Summary
Мы представляем проточной цитометрии на основе метода для изучения Т-клеточного развития
Protocol
См. рисунок 1 для общей схемы экспериментальных протоколов.
1. Диссекция
- Место стерильной сито стали в 60 х 15 мм блюдо Петри. Одна единица необходима в образце ткани.
- Добавить 5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) к каждому блюду. Держите блюда на льду.
- Усыпить мышей с CO 2.
- Безопасность мыши, чтобы вскрытие поверхности, брюшной стороной вверх. Спрей мышь с 70% этанола для стерилизации и для того, чтобы мех спутанными вниз.
- Использование хирургических ножниц, начать вскрытие, сделав вентральный разрез в брюшной кожу чуть выше половых органов. Расширить разрез вверх к подбородку.
- Из средней линии, расширить разрез вниз вдоль всех конечностей. Отойдите назад дряблая кожа и пин-код его до вскрытия поверхности.
- Урожай тимуса:
- Поднимите нижний кончик грудной кости, чтобы сделать разрез.
- Избежать печени, сократить диафрагму, чтобы отсоединить грудную клетку, а затем сократить грудной клетки с каждой стороны. Вырезать грудной клетки вверх на каждой стороне, избегая легких и сердца.
- Осторожно вытяните грудную клетку обратно щипцами. Тимус является белым, двухлопастный орган, расположенный над сердцем. Использование плоских края щипцы, чтобы понять, в нижней части доли, осторожно потяните тимуса и разместить его на сито.
- Урожай селезенки:
- Селезенка является красный, доска для серфинга формы орган, расположенный в левой части брюшной полости мыши, ниже печень.
- Сделайте разрез в брюшной полости. Осторожно выньте селезенки с одной парой щипцов, используя вторую пару, чтобы дразнить от соединительной ткани. Поместите селезенки на отдельном экране сетку.
2. Сотовые подготовка
- Использование поршня от 3 шприца мл, молотьорганов в сито, пока только соединительная ткань и жир остается. Промойте сетку с HBSS от тарелки в три раза. Используйте новый поршень для каждого образца ткани.
- Другие опции для гомогенизации тканей может быть использован вместо этого метода.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра.
- Гранул клеток путем центрифугирования при 335 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют спленоцитов в 500 мкл буфера для лизиса ACK (0,15 М NH 4 Cl, 10 ммоль KHC0 3, 0,1 мМ Na 2 ЭДТА, рН 7,2) в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют тимоцитов при 20 х 10 6 клеток / мл в FACS буфере (PBS, 1% FCS, 0,02% азида натрия) и отложите на льду.
- Вернуться к спленоцитов изотоничность добавлением 5 мл HBSS. Гранул спленоцитов путем центрифугирования и ресуспендируют при 20 х 10 6 клеток / мл в буфере FACS. Если клетки должны оставаться стерильным, вы можете использовать стерильные RPMI + 10% FCS.
3.Окрашивание Клетки для проточной цитометрии
Цель этого протокола заключается в определении стратегии для анализа положительного и отрицательного отбора с использованием дикого типа (WT) и HY CD4 мышей. Для общего соображения, касающиеся проточной цитометрии опытно-конструкторских, приобретение и анализ, мы отсылаем читателя прекрасный обзор Тун и др. 11.
- Алиготе 4 х 10 6 тимоцитов в поток пробы цитометрии в каждую лунку 96-луночный планшет, а также 1 х 10 6 WT спленоцитов на компенсацию управления. При использовании трансгенных мышах, вы должны включить WT мыши в качестве контроля в эксперименте.
- Блок Fc рецепторов путем инкубации клеток с anti-CD16/32 (клон 2.4G2) в течение 10 мин на льду.
- Побочные пластины при 335 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Снимите крышку и развеять жидкости из скважин, щелкая пластины один раз, лицом вниз в раковину. Ресуспендируют каждую лунку в 200 мкл буфера FACS. Повторите мыть.
