमी चूहों ट्रांसजेनिक चूहों नकारात्मक चयन के आणविक तंत्र की जांच के लिए एक प्रभावी तरीका है. यह जागरूक होना महत्वपूर्ण है, तथापि, कि परिधीय एक जीन में दोष के कारण सूजन गैर विशिष्ट thymocyte corticosteroids और 7-9 साइटोकिन्स द्वारा मध्यस्थता विलोपन का कारण बन सकता है. ऐसे मामलों में, यहाँ प्रस्तुत रणनीति नवजात चूहों से thymi का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है सूजन की शुरुआत से पहले लागू किया है. सकारात्मक चयन, दूसरे हाथ पर, या तो TCR या गैर TCR ट्रांसजेनिक मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है, जांचकर्ताओं crossbreeding की परेशानियों की बचत. सकारात्मक और नकारात्मक चयन में शामिल अणुओं की एक बेहतर समझ और autoimmune और इम्यूनो विकारों के निदान और उपचार के लिए उपन्यास रणनीतियों के लिए नेतृत्व करेंगे.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों को अपने तकनीकी सहायता के लिए बिंग जांग धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान (एमओपी 86,595) के लिए कनाडा के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था. TAB एक CIHR नई अन्वेषक और AHFMR विद्वान है. डॉक्टरेट और एक AIHS छात्रवृत्ति पूर्णकालिक QH - एक CIHR कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. SAN एक महारानी एलिजाबेथ द्वितीय ग्रेजुएट छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है. डॉक्टरेट - AYWS एक NSERC स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HyClone Hank's balanced salt solution Thermo Scientific SH30030.02
Metal mesh screens Cedarlane CX-0080-E-01
Petri dishes (60 x 15 mm) Fisher Scientific 877221
Syringes (3 ml) BD Biosciences 309657
Conical tubes (15 ml) Sarstedt 62.554.205
Microscope Zeiss - Primo Star 415500-00XX-000
Hemocytometer Hausser Scientific 3110
96-well plate Sarstedt 82.1582.001
Multichannel pipette Fisherbrand 21-377-829
Fetal calf serum PAA A15-701
Phosphate buffered saline Fisher Scientific SH3025802
Sodium azide IT Baker Chemical Co. V015-05
FcR blocking reagent Clone 2.4G2
Anti-mouse HY TCR eBioscience XX-9930-YY* Clone T3.70
Anti-mouse CD4 eBioscience XX-0042-YY* Clone RM4-5
Anti-mouse CD8α eBioscience XX-0081-YY* Clone 53-6.7
Anti-mouse CD24 eBioscience XX-0242-YY* Clone M1/69
Anti-mouse TCRβ eBioscience XX-5961-YY* Clone H57-597
Anti-mouse CD69 Biotinylated eBioscience 13-0691-YY* Clone H1.2F3
Anti-mouse CD5 Biotinylated eBioscience 13-0051-YY* Clone 53-7.3
Streptavidin eBioscience XX-4217-YY*
Flow cytometer BD Biosciences - FACS Canto 338962
FACS tubes BD Biosciences 352052
Flow cytometry analysis software TreeStar - Flowjo FlowJo v7/9
HyClone RPMI - 1640 medium Thermo Scientific SH30027.01

*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.

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References

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Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y. W., Baldwin, T. A. Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (68), e4269, doi:10.3791/4269 (2012).

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