- Подготовка антител коктейли, которые перечислены ниже, используя оптимальную концентрацию каждого антитела при разведении в 200 мкл FACS буфера на лунку. Оптимальная концентрация каждого антитела определяется как самая низкая концентрация необходима, чтобы дать крупнейших разделению положительных и отрицательных населения. Если нет отрицательных населения для данного антитела, антитела изотипа должны быть включены. Общий объем в скважине может быть уменьшено (например, до 100 мкл на лунку), если это необходимо.
- WT тимуса: анти-TCRβ, анти-CD4, CD8 анти-, анти-CD69 или анти-CD5, анти-CD24
- HY CD4 тимуса: анти-HY TCR (T3.70), анти-CD4, CD8 анти-, анти-CD69 или анти-CD5, анти-CD24
Для получения лучшего разделения CD69 и CD69 вот привет населения в тимоцитов, рекомендуется биотинилированного анти-CD69 антитела первичного быть использованы, а затем вторичное пятно содержащие флуорохромом сопряженных стрептавидином. Мы ŭсебе ту же стратегию для CD5 окрашивания.
- Инкубируйте клеток с 200 мкл антител коктейль в буфер FACS в течение 30 минут на льду в темноте.
- Одновременно с антителом окрашивания коктейль, пятно каждый компенсацию управления с одной флуорохромом-конъюгированных антител. В идеале, компенсация окрашивания включает те же антитела, используемые в смесь антител. Тем не менее, окрашивание для каждого отдельного антигена не может быть возможным для больших экспериментов, когда многие антигенов в настоящее время анализируют. Таким образом, окрашивание или для анти-CD4 или анти-CD8 рекомендуется из-за высокой экспрессии этих антигенов, или использование компенсации бисера. Пятно в буфере FACS в течение 30 минут на льду в темноте. Оставьте одну компенсацию контроля незапятнанным.
- Вымойте клетки дважды с буфером FACS.
- Ресуспендируют клеток в FACS буфера и передача FACS труб.
- Получить образцы на проточной цитометрии. Включая приобретение FSC-и FSC-Зllow для дублета дискриминации.
4. Анализ данных проточной цитометрии - Non-TCR трансгенных мышей
Мы используем FlowJo для анализа потока цитометрии данных. См. рисунок 2А для стробирования стратегия для не-TCR трансгенных мышей.
- Использование FSC-на SSC, электронным затвором на «лимфоцитов» населения.
- В "лимфоцитов" населения, использование FSC-ЛПС-W в электронном ворота FSC-W население вот, чтобы исключить ячейки дублетов и aggregrates. Это "синглетно" ворот.
- Использование событий в «синглетных» ворота, участок CD8 на CD4. Ничья ворота для DN, DP скучно, DP яркие, CD4 + CD8 вот, CD4SP и CD8SP населения как показано на рисунке 2B.
- Под CD4SP и CD8SP ворота, создать TCRβ по CD24 участков. Используйте инструмент квадрант стробирования сделать ворота, как показано на рисунке 2C.
- Создать пеW сюжет из "синглетно" ворот: TCRβ по CD69. Ничья ворот A, B, C, D, как показано на рисунке 2D.
- Создайте еще один сюжет из "синглетно" ворот: TCRβ по CD5. Ничья ворота I, II, III, IV, как показано на рисунке 2E. Это еще одна стратегия для изучения положительного отбора.
- Применить DN, DP скучно, DP яркие, CD4 INT, CD4SP и CD8SP ворота из-под «синглетных» к воротам I, II, III, IV, A, B, C, D (рис. 2Д, Е).
- Подсчитайте количество клеток в определенное подмножество путем умножения органа клеточности на частоту каждого последующего ворот, пока не достигнете целевых групп населения. Например, число TCRβ привет CD69-CD8SP тимоцитов будет определяться тимуса клетками х% TCR BHI CD69-(фракция Д) х% CD8SP.
- Подсчет уже учитывает живых и мертвых клеток, поэтому не включать "lymphocyte "воротами в своих расчетах.
5. Анализ данных проточной цитометрии - TCR трансгенных мышей
См. Рисунок 3A для стробирования стратегии TCR трансгенных мышей.
- Выполните шаги 4.1 и 4.2, как и в предыдущем разделе.
- Под "синглетно" ворот, создать T3.70 по SSC сюжет и ворота на T3.70 + популяции клеток для анализа антиген-специфические Т-клетки (рис. 3В). В некоторых случаях, это может быть интересно сравнить это население не-антиген специфический (T3.70-) населения Т-клеток.
- В T3.70 + населением, ничья DN, DP, CD4SP и CD8SP ворота (рис. 3).
- Для WT контрольные образцы, сделать эти ворота под "синглетно" ворот или создать T3.70 ворота, как там будет очень мало T3.70 + клеток.
- Под воротами CD8SP, создатьT3.70 по CD24 сюжет. Используйте инструмент квадрант стробирования разделить клеток в четырех популяций (рис. 3F).
- Создание наложения гистограммы изображающие CD69 выражение в отделении ДП WT мышей и T3.70 + DP отсек HY CD4 мыши (рис. 4а). Повторите для изучения CD5 выражении (рис. 4В).
- Рассчитать абсолютное количество клеток в каждом подмножестве интерес как в 4.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В физиологических TCR модели трансгенных мышей дикого типа и, положительный отбор начинается с DP яркий этап перед переходом в DP скучным этапом после встречи антигена. DP скучно тимоцитов затем ввести переходный CD4 + CD8 вот этапе, прежде чем стать CD4SP или CD8SP тимоцитов (рис. 2В). Пожилые тимоцитов SP характеризуются высокой экспрессией TCR и потеря CD24 (рис. 2С). В то время как CD8 CD4 по профилю можно выявить дефекты в позитивной селекции, рассматривая TCRβ по CD69 и CD5 может обеспечить дальнейшее понимание, где находится дефект. Оба CD69 и CD5 которые усиливает свою активность после стимуляции TCR, с сильными взаимодействиями вождения высшее выражение этих маркеров.
На TCRβ по CD69 сюжет, ворота (TCRβ вот CD69-) представляет собой население предварительного отбора тимоциты DP, ворота B (TCRβ Int CD69 +) представляет собой TRansitional населением непосредственно после участия TCR, ворота C (TCRβ привет CD69 +) представляет популяцию клеток непосредственно после положительного отбора, и ворота D (TCRβ привет CD69 -) представляет собой более зрелые популяции клеток (рис. 2D). В мышей WT, ворот состоит из DP ярких клеток, в то время как ворота B в основном состоит из DP яркий с некоторыми DP скучно и CD4 + CD8 вот клеток. Gate C в основном состоит из DP скучно, CD4 + CD8 вот и CD4SP клеток, тогда как ворота D в основном состоит из CD4SP и CD8SP. Отсутствие популяции B и C может указывать на нарушение позитивной селекции. Изменения в соотношении CD4SP в CD8SP в течение население D может предложить изменения в коммитирование. Потери населения C и D может отражать вопросы выживания после положительного отбора.
Экспертиза TCRβ по CD5 другая стратегия тØ выявление пред-и пост-положительных население выбор. Население я (TCRβ CD5 вот вот) представляет собой предварительный отбор DP тимоцитов и населения II (TCRβ вот CD5 Int) являются клетками начала положительного отбора (рис. 2E). Эти популяции состоят в основном из DPbright тимоцитов. Население III (TCRβ Int CD5 привет) представляет тимоцитов в процессе прохождения позитивной селекции и состоят в основном из DP скучно и CD4 + CD8 вот тимоцитов. Население IV (TCRβ привет привет CD5) состоит в основном из пост-положительных тимоцитов выбор SP. Нарушение поколения популяции II и III предлагает дефектные положительного отбора. Изменения в соотношении CD4SP в CD8SP населения в IV, несмотря на нормальный предыдущих населения может предложить изменения в коммитирование. Отсутствие население IV может указывать на снижение выживаемости после положительного отборания. Например, в TOX - / - мышей, дефектных CD4SP дифференциация приводит к резкому сокращению популяции IV, C и D в то время как положительные выбор остается неизменной 12. Правда дефектов в позитивной селекции можно увидеть Bcl11b инактивации на этапе DP, что приводит к потере населением B, C и D 13,14. RasGRP1-дефицитных мышей ранее дефект положительного отбора, в результате наличия только населением (неопубликованные данные).
В качестве отрицательного отбора включает в себя удаление небольшой антиген-специфической популяции, дефекты в этот процесс лучше всего наблюдать с помощью TCR трансгенных мышей. В HY CD4 мышей, тимоциты выражения трансгенных HY TCR могут быть обнаружены с помощью моноклональных антител T3.70 (рис. 3В). HY TCR признается мужчина конкретных HY антиген представлен в MHC класса ID б. Таким образом, HY CD4 мужчины (M) мышей подвергаются негативной селекции HY TCR
Одно предостережение ТКР модели трансгенных том, что трансгенные TCR выражается весьма протяжении тимоцитов развития. В результате, трудно охарактеризовать дальнейшее положительное выбор выявлению групп населения, основанных на TCR и CD69/CD5 выражение. Тем не менее, CD69 и CD5 выражение у коррелирует с силой TCR сигнализации. В мышей дикого типа, большинство DP тимоцитов не претерпевают положительный или отрицательный отбор, который требует TCR участие ПКИКЖ, и таким образом не апрегулируются CD69 и CD5. HY мышей CD4 F имеют большой популяции T3.70 + тимоциты DP, которые проходят положительного отбора, о чем свидетельствует увеличение CD69 + населения по сравнению с WT (рис. 4а). Отрицательный отбор включает в себя более высокое сродство TCR стимулом, чем положительного отбора, на это указывает высшее выражение CD69 на T3.70 + тимоциты DP в HY CD4 M мышах, в результате сдвига оF гистограммы пик справа. Похожие тенденции наблюдаются и с CD5 выражении (рис. 4В). При анализе тимуса отбора в генетически модифицированных мышах, изучая CD69 и CD5 выражение может определить, является ли дефект лежит TCR сигнализации или вниз по течению результат стимуляции TCR.
Рисунок 1. Общая схема экспериментального протокола.
Рисунок 2. Анализ тимуса выбор в не-TCR трансгенных мышей. (A) Память стратегии для анализа тимуса выбор в не-TCR трансгенных мышей. (B) CD8 на CD4 профиль WT тимуса. (C) Изучение зрелости SP тимоцитов по TCRβ и CD24 выражение. (D) Этапы позитивной селекции можно отличить поCD69 на TCRβ выражение, наряду с CD8 и CD4 профилирования в каждом подмножестве. (E) TCRβ по CD5 другая стратегия, которая может быть использована для выделения стадий развития. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Анализ тимуса выбор в HY CD4 мышей. (A) Память стратегии для анализа тимуса выбор в TCR трансгенных мышей. (В) частотой тимоцитов выражения HY TCR (T3.70 +) в WT, HY CD4 F и M HY CD4 мышей. (C) по CD8 CD4 профили T3.70 + населения в указанных мышей. В дополнение к частотам, абсолютное число T3.70 + DP (D) и, особенно, T3.70 + CD8SP (E) тимоциты являются важными показателями отрицательного отбора. (F) Изучениезрелости CD8SP тимоцитов в указанном мышами. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 4. Экспрессия маркеров активации CD69 (А) и CD5 (B) на общую тимоциты DP от WT и T3.70 + DP тимоцитов от HY CD4 F и M HY CD4 мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь может быть использован для изучения положительного и отрицательного отбора в не-TCR трансгенных и TCR трансгенных мышей. Этот протокол описывает окрашивания поверхностных антигенов. Для дальнейшего анализа молекулярных механизмов, часто бывает необходимо выполнить внутриклеточного окрашивания. Мы используем BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit для большинства внутриклеточных белков и Foxp3 BD Biosciences Окрашивание Kit для транскрипционных факторов. Мы обычно приобретают наши образцы сразу после окрашивания. Тем не менее, образцы могут храниться в течение ночи в буфер FACS с 1% формальдегида при 4 ° С в темноте. Знайте, что некоторые флуорохромы и антитела могут быть не совместимы с фиксацией.
Для анализа положительного отбора, мы рекомендуем использовать биотинилированного анти-CD69 или анти-CD5, чтобы обеспечить лучшее разделение отрицательного, промежуточной и высокой выразив населения (рис. 2). Как описано в Представитель Результаты,это стробирование стратегия поможет отличить дефекты в положительном выбор из коммитирование, как два могут потребоваться различные наблюдения. В дополнение к поколению зрелых тимоцитов SP, положительный выбор может быть подтверждено регуляции IL-7Rα и CCR7. Тем не менее, эти маркеры выражается в низком уровне на пост-выбор тимоциты DP по сравнению с SP тимоцитов 15,16. Для подробного анализа стадий созревания внутри отсека DP, внутриклеточные Zap70 выражение может быть измерено 17. Это может быть особенно полезно в демонстрации того, что население с аналогичным выражением созревания маркеров, таких как I и II на TCRβ х CD5 участка (рис. 2Е), представляющих различные стадии развития.
Модель HY CD4 имеет преимущества представляющих как положительные, так и отрицательные выбор, а также физиологическое выражение трансгенными TCR. Однако, эти методы могут быть применены кдругие TCR трансгенных моделей с определенными соображениями. Всегда включайте антитела против трансгенных TCR выбора, чтобы включить изучение антиген-специфические Т-клетки. Для некоторых анализов, это может быть интересно сравнить антиген-специфические населения к неспецифическим населения в качестве внутреннего контроля. Изучение негативного отбора в других моделях TCR трансгенных требует дальнейшего изучения. Стадии развития тимоцитов в течение которого отрицательный отбор происходит варьируется между различными TCR трансгенных моделей. HY тимоцитов CD4 заниматься ПКИКЖ на стадии DP, таким образом, анализ HY-специфической популяции потомства CD8SP является правильное считывание для отрицательного отбора 10,18 (рис. 3). Если отрицательный отбор происходит в течение DN перехода DP как и в классической мыши HY 19, анализ процентных бы наличие или отсутствие антиген-специфические тимоциты DP. Выбор против вездесущего HY антиген происходит в вилочковойкоры 20. В отличие от негативного отбора на ткани ограниченного антигенов происходит в вилочковой железы 21,22 мозга. OT-я RIP-Мова мышей повторять этот тип выбора, как Ova антиген экспрессируется под контролем промотора инсулина крысы, которая активна только в мозговом веществе тимуса, поджелудочной железы 23. С позитивной селекции тимоцитов DP в коре тимуса Сначала необходимо для миграции в мозге, отсутствие зрелых (CD24 LO) OT-я TCR + CD8SP тимоцитов указывает на успешное негативного отбора в OT-я Rip-Мова мышей 24.
При использовании TCR трансгенных мышей, имеет то преимущество, что возможность изучать большие популяции антиген-специфические клетки, потенциально оговоркой изменяется Т-клеточного развития в связи с ограниченным лигандов, которые могут опосредовать позитивной и негативной селекции трансгенных TCR. В RAG-достаточным HY CD4 мышей, другое предостережение, что коэкспрессией endogeNous TCRα цепи имеет потенциал, чтобы модулировать позитивной и негативной селекции на меньшинство HY TCR + тимоцитов. Эта оговорка не является уникальным для модели HY CD4, а TCR трансгенной модели в целом. Представитель CD4 HY представлены выводятся из HY CD4 мышей на Rag-достаточный фон. Несмотря на несколько более сложный характер, есть много способов для изучения тимоцитов выбор в более физиологическое установка ограниченной частоте предшественника. Например, TCR трансгенных и WT смешанных химеры костный мозг может быть создан для уменьшения антиген-специфические тимоцитов частоты предшественника. Кроме того, можно использовать мышей, которые выражают только трансгенные цепи TCRβ, таких как VB8 цепи TCR HY 25 или VB5 цепи OT-я TCR 26 до ограничивает частоту предшественника. Потому что трансгенные цепи TCRβ в паре с различными эндогенными TCRα сети, отслеживание антиген-специфические повторного тимоцитовтребует использования ПКИКЖ тетрамеров. Ограничение этого метода является то, что TCR выражение слишком низко на тимоциты DP, чтобы обнаружить с тетрамеров. Это ограничивает дальнейшее изучение молекулярных механизмов в тимоциты DP, которые приводят к позитивной и негативной селекции. Совсем недавно, сочетание ПКИКЖ тетрамеров и магнитного обогащения шарик был использован для перечисления небольших, антиген-специфической популяции CD4 + Т-клеток у мышей unmanipulated 27.
Отрицательный отбор в первую очередь опосредовано клонального удаления самореактивных тимоцитов через внутренний путь апоптоза. Апоптоза тимоцитов могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии с использованием внутриклеточного окрашивания на дрова каспазы-3. BH3 только Bcl-2 члена семьи Бим имеет важное значение для активации каспазы-3 в тимоцитов в ответ на стимуляцию TCR 18,28. Путем скрещивания Бим-дефицитных мышей различных TCR трансгенных моделей, в нашей лаборатории показали, что Бим необходимо для отрицательного отборания против повсеместного само-антигенов, но не ткань ограниченной антигенов, указывающие на существование нескольких механизмов отрицательного отбора 18,29. Аналогичные подходы были замешаны сирот стероидных рецепторов Nur77 как еще один ключевой посредник тимуса негативный отбор 30,31. Транскрипции анализ тимоциты DP от HY CD4 мышей вызвало список генов, индуцированных во время позитивной и негативной селекции 32. Применение методов, представленных здесь, чтобы манипулировать мышей в эти гены могут дать представление о молекулярных механизмах тимуса выбор.
Это идеальное место, чтобы следить за рассмотрение тимуса выделение анализ периферической иммунной отсека. Однако, часто бывает трудно отделить центральной и периферической удаления. Отрицательный отбор в конечном счете, отражает отсутствие аутоиммунных заболеваний. Хотя они имеют ограничения, TCR трансгенных мышей являются мощным и практичным способомизучение физиологических отрицательного отбора. Пересечение TCR трансгенных мышей мышей, дефицитных в частности генов является эффективным способом исследовать молекулярные механизмы отрицательного отбора. Важно иметь в виду, однако, что воспаление периферических из-за генетического дефекта может вызвать неспецифические тимоцитов удаления опосредованные кортикостероидами и цитокинов 7-9. В таких случаях, стратегии, представленные здесь может быть применен к анализу тимуса от новорожденных мышей до начала воспаления. Положительный отбор, с другой стороны, могут быть изучены в любом TCR-или не-TCR трансгенных моделей, экономя следователи беды скрещивания. Лучшего понимания молекул, участвующих в позитивной и негативной селекции приведет к новым стратегиям для диагностики и лечения аутоиммунных и иммунодефицитных состояниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Bing Zhang за техническую помощь. Эта работа финансировалась Канадский институт исследований в области здравоохранения (MOP-86595). TAB является следователь CIHR новые и AHFMR Scholar. QH поддерживается CIHR Канаде Высшее Стипендия - докторских и AIHS Полный рабочий день студенчества. SAN при поддержке королевы Елизаветы II Высшее стипендии. AYWS поддерживается NSERC последипломного Стипендия - докторантуры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
